Влияние нанопрепаратов на активность протеаз Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА

УДК 663.44

Влияние нанопрепаратов на активность протеаз

Д. В. Карпенко,

д-р техн. наук, доцент;

B. В. Житков, студент;

C. А. Карязин,

студент

Московский государственный университет пищевых производств

В последнее десятилетие, как изучение, так и применение препаратов наночастиц — это один из ведущих мировых трендов. Компоненты наноразмера применяются для эффективного решения широкого круга технологических задач для выпуска разнообразной продукции во многих отраслях промышленности: пищевых продуктов и средств для их упаковки, спорттоваров, одежды, косметики, 1Т-устройств, лаков, красок, а также продукции военного назначения [1]. Следствие этого — повышение содержания на-ночастиц в окружающей среде, прежде всего в почвах, грунтовых и поверхностных водах. Отличительная характеристика наночастиц — исключительно высокая проникающая способность. В силу этого может сложиться ситуация, когда в составе производственного сырья наноча-стицы различных типов будут во всё больших количествах поступать в технологические циклы различных, в том числе, пищевых производств. Вероятно, концентрации наночастиц в технологических средах будут низкими, однако их присутствие может оказывать разные, и негативные, воздействия на производственные процессы, особенно базирующиеся на использовании биологических объектов и ферментов. Это предположение базируется как на информации о токсичности различных наноматери-алов, содержащейся в целом ряде источников [2-5], так и на результатах исследований, проведенных ранее на кафедре «Технологии бродильных производств и виноделие» ФГБОУ ВПО «МГУПП» [6, 7]. Проведенные

исследования показали, что даже малые концентрации наночастиц серебра и, в меньшей степени, других металлов, оказывают выраженное отрицательное воздействие на способность прорастания пивоваренного ячменя, развитие дрожжевых популяций на стадии главного брожения, амилолитическую активность микробных ферментных препаратов и, как следствие, на эффективность процессов, протекающих при приготовлении заторов в пивоваренных производствах. В частности, на примере препарата наноцинка было установлено, что один и тот же препарат, в зависимости от концентрации в реакционной среде, приводит как к снижению, так и к повышению активности протеаз [8]. Это, по нашему мнению, сделало целесообразным изучение влияния на активность технологически важных ферментов солода и ферментных препаратов как можно более широкого перечня наночастиц и наноматериалов. При выявлении выраженного негативного воздействия может возникнуть необходимость в оптимизации существующих [9] или разработке новых способов устранения такового.

В нашей работе изучали влияние нанопрепаратов диоксида титана и углеродных трубок на протеоли-тическую активность ферментного препарата «Нейтраза 0,8 Л» (№и-trase 0.8 L), который может использоваться в пивоваренном и других пищевых производствах. Причинами такого выбора были следующие: • различные нанопрепараты диоксида титана и углеродных трубок используются или предложены

ПИВО и НАПИТКИ

4 • 2016

Г120 -

60 -

40 -

0,1 0,25 0,5 0,1 2 5

Содержание наночастиц диоксида титана, мг/см3

Опыт Контроль

т120 -

60 -

40 -

0,1 0,25 0,5 0,1 2

Содержание углеродных нанотрубок, мг/см3

Опыт Контроль

Рис. 1. Влияние нанопрепарата ТО2 на активность протеолитических ферментов (изменение прироста концентрации аминного азота)

Рис. 2. Влияние препарата углеродных нанотрубок на активность протеолитических ферментов (изменение прироста концентрации аминного азота)

для применения в производстве продукции массового потребления, что повышает вероятность их присутствия в окружающей среде и попадания в технологические среды пивоварения;

• в исследованиях, проводившихся ранее, использовали только на-нопрепараты металлов, поэтому представлялось интересным рассмотреть воздействие на те же объекты нанопрепарата иной природы, а именно углеродных трубок;

• в исследованиях, проводившихся на нашей кафедре параллельно с описываемыми, определяли воздействие тех же нанопрепара-тов на другие биокатализаторы, поэтому представлялось целесообразным сопоставить их влияние на разные объекты.

Влияние нанопрепаратов оценивали, определяя активность про-теолитических ферментов по методу Вильштеттера и Вальдшмидт-Лейтца в модификации [10], за исключением того, что ферментативную реакцию проводили в течение 60 мин, а не 3 ч, как указано в методе. В силу этого расчет активности не производили, а выражали результаты в количестве аминного азота (АА), образовавшегося в ходе ферментативной реакции, то есть, оценивали их по приросту концентрации низкомолекулярных азотистых соединений, образовавшихся в результате действия протеолитиче-ских ферментов в определенных условиях. Для этого в опытном и контрольном вариантах определяли концентрации аминного азота в модельной

среде, представлявшей собой 5%-ный раствор желатина в дистиллированной воде, до начала и по окончании ферментативной реакции. Контрольный вариант — это смесь субстрата и раствора ферментного препарата. В опытный образец, помимо вышеуказанных компонентов, вносили навеску нанопрепарата так, чтобы получить требуемое содержание последнего в реакционной среде. В серии экспериментов содержание соответствующего нанопрепарата варьировали в диапазоне от 0,1 до 5,0 мг/см3.

Для удобства сопоставления результатов всей серии экспериментов их выражали, принимая прирост концентрации аминного азота в контрольном варианте за 100%, а его величину в опытном варианте — в процентах по отношению к этой величине. Полученные данные представлены на рис. 1 и 2.

Анализируя приведенные на рисунках данные, можно заключить, что присутствие в реакционной среде как нанопрепарата диоксида титана, так и углеродных нанотрубок существенно влияет на активность целевых ферментов препарата протеолитического типа действия, причем это влияние может быть как положительным, так и отрицательным, в зависимости от содержания соответствующего на-нопрепарата. И в том, и в другом случае при содержании нанопрепарата 1 мг/см3 и выше активность протеаз снижалась по сравнению с контролем на 20-30%. При этом, в условиях эксперимента углеродные нанотруб-ки имели более выраженный негатив-

ный эффект, вызывая снижение про-теолитической активности уже при содержании наночастиц 0,25 мг/см3, и в целом более выраженно ингибиро-вали протеазы.

В то же время, оба изучаемых нанопрепарата, присутствуя в реакционной среде в определенных количествах (0,25 мг/см3 для ТЮ2 и 0,1 мг/см3 для углеродных нано-трубок), обеспечивали прирост контролируемой ферментативной активности на 25-30% по сравнению с контролем. Это позволяет предположить, что использованные в наших исследованиях нанопрепараты оказывают сложное воздействие, вероятно, на пространственную структуру белковых молекул биокатализаторов, улучшая или ухудшая ее, а не служат прямыми ингибиторами про-теолитических ферментов.

Для проверки вышеприведенных экспериментальных данных и сделанных на их основании выводов были проведены серии экспериментов, в которых нанопрепараты вводили в реакционные среды опытных вариантов в количествах, при которых ранее наблюдали наиболее выраженный прирост и значимое снижение протеоли-тической активности ферментного препарата. Для нанопрепарата ТЮ2 содержание составило 0,25 мг/см3 и 1,0 мг/см3, а для углеродных нанотрубок 0,1 мг/см3 и 1,0 мг/см3, соответственно. Варьировали продолжительность ферментативной реакции, иначе говоря, продолжительность контакта каждого из нанопрепаратов с компонентами реакционной среды.

140 -г

140 -г

о 100 - -

о 100 -

5 80 - -

5 80 -

20 - -

20 -

0

0

5

4 • 2016

ПИВО и НАПИТКИ 47

Р160 -

! 140 -

I 100 -

£ 80 =1 60 I 40

ш

| 20

ш

0

20 40

Содержание наночастиц диоксида титана,

Опыт Контроль

60 мг/см3

60 -

40 -

¥ 20 -

20 40 60

Содержание наночастиц диоксида титана, мг/см3

Опыт Контроль

180 -г

120 -Г

100 -

, 120 -

- 80 -

0

Рис. 3. Влияние продолжительности ферментативной реакции в присутствии нанопрепарата ТО., (0,25 мг/см3) на активность протеолитических ферментов (изменение прироста концентрации аминного азота)

Рис. 4. Влияние продолжительности ферментативной реакции в присутствии нанопрепарата ТО2 (1,0 мг/см3) на активность протеолитических ферментов (изменение прироста концентрации аминного азота)

115 т

: 110 "

ш 90-

85

20 40 60

Содержание углеродных нанотрубок, мг/см3

Опыт Контроль

120 -г

: 100 -

¥ 20 -

20 40 60

Содержание углеродных нанотрубок, мг/см3

Опыт Контроль

Рис. 5. Влияние продолжительности ферментативной реакции в присутствии углеродных нанотрубок (0,1 мг/см3) на активность протеолитических ферментов (изменение прироста концентрации аминного азота)

Рис. 5. Влияние продолжительности ферментативной реакции в присутствии углеродных нанотрубок (1,0 мг/см3) на активность протеолитических ферментов (изменение прироста концентрации аминного азота)

, 105 -

80 -

100 -

60 -

95 -

40 -

0

Остальные условия экспериментов и способ представления (см. рис. 3-6) экспериментальных данных были такими же, как в первых сериях экспериментов.

С нашей точки зрения, данные представленные на рис. 3-6, хорошо согласуются с приведенными ранее и подтверждают сделанные выводы о характере влияния исследуемых на-нопрепаратов в целом и их конкретных концентраций в частности.

При этом интересно отметить, что динамика влияния на накопление аминного азота у двух использованных нанопрепаратов диаметрально разные: степень воздействия, как положительного, так и отрицательного, наночастиц титана снижается по ме-

ре увеличения продолжительности ферментативной реакции, тогда как влияние углеродных нанотрубок — и позитивное, и негативное — усиливается с течением времени. Возможная причина этого — различия в объектах влияния разных нанопре-паратов в составе среды протекания ферментативной реакции.

В целом можно заключить, что предположения о значимом влиянии нанопрепаратов на ферментативную, в частности, протеолитическую активность подтверждены экспериментально. При небольшом содержании в реакционной среде наночастицы не изменяют ход ферментативной реакции или даже ускоряют ее. Однако увеличение их содержания приводит к су-

щественному снижению активности протеаз ферментного препарата микробного происхождения, по крайней мере, в модельной реакционной среде.

Для более точной оценки характера влияния изучаемых нанопрепа-ратов на активность ферментов как ферментных препаратов, так и ячменного солода, в условиях, близких к производственным, планируется проведение серии лабораторных затираний и анализ их результатов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Нанотехнологии. Наноматериалы. Нано-системная техника. Мировые достижения — 2008 год. / Сборник под ред. д-ра техн. наук проф. Мальцева П. П. — М.: Техносфера, 2008. — 432 с.

48 ПИВО и НАПИТКИ 4 • 2016

2. Дугин, Г. С. Нанотехнология и ее возможное негативное влияние на окружающую среду / Г. С. Дугин // Проблемы безопасности и чрезвычайных ситуаций. — 2009. — № 5. — С. 33-37.

3. Гмошинский, И. В. Современные данные о токсичности наноматериалов, используемых в пищевой промышленности / И. В. Гмошинский, В. В. Смирнова, А. А. Шумакова, О. Н. Тананова, С. А. Хо-тимченко // Сборник материалов Инновационного форума пищевых технологий, посвященный юбилею МГУПП. — М.: ИК МГУПП, 2010. — С. 17-19.

4. Khare, P. Adverse Effects of TiO2 and ZnO Nanoparticles in Soil Nematode, Caenorhab-ditis elegans / P. Khare, M. Sonane, R. Pan-

dey., S. Ali, K. Gupta K, A. Satish // Journal of Biomedical Nanotechnology. — January,

2011. — Vol. 7. — № 1. — P. 116-117.

5. Aruoja, V. Toxicity of nanoparticles of CuO, ZnO and TiO2 to microalgae Pseudokirch-neriella subcapitata / V. Aruoja, H. C. Du-bourguier, K. Kasemets, A. Kahru // Science of the Total Environment. — 2009. — Vol. 407. — №. 4. — P. 1461-1468.

6. Карпенко, Д. В. Влияние наночастиц серебра на прорастание ячменя и качество свежепроросшего солода / Д. В. Карпенко, Ю. А. Уваров // Пиво и напитки. —

2012. — № 3. — С. 32-33.

7. Карпенко, Д. В. Влияние наночастиц металлов на сбраживание пивного сусла / Д. В. Карпенко, Ю. А. Уваров, А. И. Ма-

ринин, В. В. Олишевский // Пиво и напитки. — 2012 — № 1. — С. 16-17.

8. Карпенко, Д. В. Влияние наноцинка на активность протеолитических ферментов / Д. В. Карпенко, У. В. Вартанова, Н. О. Борисова, М. А. Широкова // Пиво и напитки. — 2015. — № 5. — С. 16-19.

9. Крупичева, А. Н. Регенерация дрожжевого биосорбента / А. Н. Крупичева, Д. В. Карпенко, Н. Б. Вихлянцева // Пиво и напитки. — 2006. — № 4. — С. 22-23.

10. Грачева, И. М. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов.: учебное пособие для вузов / И. М. Грачева, Ю. П. Грачев, М. С. Мосичев и др. — М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. — 240 с. &

Влияние нанопрепаратов на активность протеаз

Ключевые слова

нанопрепарат диоксида титана; нанотехнологии; препарат углеродных нанотрубок; протеолитическая активность; ферменты.

Реферат

Применение нанотехнологий в промышленном масштабе создает условия для миграции наночастиц в окружающую среду, следствием чего может быть повышение содержания последних в основном сырье и полупродуктах пищевых, в частности, бродильных производств. При этом целый ряд литературных источников сообщает о негативном воздействии наночастиц наноматериалов на биологические объекты различной природы и их производные. Вследствие этого актуальна задача по изучению влияния нанопрепаратов, в частности, диоксида титана и углеродных трубок на активность ферментов, действующих на различных стадиях пивоваренного производства. В качестве таковых в нашей работе использовали целевые ферменты микробного ферментного препарата «Нейтраза 0,8 Л» (№и^е 0.8 L) протеолитического типа действия. Влияние исследуемых нанопрепаратов оценивали по изменению прироста низкомолекулярных азотистых веществ, образовавшихся под действием ферментного препарата за 60 мин гидролиза субстрата — 5%-ного раствора желатина, сопоставляя значения контролируемого показателя в опытных и контрольных, не содержавших наночастиц, образцах. Установлено, что характер влияния наночастиц диоксида титана и углеродных нанотрубок на активность протеаз ферментного препарата «Нейтраза 0,8 Л» существенно зависит от содержания нанопрепарата в реакционной среде: небольшие количества наночастиц не изменяют протеолитическую активность или даже повышают ее на 25-30% по сравнению с таковой в контрольном варианте. Однако при повышении содержания выше определенного значения наблюдалось снижение активности протеаз на 30-35%; «пороговое» значение и степень снижения зависели от нанопрепарата, внесенного в реакционную среду. По мнению авторов полученные результаты делают целесообразным продолжение исследований влияния наночастиц на технологические процессы пивоваренного производства.

Авторы

Карпенко Дмитрий Валерьевич, д-р техн. наук, доцент;

Житков Владимир Владимирович, студент;

Карязин Святослав Александрович, студент

Московский государственный университет пищевых производств,

125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11,

[email protected], [email protected], [email protected]

The Influence of Nanopreparations on the Activity of Proteases

Key words

nanopreparation of the titan dioxide; nanotechnology; preparation of carbon nanotubes; proteolytic activity; enzymes.

Abstract

Application of nanotechnologies in industrial scale provides conditions for migration of nanoparticles to environment; after-effect can be increasing content of mentioned nanoparticles in food fermentation industry, including main raw materials and semi-products. At that, there are some sources informs about adverse effect of nanoparticles and nanomaterials on biological subjects with different genesis and its derivatives. As a result, the study of the influence of the titan dioxide and carbon nanotubes nanopreparations on ferments of beer brewing processes is an actual goal. In our researches, we used such proteolytic microbial enzyme preparation as Neutrase 0.8 L. Influence of nanopreparations was estimated by the changing of low-molecular nitrogenous matter amount, which were produced by the action of ferment in 60 min hydrolysis of 5% gelatin substrate. Data of the experimental and control (without nanopreparations) samples were compared. It was found, that effect level of the titan dioxide and carbon nanotubes nanopreparations depends on its concentrations in the medium: small amounts don't change protolithic activity, or even increase it on 25-30%, in comparison with control samples. But, increasing of nanopreparations amounts causes reduction of protolithic activity on 30-35%, the «threshold» amount and level of decreasing depend of kind of nanopreparations in medium. According to the author's opinion, these results stimulate to continue researches of nanopreparation influence on beer brewing processes.

Authors

Karpenko Dmitrij Valer'evich, Doctor of Technical Sciences, Associate Professor;

Zhitkov Vladimir Vladimirovich, Student;

Karjazin Svjatoslav Aleksandrovich, Student

Moscow State University of Food Productions,

11 Volokolamskoye shosse, Moscow, 125080, Russian,

[email protected], [email protected], [email protected]

4 • 2016 ПИВО и НАПИТКИ 49