CC BY
25
Reference
1. Ob utverzhdenii Doktriny prodovol'stvennoi bezopasnosti Rossiiskoi Federatsii: Ukaz Prezidenta Ros. Federatsii ot 30 yanvarya 2010 g. №120 (On Approval of Food Security Doctrine of the Russian Federation: the Decree of the President Grew. Federation of January 30, 2010 №120), Sobranie zakonodatel'stva RF, 2010, St.502.
2. Inshakova, S.N., Emel'yanov, A.N. Ispol'zovanie fitomeliorantov v zemledelii Primorskogo kraya: monografiya (The Use of Phytomeliorants in Agriculture in Primorsky Region: Monograph), Ussuriisk, FGBOU VO Primorskaya GSKhA, 2016, 128 p.
3. O merakh po realizatsii gosudarstvennoi nauchno-tekhnicheskoi politiki v interesakh razvitiya sel'skogo khozyaistva: Ukaz Prezidenta Ros. Federatsii ot 24 iyulya 2016 g.(Concerning Measures to Implement the State Science and Technology Policy for Agricultural Development, The Decree of the President of the RF of July 24, 2016 No. 350.), 2016.
УДК 635.655 ГРНТИ 68.35.31
Ефремова О.С., канд. с.-х. наук, ст. науч. сотр.; Фисенко П.В., канд. биол. наук., ст. науч. сотр.,
Приморский научно-исследовательский институт сельского хозяйства, пос. Тимирязевский, Уссурийский район, Приморский край, Россия Е-mail: fe.smc_rf@mail.ru
ВЛИЯНИЕ МУТАГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ИОНОВ МЕДИ НА УРОВЕНЬ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ РЕГЕНЕРАНТОВ СОИ
В статье представлены результаты исследований влияния ионов меди в питательной среде нарегенерационную способность сои. Получено 88регенерантных линий сои от 9 исходных форм, созданных на селективных средах с добавлением ионов меди. По биохимическим показателям четыре сомаклональные линии превысили показатели содержания в семенах масла и гистидина, снизив содержание линоленовой кислоты. Превышение над стандартом по содержанию масла составляло от 7,7-16,0%, содержанию гистидина — 24,6-75,3%, снижение содержания линоленовой кислоты — на 24,0-64,0%. Регенерантная линия R 1357 выделена как лучшая по некоторым достоверно превышающим стандарт признакам. Проведен подбор праймеров к различным ди- и тринуклеотидным микроса-теллитным повторам, дана оценка генетической изменчивости регенерантных линий сои с помощью метода ISSR. В результате исследования проанализировано семь сорто-образцов сои с участием 9 праймеров к различным ди- и тринуклеотидным микросател-литным повторам. При анализе продуктов амплификации регенерантной линии 1357 и ее исходной формы — сорта Ходсон выявлены 53 фрагмента, 9 из которых оказались полиморфными (17%), остальные - мономорфные.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ТЯЖЕЛЫЕ МЕТАЛЛЫ (ИОНЫ), IN VITRO, МУТАГЕННЫЙ ФАКТОР, СЕМЯДОЛЬНЫЙ УЗЕЛ, СЕЛЕКТИВНАЯ СРЕДА, РЕГЕНЕРАЦИЯ, ГЕН, ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ.
UDC 635.655
Efremova O.S., Саnd. Agr. Sci., Senior Research Worker; Fisenko P.V., Саnd. Biol. Sci., Senior Research Worker,
Primorsky Research Institute of Agriculture,
Village of Timiryazevsky, Ussuriysk District, Primorsky Territory, Russia E-mail: fe.smc_rf@mail.ru
EFFECT OF MUTAGENIC ACTION OF COPPER IONS UPON THE LEVEL OF GENETIC VARIABILITY OF SOYBEAN REGENERANTS
The article presents the findings of investigations on effect of copper ions,being in the nutrient medium, upon regeneration ability of soybean. We have grown 88 regenerate lines of soybean using 9 original forms created on selective medium with the addition of copper ions. As for biochemical parameters, four somaclonal lines exceeded seeds' oil and histidine content and reduced the content of linolenic acid.Excess of oil content over the standard amounted to 7,7-16,0%, of histidine content — 24,6-75,3%, decrease in linolenic acid content by 24,0-64,0%. Regenerate line R1357 was marked as the best one that truly excels the standard insome parameters. We carried out the selection of primers for different di- and trionukleotid microsatellite repetitions; carried out the assessment of genetic variability of the regenerate lines of soybean using method of ISSR. The research resulted in analysis of seven variety samples of soybean with participation of 9 primers for various di-and trinucleotide microsatellite repetitions.Analysis of products of amplification of the regenerate line 1357 and its initial form - variety Hodsonfound out 53 fragments, 9 of which were polymorphic (17%), the rest - monomorphic.
KEY WORDS: HEAVY METALS (IONS), IN VITRO, MUTAGENIC AGENT, COTYLEDO-NARY NODE, SELECTIVE MEDIUM, REGENERATION, GENE, GENETIC VARIABILITY.
Введение. Тяжелые металлы (ТМ) в силу своей малоподвижности практически навечно остаются в биогеоценозах, постепенно накапливаясь с течением времени. Подобные концентрации, как правило, не настолько значительны, чтобы вызывать отравления, но их длительное воздействие может иметь генетические последствия [1]. Влияние на растения ионов тяжелых металлов в последнее время приобретает все большее значение среди большого числа абиотических факторов и может быть причиной ионного стресса у растений, что привлекает особое внимание исследователей. Ученые полагают, что накопление металлов в молекулах нуклеиновых кислот приводит к нарушению функционирования клеток [2-9]. В связи с этим, для получения нового исходного материала в целях выделения ценных генотипов, наряду с классическим методом - гибридизацией, используются возможности создания in vitro данных форм с применением в питательных средах ионов тяжелых металлов как мутагенного фактора.
Растения семейства бобовых могут аккумулировать значительное количество металлов (более 5 г/см3), в том числе и опасных для животных организмов тяжелых металлов [10]. Вместе с этим следует отметить узкий спектр исследований по сое в изложенном направлении, что подтверждает необходимость проведения экспериментов по использованию тяжелых металлов в качестве селективного фона in vitro при работе с культурой ткани в условиях расширения ге-нотипической изменчивости хозяйственно ценных и адаптивных признаков сои.
Целью данной работы было определить в условиях in vitro влияние ионов меди на регенерационную способность сои и оценить уровень генетической изменчивости регенерантов.
Материал и методы исследований Исследования проводили в лаборатории сельскохозяйственной биотехнологии ФГБНУ "Приморского НИИСХ" (2015-2017 гг.). Предметом исследований были сорта сои: Приморская 13, Ходсон, Приморская
81, Приморская 69, Приморская 301, Лидия и регенеранты: R362, R1 и R565.
Стерильные семена первоначально помещали на питательную среду Мурасиге и Скуга [11] в половинном составе макро- и микросолей (MS) с добавлением цитоки-нина 6-Бензиламинопурина (БАП) - среда А (контроль) и как мутагенного фактора CuSO4* 5H2O (6 мг/л, 12 мг/л) - среда А+ ТМ.
Перевод пробирочных растений с нормально развитой корневой системой осуществляли в почвенный грунт (стерильный, ранее проавтоклавированный). Дальнейшее развитие растений Rо получали в условиях культуральной комнаты: освещенность 3,54,0 тыс. люкс, t +25 0С, фотопериод 16 часов.
Биохимический состав семян исходных форм и регенерантных линий проведен на ИК-сканере Nir-42 (ВНИИ сои, г. Благовещенск).
Тотальную ДНК выделяли из фрагментов свежих или высушенных в лиофилиза-торе листьев. ПЦР анализ полученных образцов проводили в двух-трех повторно-стях, используя термоциклеры Mj Mini (Bio-
Rad) и С-1000 Touch (Bio-Rad) в 25 мкл реакционной смеси. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Визуализацию фрагментов ДНК проводили облучением УФ с помощью гель-документи-рующей системы Gel-Doc XR + (Bio-Rad). Для определения длины фрагментов использовался маркер молекулярных масс 100 bp DNA Ladder. Для каждого праймера составлены бинарные матрицы, где присутствие или отсутствие фрагмента с одной молекулярной массой обозначается «1» или «0», соответственно. На основании бинарных матриц рассчитаны основные показатели генетической изменчивости. Статистическую обработку полученных данных проводили с применением пакетов программ POPGENE, TFPGA.
Результаты и обсуждения
Результаты регенерации с использованием в качестве первичного экспланта семядольного узла на средах с содержанием двух разных концентраций меди приведены в таблице 1.
Эффективность регенерации семядольных узлов на вариантах с различными концентрациями Си+2
Таблица 1
Сорт, форма Контроль 6 мг/л Cu+2 12 мг/л Cu+2
число регенерировавших семядольных узлов, % продуктивность семядольных узлов, шт. число регенерировавших семядольных узлов, % продуктивность семядольных узлов, шт. число регенерировавших семядольных узлов, % продуктивность семядольных узлов, шт.
max min X max min X max min X
Приморская 13 100,0 5 1 2,1 100,0 3 1 1,8 90,0 3 1 1,9
Ходсон 100,0 2 1 1,8 100,0 4 1 2,0 92,8 3 1 1,7
Приморская 69 92,0 3 1 1,9 100,0 2 1 1,6 93,4 2 1 1,3
Лидия 77,8 3 1 1,9 91,8 3 1 1,8 93,7 3 1 2,0
Приморская 301 84,0 2 1 1,6 91,7 2 1 1,1 100,0 2 1 1,4
Приморская 81 100,0 4 1 1,7 75,0 1 1 1,0 100,0 2 1 1,7
R362 100,0 3 1 1,5 82,4 2 1 1,6 81,3 2 1 1,4
R565 100,0 3 1 2,2 100,0 3 1 1,4 100,0 4 1 1,2
R1 - - - - 100,0 2 1 1,7 90,0 3 1 1,7
Х 92,6 1,6 92,1 1,5 91,0 1,6
Генотипы по-разному отозвались на регенерацию. В контрольном варианте число регенерирующих узлов варьировало в зависимости от исходной формы (и.ф) в пределах от 77,8% до 100%, в среднем составило 92,6%. Продуктивность семядольных узлов в среднем соответствовала 1,6 шт. при минимальном значении данного показателя 1,5 (R362) и максимальном - 2,2 (R565).
На изученных вариантах питательных сред с ионами меди эффективность регенерации практически по отношению к контролю не изменилась. Показатель числа регенерировавших семядольных узлов в варианте 6 мг/л Cu+2 составил 92,1%, в варианте 12 мг/л Cu+2 - 91%. Эта же картина прослеживается и по признаку продуктивности семядольного узла. Некоторая изменчивость данных показателей отмечена лишь в пределах исходных форм.
Полученные на селективных средах побеги культивировали для дальнейшего развития и перевода ex vitro в условиях
Характеристика регенерантных линий
по биохимическ
культуральной комнаты. Фертильные растения были размножены в селекционном питомнике для дальнейшего изучения.
По результатам биохимического анализа почти все полученные регенерантные линии превысили показатели содержания в семенах масла и гистидина, при этом снизив содержание линоленовой кислоты, которая влияет на качественный состав соевого масла (табл. 2).
Превышение над стандартом по содержанию масла составляло 7,7-16,0%, содержанию гистидина - 24,6-75,3%, снижение содержания линоленовой кислоты на - 24,064,0%. Регенерантная линия R 1357 выделена как лучшая по некоторым достоверно превышающим стандарт признакам: масло -16,0%, гистидин - 35,8%, линолевая кислота - 2,0%, линоленовая - ниже на 64,0%. Предположительно, что выделенные преимущества объясняются влиянием ионов меди в питательной среде, как дополнительного мутагенного фактора.
Таблица 2 полученных на средах с ионами меди показателям
Сорт, форма Содержание в семенах белка, % Содержание в семенах масла, % Содержание гистидина, % от общего количества аминокислот Содержание кислоты, % от общего количества масла в семенах
олеиновая кислота линоле-вая кислота линоле- новая кислота
Ходсон - стандарт 38,8 18,1 8,1 18,4 53,5 9,2
Я 1431 (и.ф. Ходсон-12 Си 2+) 34,8 19,5* 10,1* 10,7 54,0 4,7*
Я 1482 (и.ф. Приморская 69-6 Си 2+) 37,1 19,6* 11,6* 10,2 54,5* 5,9*
Я 1496 (и.ф. Приморская 8112 Си 2+) 35,0 19,9* 11,1* 9,6 53,9 5,4*
Я 109 (и.ф. Я1-6 Си 2+) 35,2 19,9* 10,3* 12,4 54,0 5,8*
Я 1485 (и.ф. Я1-6 Си 2+) 33,4 20,8* 10,8* 9,7 54,3* 3,6*
Я 1477 (и.ф. Приморская 30112 Си 2+) 35,8 19,5* 11,3* 10,4 53,9 5,7*
Я 1486 (и.ф. Приморская 30112 Си 2+) 37,1 18,7 10,8* 11,4 53,2 7,0*
Я 1490 (и.ф. Я1-6 Си 2+) 34,2 20,0* 14,2* 8,0 53,3 4,8*
Я 1524 (и.ф. Я1-6 Си 2+) 34,8 19,7* 11,1* 9,9 53,7 6,0*
Я 1357 (и.ф. Ходсон-6 Си 2+) 34,5 21,0* 11,0* 10,0 54,7* 3,3*
НСР05 1,5 0,9 1,6 1,8 0,6 1,5
Примечание: * - достоверно превосходит стандарт на 5% уровне
Методом ISSR анализа проанализировано семь сортообразцов сои с участием 9 праймеров к различным ди- и тринуклеотид-ным микросателлитным повторам. При исследовании линий 1490, Ю, 1485 и исходной формы (Приморская 301) получены мо-номорфные картины распределения ампли-фицированных фрагментов по всем использованным праймерам.
В результате анализа продуктов амплификации не выявлено фрагментов, носящих диагностический характер, данные линии генетически идентичны друг другу и своей исходной форме по исследованным маркерам. При анализе продуктов амплификации регенерантной линии 1357 и ее исходной формы - сорта Ходсон выявлены 53
фрагмента, 9 из которых оказались полиморфными (17%), остальные - мономорф-ные. Размер выявленных фрагментов варьировал от 300 до 3000 пар нуклеотидов (п.н.). В зависимости от праймера число полиморфных фрагментов варьировало от 1 до 5. Исследуемые линия и исходная форма оказались генетически однородными (рис.1).
Наиболее распространенным и информативным показателем генетических различий являются генетические дистанции. На основе анализа бинарной матрицы рассчитан индекс генетического различия линии 1357 и сорта Ходсон, значение которого составило 0,1861. Выявлены достоверные генетические отличия линии от исходной формы.
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации с праймером 840 образцов сорта Ходсон и регенерантной линии 1357. М- маркер длин фрагментов 100 bp ladder, К - контрольный образец, не содержащий ДНК. Белой стрелкой показан фрагмент длиной ~870 п.н., отличающий мутантную линию от исходной формы
Проведено генетическое сравнение ре-генерантных линий Ю357 и Ю485, выделенных по комплексу биохимических показателей (табл. 2) с перспективными сортооб-разцами сои (лаб. селекции сои) с целью их включения в селекционный процесс. По ре-
зультатам анализа с помощью пакета программ TFPGA, используя алгоритм невзве-шенного попарно-группового анализа (UPGMA), построена дендрограмма филогенетических взаимоотношений исследуемых сортообразцов сои (рис.2).
Рис. 2. иРОМА дендрограмма филогенетических взаимоотношений сортообразцов сои и регенерантов, полученных с использованием Си2+ по данным ISSR анализа. Длина ветвей отражает уровень генетических различий
На филогенетическом дереве образовались два кластера, имеющих наибольшие отличия. Кластер с наибольшим количеством сортообразцов подразделен на три подкластера. Исследуемые линии оказались в разных подкластерах основного кла-
стера, демонстрируя достоверные генетические отличия (длина ветвей отражает степень генетических различий). Также были рассчитаны генетические дистанции, которые подтвердили генетические отличия исследуемых линий (табл. 3).
Таблица 3
Генетические дистанции сортообразцов сои и регенерантов, полученных с использованием
ионов Си2+ по данным ISSR анализа
Сорт, форма XN6 При-морская 13 Прим НИИС X №3 Прим НИИС X №4 Прим 1385 XN2 R 1485 R 1357 Кордоба
Приморская 13 0.3463 ****
ПримНИИСХ №3 0.3124 0.1301 ****
ПримНИИСХ №4 0.2478 0.1872 0.1582 ****
Прим 1385 0.1872 0.2478 0.2171 0.1582 ****
XN2 0.3814 0.1301 0.1027 0.1582 0.2796 ****
R 1485 0.2787 0.2460 0.0964 0.1246 0.2460 0.0964 ****
R 1357 0.0861 0.2005 0.1707 0.1707 0.0595 0.0964 0.1977 ****
Кордоба 0.2796 0.2171 0.3814 0.4555 0.3814 0.3814 0.4611 0.2631 ****
D 378 0.3463 0.2171 0.3124 0.3124 0.3124 0.1872 0.2787 0.2313 0.2171
Выводы. Таким образом, применяемые в качестве мутагенного фактора в питательной среде ионы меди оказали влияние на биохимический состав культуры. Выявлены достоверные генетические отличия регенерантов от исходных форм, что
подтверждает возможность использования исследуемых линий в селекционном процессе в качестве источника хозяйственно ценных признаков.
Список литературы
1. Реутова, Н.В. Мутагенный потенциал ряда тяжелых металлов / Н.В. Реутова // Экологическая генетика. - 2015. - T. XIII, № 3. - С. 70-75.
2. Кошкин, Е.И. Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур / Е.И. Кошкин. - М.: Дрофа, 2010. - 640 с.
3. Генетический и структурный анализ устойчивости гороха посевного к токсичным концентрациям кадмия / В.Е. Цыганов, А.И. Жернаков, О.А. Кулаева и др. // Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века. - Петрозаводск: Русское ботан. об-во, 2008. - Ч. 6. - С. 140-142.
4. Гладков, Е.А. Биотехнологические методы получения растений полевицы побегоносной Agrostis stolonifera, обладающих устойчивостью к кадмию и свинцу / Е.А. Гладков // Сельскохозяйственная биология. - 2008. - № 3. - С. 83-87.
5. Коротченко, И.С. Влияние тяжелых металлов на содержание фотосинтетических пигментов в листьях моркови /И.С. Коротченко // Вестник КрасГАУ. - Красноярск, 2011. - № 4. - С. 86-91.
6. Белимов, А.А. Микробиологические аспекты устойчивости и аккумуляции тяжелых металлов у растений / А.А. Белимов, И.А. Тихонович // Сельскохозяйственная биология. - 2011. - № 3. - С. 1015.
7. Кулаева, О.А. Молекулярно-генетические основы устойчивости высших растений к кадмию и его аккумуляции / О.А. Кулаева, В.Е. Цыганов // Экологическая генетика. - 2010. - Т. VIII, № 3. - С. 315.
8. Воронина, Л.П. Влияние Zn и Cd на поступление питательных элементов в ячмень / Л.П. Воронина, Е.В. Морачевская, К.В. Павлов // Экологическая агрохимия / под ред. В.Г. Минеева. - М.: Изд-во МГУ, 2008. - С. 83-91.
9. Шалимова, О.А. Развитие растений гороха на средах с высоким содержанием тяжелых металлов при стимуляции салициловой кислотой / О.А. Шалимова, Т.А. Штахова // Вестник Россельхозака-демии. - 2007. - № 5. - С. 40-41.
10. Effect of cadmium on nodulation and N2-fixation of soybean in contaminated soils / Y.X. Chen, Y.F. He, Y. Yang [et all.] // Chemosphere, 2003. - Vol. 50. - P. 781-787.
11. Murashige, T. Arevised medium for rapid growth and bio assays with to bacco tissue cultures / T. Murashige, F. Scoog. // Phisiol. plant., 1962. - Vol. 15, № 13. - P. 473-497.
Reference
1. Reutova, N.V. Mutagennyi potentsial ryada tyazhelykh metallov (Mutagenic Potential of Some Heavy Metals), Ekologicheskaya genetika, 2015, T. XIII, No 3, PP. 70-75.
2. Koshkin, E.I. Fiziologiya ustoichivosti sel'skokhozyaistvennykh kul'tur (Physiology of Crops Resistance), M.: Drofa, 2010, 640 p.
3. Geneticheskii i strukturnyi analiz ustoichivosti gorokha posevnogo k toksichnym kontsentratsiyam kadmiya (Genetic and Structural Analysis of Pea Resistance to Toxic Concentrations of Cadmium), V.E. Tsy-ganov [i dr.] , Fundamental'nye i prikladnye problemy botaniki v nachale KhKhI veka. Ch.6, Petrozavodsk, Russkoe botan. ob-vo, 2008, PP. 140-142.
4. Gladkov, E.A. Biotekhnologicheskie metody polucheniya rastenii po-levitsy pobegonosnoi Agrostis stolonifera, obladayushchikh ustoichivost'yu k kadmiyu i svintsu (Agrostis Stolonifer Resistant to Cadmium and Led: Biotechnique of Cultivation), S.-kh. Biologiya, 2008, No 3, PP. 83-87.
5. Korotchenko, I.S. Vliyanie tyazhelykh metallov na soderzhanie foto-sinteticheskikh pigmentov v list'yakh morkovi (Effect of Heavy Metals upon the Photosynthetic Pigments in the Carrot Leaves), Vestnik KrasGAU, Krasnoyarsk, 2011, No 4, PP. 86-91.
6. Belimov, A.A., Tikhonovich, I.A. Mikrobiologicheskie aspekty ustoichivosti i akku-mulyatsii tya-zhelykh metallov u rastenii (Microbiologic Aspects of Resistance and Accumulation of Heavy Metals in Plants), S.-kh. Biologiya, 2011, No 3, PP. 10-15.
7. Kulaeva, O.A., Tsyganov, V.E. Molekulyarno-geneticheskie osnovy ustoichivosti vysshikh rastenii k kadmiyu i ego akkumulyatsii (Molecular-Genetic Foundations of Higher Plants Resistance to Cadmium and Its Accumulation), Ekologicheskaya genetika, 2010, T. VIII, No 3, PP. 3-15.
8. Voronina, L.P., Morachevskaya, E.V., Pavlov, K.V. Vliyanie Zn i Cd na postuplenie pitatel'nykh ele-mentov v yachmen' (Influence of Zn and Cd upon Entry of Nutrients in Barley), Ekologicheskaya agrokhimiya, pod red. V.G. Mineeva, M., MGU, 2008, PP. 83-91.
9. Shalimova, O.A., Shtakhova, T.A. Razvitie rastenii gorokha na sredakh s vysokim soderzhaniem tyazhelykh metallov pri stimulyatsii salitsilovoi kislotoi (Development of Pea on the Mediums with High Heavy Metals Content and by Means of Salicylic Acid Forcing), Vestnik Rossel'khozakademii, 2007, No 5, PP. 40-41.
10. Effect of cadmium on nodulation and N2-fixation of soybean in contaminated soils, Y.X. Chen, Y.F. He, Y. Yang [et all.], Chemosphere, 2003, Vol. 50, PP. 781-787.
11. Murashige, T. Arevised medium for rapid growth and bio assays with to bacco tissue cultures, T. Murashige, F. Scoog, Phisiol. plant., 1962, Vol. 15, No 13, P. 473-497.
