CC BY
6
УДК 577.32
Белицкая Е.Д., Бордычевская Е.С., Демина П.А., Генералова А.Н., Олейников В.А., Залыгин А.В.
ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА НА ИНТЕНСИВНОСТЬ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ РИБОФЛАВИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ
Белицкая Екатерина Дмитриевна - студент 4-го года обучения кафедры наноматериалов и нанотехнологий; belitskayakatya@yandex.ru;
ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева», Россия, Москва, 125047, Миусская площадь, дом 9.
Бордычевская Екатерина Сергеевна - студент 4-го года обучения кафедры трансляционной медицины, ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ», Россия, Москва, 115409, Каширское шоссе, дом 31.
Демина Полина Андреевна - аспирант, младший научный сотрудник лаборатории полимеров для биологии. Генералова Анна Никлаевна - доктор химических наук, руководитель лаборатории полимеров для биологии; Олейников Владимир Александрович - доктор физико-математических наук, заведующий лаборатории молекулярной биофизики;
Залыгин Антон Владленович - кандидат физико-математических наук, младший сотрудник лаборатории молекулярной биофизики.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН», Россия, Москва, 117997, ул. Миклухо-Маклая 16/10.
В статье рассмотрены взаимодействия флавинов (рибофлавин, флавинмононуклеотид, люмихром) с нитратом серебра и с наночастицами серебра с образованием нанобиокомплексов. Исследование присоединения ионов серебра и наночастиц серебра и изменения свойств флавинов было проведено методом флуоресцентной микроскопии.
Ключевые слова: флуоресценция; микроскопия; серебряные наночастицы; флавины; рибофлавин.
EFFECT OF SILVER NANOPARTICLES ON THE FLUORESCENCE INTENSITY OF RIBOFLAVIN AND ITS DERIVATIVES
Belitskaya E.D.1, Bordychevskaya E.S.2, Demina P.A3, Generalova A.N.3, Oleinikov V.A.3, Zalygin A.V.3
1 Mendeleev University of Chemical Technology, Moscow, Russian Federation
2 National Research Nuclear University MEPhI, Moscow, Russian Federation
3 Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RAS, Moscow, Russian Federation
The article discusses the interactions of flavins (riboflavin, flavin mononucleotide, lumichrome) with silver nitrate and with silver nanoparticles with the formation of nanobiocomplexes. The study of the addition of silver ions and silver nanoparticles and changes in the properties of flavins was carried out by fluorescence microscopy. Key words: fluorescence; microscopy; silver nanoparticles; flavins; riboflavin.
Введение
Рибофлавин (витамин В2) и его производные незаменимы во многих процессах
жизнедеятельности организма в роли коферментов, также флавины являются перспективными веществами для использования в качестве противораковых агентов.
В настоящий момент применение рибофлавина в фотодинамической терапии представляет большой интерес. Он может служить более эффективным продуцентом синглетного кислорода, чем порфирин, который уже широко используется в этих целях. В литературе представлено использование
рибофлавина в качестве фотосенсибилизатора для лечения меланомы В16 in vitro [1], рака молочной железы in vivo [3]. Для активации рибофлавина на глубине биоткани предложено использование наноразмерных апконвертирующих фосфоров, которые могут преобразовать ИК-излучение в излучение синего цвета [2,3].
В природе наиболее важными представителями флавинов являются люмихром (изоалаксазин),
рибофлавин, мононуклеотид флавина (ФМН) и адениндинуклеотид флавина (ФАД), которые представлены на рисунке 1.
: (Витамин Bj) Люмихром ..... Рибофлавин
ФМН' ФАД
Рис.1 Строение флавинов [4]
Серебряные наночастицы применяются в методе гигантского комбинационного рассеяния как горячие точки при получении спектров [5], с помощью данного метода можно выявить структурные различия флавинов. При этом наночастицы также могут связываться с рибофлавином и его производными, изменяя его физические свойства, что проявляется, в
частности, в изменении интенсивности его флуоресценции.
Экспериментальная часть
В данной работе на установке Renishaw inVia Qontor confocal Raman microscope было произведено измерение спектров флуоресценции рибофлавина, флавинмононуклеотида и люмихрома, длина волны возбуждения - 473 нм, интенсивность возбуждающего излучения на образце - 0,32 мВт. Время накопления для каждого образца составило 1
с. Концентрация исходных веществ - 1,76* 10-7 моль/мл. Затем было произведено измерение спектров смеси растворов исходных веществ с раствором нитрата серебра Л§КОэ в концентрации 1,76*10-4 моль/мл в соотношении 1 к 1.
На рисунках 2-4 показано, что интенсивность флуоресценции рибофлавина после добавления нитрата серебра снизилась с 5200 до 85 отн. ед.; флавинмононуклеотида - с 5000 до 100 отн. ед.; люмихрома - с 60 до 1,5 отн. ед.
Длина волны, нм
Рис. 2. а) Спектр флуоресценции рибофлавина; б) Спектр флуоресценции рибофлавина после добавления
AgNOз
Длина волны, нм
Рис. 3. а) Спектр флуоресценции флавинмононуклеотида; б) Спектр флуоресценции флавинмононуклеотида
после добавления AgNOз
Длина волны, нм
Рис. 4. а) Спектр флуоресценции люмихрома; б) Спектр флуоресценции люмихрома после добавления AgNOз
1200-
S.i'i
200
•100 450 ЯЮ 550 600 650 700
Длина ioiuiu. им
Рис. 5. Спектр флуоресценции рибофлавина с наночастицами серебра: 1-10% РФ + 90% H2O; 2-10% РФ + 40% НЧ Ag + 50% H2O; 3-10% РФ + 80% НЧ Ag + 10% Н20
$00
i
1
2 <00 ;
ул
т ко у: т «о тоо
Д—1е™чш1
Рис. 6. Спектр флуоресценции флавинмононуклеотида с наночастицами серебра: 1-10% ФМН + 90% Н2О; 2-10% ФМН + 40% НЧ Ag + 50% Н2О; 3-10% ФМН + 80% НЧ Ag + 10% Н2О
наночастицами серебра: 1-10% ЛХ + 90% Н2О; 2-10% ЛХ + 40% НЧ Ag + 50% Н2О; 3-10% ЛХ + 80% НЧ Ag + 10% Н2О
Было произведено измерение спектров комплексов рибофлавина, флавинмононуклеотида и люмихрома с серебряными наночастицами, полученными цитратном методом, длина волны возбуждения 473 нм, интенсивность возбуждающего излучения на образце - 0,32 мВт для измерений комплексов рибофлавина и флавинмононуклеотида,
2,6 мВт для измерения комплексов люмихрома. Время накопления для каждого образца составило 1 с. Концентрация рибофлавина,
флавинмононуклеотида и люмихрома - 1,76*10-7 моль/мл, концентрация наночастиц серебра - 0,26 мг/мл. Было приготовлено по три образца для каждого из исследуемых веществ с добавлением раствора наночастиц серебра в соотношениях: 1) 10% раствора исходного вещества, 90% Н2О; 2) 10% раствора исходного вещества, 40% раствора наночастиц серебра, 50% Н2О; 3) 10% исходного вещества, 80% раствора наночастиц серебра, 10% Н2О.
По полученным данным были построены зависимости интенсивности флуоресценции (пик флуоресценции - 565 нм) в комплексах от концентрации наночастиц серебра (рис. 8). За 100% взяты интенсивности флуоресценции чистых веществ. Показано, что интенсивность флуоресценции рибофлавина падает до 75% от исходной интенсивности при соотношении раствора наночастиц к рибофлавину 4:1 и до 33% при соотношении раствора наночастиц к рибофлавину 8:1. Интенсивность флуоресценции
флавинмононуклеотида падает до 51% от исходной при соотношении раствора наночастиц к флавинмононуклеотиду 4:1 и до 25% при соотношении раствора наночастиц к флавинмононуклеотиду 8:1. Интенсивность флуоресценции люмихрома падает до 41% от исходной интенсивности при соотношении раствора наночастиц к люмихрому 4:1 и до 19% при соотношении раствора наночастиц к люмихрому 8:1.
120
Количество добавленного раствора наночастиц, мкл - • - Рибофлавин
* Флавинмононуклеотид —*—Люмихром
Рис. 8. Зависимость интенсивности флуоресценции в комплексах с наночастицами серебра
Заключение
Были получены спектры флуоресценции при длине волны возбуждения 473 нм рибофлавина, люмихрома и флавинмононуклеотида, показавшие, что в одинаковых условиях рибофлавин демонстрирует наибольшую интенсивность спектра флуоресценции, а люмихром - наименьшую.
Было показано, что ионы серебра существенно снижают интенсивность флуоресценции и связываются с флавинами с высоким сродством.
Выявлена зависимость интенсивности
флуоресценции от концентрации наночастиц серебра в комплексах. Было показано, что в растворах, содержащие флавины в концентрации 1,76*10-8 моль/мл с добавлением наночастиц серебра в концентрации 0,208 мг/мл, интенсивность флуоресценции падала относительно растворов без добавления наночастиц серебра примерно в 3 раза для рибофлавина, в 4 раза для флавинмононуклотида и более, чем в 5 раз, для люмихрома.
Исследование было поддержано грантом Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (проект № 22-14-00168).
Список литературы
1. Akasov R. A., Sholina N. V., Khochenkov D. A., Alova A. V., Gorelkin P. V., Erofeev A. S., Generalova A. N., Khaydukov E. V. Photodynamic therapy of melanoma by blue-light photoactivation of
flavin mononucleotide //Scientific reports. - 2019. -Vol. 9. - №.1. - P. 1-11.
2. Шолина Н.В., Акасов Р.А., Хоченков Д.А., Генералова А.Н., Семчишен В.А., Хайдуков Е.В. Фотодинамическая терапия солидных опухолей in vitro и in vivo с применением комбинации рибофлавина и наноразмерных апконвертирующих фосфоров //Альманах клинической медицины. -2019. - Т. 47, №.7. - С. 647-653.
3. Khaydukov E. V., Mironova K. E., Semchishen V. A., Generalova A. N., Nechaev A. V., Khochenkov D. A., Panchenko, V. Y. Riboflavin photoactivation by upconversion nanoparticles for cancer treatment //Scientific reports. - 2016. - Vol. 6. - №.1. - P. 1-9.
4. Bajzath C., Ballou D., Bombarda E., Cecchini G., Dumit V. I., Eger B. T., Zhong D. Complex Flavoproteins, Dehydrogenases and Physical Methods. -Walter de Gruyter, 2013.
5. Mochalov K, Solovyeva D, Chistyakov A, Zimka B, Lukashev E, Nabiev I, Oleinikov V, «Raman and SERS Spectroscopy of D96N Mutant Bacteriorhodopsin» // Mater Today, 2015, 3(2):497-501.
