CC BY
30
УДК:579.222
ВЛИЯНИЕ МОНОЙОДАЦЕТАТА НАТРИЯ И ТЕПЛОВОГО ШОКА НА ДЫХАНИЕ CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SSP. SEPEDONICUS
А.И. Перфильева1'2, Е.В. Рымарева1
Иркутский государственный технический университет, 664074, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83, [email protected] 2ФГБУН Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132
Изучали влияние ингибитора гликолиза монойодацетата натрия (МИА) и теплового шока (45 оС, 1 ч) на дыхание фитопатогенной бактерии Clavibacter michiganensis spp. sepedonicus (Cms). Показано угнетение дегидрогеназной активности и поглощения кислорода клетками бактерий после обработки МИА, тепловой шок усиливал этот эффект. Ил. 4. Библиогр. 15 назв.
Ключевые слова: дыхание; дегидрогеназная активность; поглощение кислорода; тепловой шок; монойодацетат натрия; Clavibacter michiganensis spp. sepedonicus.
IODOACETIC ACID SODIUM SALT AND HEAT SHOCK INFLUENCE ON CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SSP. SEPEDONICUS CELLULAR RESPIRATION
A.I. Perfileva1'2, E.V. Rymareva2
Irkutsk State Technical University,
83, Lermontov St., Irkutsk, 664074, Russia, [email protected] 2Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, 132, Lermontov St., Irkutsk, 664033, Russia, [email protected]
The effect of glycolysis inhibitor - iodoacetic acid sodium salt (MIA) and heat stress (45 оС, 1 h) on respiration of a phytopathogenic bacterium of Clavibacter michiganensis spp. sepedonicus (Cms) was examined. Dehydrogenase activity and oxygen absorption were reduced after bacterial cells incubation with MIA. Heat stress increased this effect. 4 figures. 15 sources.
Key words: breath; degidrogenase activity; oxygen absorption; heat shock; iodoacetic acid sodium salt; Clavibacter michiganensis spp. sepedonicus.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время в сельском хозяйстве активно применяется широкий спектр химических препаратов действия для борьбы с возбудителями заболеваний культурных растений. Это обусловлено крайне неблагоприятным фитосанитарным состоянием. Согласно прогнозам, наша страна может в ближайшие 10-15 лет достичь среднемирового уровня по интенсивности применения пестицидов [1, 2]. В настоящее время среди пестицидов, разрешенных к применению в Российской Федерации, 16% - инсектициды, 15% - фунгициды, 50% - гербициды; в тоже время средств, применяемых для борьбы с широко распространенными бактериальными заболеваниями культурных растений, крайне мало. Механизм действия применяемых агентов для обработки растений на патогенные бактерии разнообразен. Бактерицидное и фунгицидное действие многих фунгицидов и бактериоцидов определяется их способностью ингибировать функционирование дыхательной цепи патогенной микрофлоры [3, 4].
Применяемые на сегодняшний день пестициды для ограничения распространения фитопатогенов представляют значительную опасность для обитателей природы, накапливаясь в почве и воде. Попадая в организм человека, они вызывают аллергические реакции, отрицательно влияют на иммунную систему, некоторые из них обладают канцерогенным действием [2].
В качественного потенциального агента для оздоровления картофеля нами был исследован монойодацетат натрия (МИА) - ингибитор ключевого фермента гликолиза гли-церальдегид-3-фосфатдегидрогеназы [5], ал-когольдегидрогеназы и глицеральдегидфос-фатдегидрогеназы. При повышении температуры до 40 оС (2 ч) МИА способен распадаться на безвредные вещества: йод и уксусную кислоту [б]. Clavibacter michiganensis spp. sepedonicus (Cms) - палочковидная бактерия, вызывающая заболевание, известное как кольцевая гниль картофеля [7].
Цель работы - исследовать влияние мо-нойодацетата натрия и теплового шока на дыхание возбудителя кольцевой гнили картофеля Cms.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали штаммы грампо-ложительной бактерии Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Cms): 5369 и CsR14. Бактериальная культура Cms штамм 5369 получена из НИИ картофельного хозяйства (п. Коренево, Московской обл.). Штамм CsR14
был любезно предоставлен M. Metzler (университет г. Турку, Финляндия). Бактериальную культуру выращивали на скошенной агаризо-ванной среде YPGA, содержащей 10 г/л диализата дрожжевого экстракта, 15 г/л глюкозы, 10 г/л агар-агара, 5 г/л СаСО3, рН 7,0 [7]. Пересев на свежую питательную среду проводили через 7-10 дней. Бактерии культивировали в термостате, в темноте при температуре 25 °С. Через 5-7 пассажей бактерии для сохранения их вирулентных свойств высевали на картофельно-глюкозный отвар из 200 г картофеля, с добавлением глюкозы 20 г/л, агар-агара 17-20 г/л, рН 7,2. Для экспериментов использовали бактериальную суспензию (Титр 1 х 109 кл/мл). Единичную колонию Cms, выращенную в пробирках на скошенном агаре, переносили в колбу с 20 мл жидкой питательной среды YPGA и помещали на качалку (80 об/мин) на 2, 7 и 13 сут при температуре
25 °С. Для экспериментов с растениями in vitro и клубнями использовали культуру в логарифмической фазе роста (2-х суточная культура).
Для экспериментов с Cms использовали водный раствор МИА в конечной концентрации: 0,1; 0,3; 1,0 мМ. МИА добавляли в объеме 50 мкл к 950 мкл бактериальной суспензии.
Суспензию клеток Cms (2-х суточную -логарифмическая фаза и 7-ми суточную -стационарная фаза роста) выдерживали при
26 °С и 45 °С на термостатируемом шейкере («BioSan», Латвия) 1 ч, при 50 °С в течение 5, 8, 10 и 30 минут.
Для определения скорости дыхания клетками Cms 1,4 мл 2-х суточной суспензии клеток в среде YPGA вносили в термостатируе-мую полярографическую ячейку и, используя платиновый электрод закрытого типа (электрод Кларка) на полярографе 0Н-105 (Венгрия) [8], регистрировали скорость поглощения кислорода при 25 оС. Скорость поглощения кислорода выражали в нанамолях поглощенного кислорода в минуту на грамм сырого веса, учитывая растворимость кислорода в воде [8].
Для определения влияния теплового шока и МИА на дегидрогеназную активность клеток Cms использовали 2, 3, 5 - трифенилтет-разолиум хлорид (ТТХ) [9]. Измерение оптической плотности бактериальной суспензии проводили ежедневно в течение 13 суток при длине волны 655 нм. Бактериальную суспензию центрифугировали в пробирках Эппен-дорфа при 16000 об/мин 5 мин, супернатант сливали, оставшийся осадок заливали 0,5%-ным водным раствором ТТХ. Затем повторно
центрифугировали образец, супернатант удаляли, осадок промывали водой 2 раза. Далее клетки Cms заливали 96%-ым спиртом и на 15 мин помещали на водяную баню при 60оС. Оптическую плотность формазана, образующегося в результате ферментативной реакции и косвенно свидетельствующего о дегидроге-назной активности [10], определяли на планшетном спектрофотометре BIO-RAD model 680 (США) при длине волны 490 нм и выражали в условных единицах оптической плотности (OD) на мг сырого веса.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В экспериментах исследовался эффект термообработки и МИА на дыхательную активность Cms с использованием двух подходов: по определению поглощения кислорода и по дегидрогеназной активности.
Эксперименты показали, что активность восстановления ТТХ клетками Cms при 26 оС уменьшилась на 50% при обработке МИА независимо от концентрации агента (рис. 1, А). Тепловой шок понижал дегидрогеназную активность на 43% (рис. 1, Б). Таким образом, наблюдается зависимость между жизнеспо-
собностью Cms в логарифмической фазе и дегидрогеназной активностью клеток.
Динамика восстанавливающей активности бактериальной культуры Cms представлена на рис. 2. Пик интенсивности дегидрогеназной активности отмечался на 2 сутки роста. На 9 сутки роста восстанавливающая активность бактерий падала практически до нуля. Это связано с тем, что по мере старения метаболическая активность клеток бактерий угнетается, из-за чего понижается способность клеток восстанавливать ТТХ.
Аналогичные результаты были получены при изучении скорости поглощения кислорода. Поскольку МИА ингибирует гликолиз и, следовательно, ингибирует дыхание [5], представлялось важным изучить изменение скорости поглощения кислорода клетками Cms в указанных условиях.
Добавление МИА уменьшало поглощение кислорода у бактерий на 30% (рис. 3). В литературе показано, что повреждающий тепловой шок вызывает быстрое снижение дыхания в клетках дрожжей [11-14]. В соответствии с этими данными после инкубации бактериальной культуры при 45 оС в течение 1 ч поглоще-
Рис. 1. Влияние МИА (А) и теплового шока (Б) на дегидрогеназную активность клеток Cms (штамм CsR 14): А - клетки Cms в логарифмической фазе роста обрабатывали МИА в различных концентрациях (0,1; 0,3; 1 мМ) при 26 оС, 1 ч; Б - клетки Cms подвергали тепловому шоку (45 оС, 1 ч). Дегидрогеназную активность Cms определяли по интенсивности восстановления ТТХ, n = 3, M ± S.D
-
13;
Рис. 2. Динамика дегидрогеназной активности клеток Cms (штаммы 5369, CsR 14). Клетки Cms культивировали в жидкой среде YPGA и ежесуточно определяли дегидрогеназную активность клеток с применением ТТХ, n = 3-4, M ± S.D
ние кислорода бактериями уменьшилось на 83% по сравнению с контролем (26 оС), (рис. 3). При тепловом шоке добавление МИА снижало потребление кислорода на 93% (рис. 3). Таким образом, подавляющий эффект МИА на жизнеспособность клеток Cms при термообработке сопровождается его ингиби-рующим действием на дыхание.
Измерение поглощения кислорода клетками Cms в зависимости от фазы роста показало, что по мере старения культуры скорость поглощения кислорода снижалась приблизительно в 10 раз (рис. 4). Установлено, что динамика поглощения кислорода клетками Cms (рис. 4) соответствует динамике дегидрогеназной активности (рис. 2). Очевидно, незначительный эффект МИА на жизнеспособность Cms в стационарной фазе роста объясняется
пониженным уровнем дыхания клеток Cms в данный период.
Таким образом, проведенные исследования показали, что клетки Cms наиболее уязвимы в логарифмической фазе роста, и максимальное снижение адаптивных возможностей этих микроорганизмов происходит только при совместном воздействии двух стрессовых факторов. МИА менее опасен для клеток в состоянии покоя, т.е. в стационарной фазе роста Cms, когда уровень дыхательной активности понижен. МИА оказывает более сильный отрицательный эффект на метаболически активные клетки, поскольку он является ингибитором гликолиза. Кроме того, известно, что в стационарной фазе прекращается деление клеток, накапливаются БТШ, антиоксидантные ферменты и другие стрессовые белки [15].
Рис. 3. Влияние теплового шока и МИА на интенсивность поглощения кислорода Cms (штамм CsR14). Клетки Cms в логарифмической фазе роста обрабатывали МИА (1 мМ) при 45 оС, 1ч. Приведены данные типичного эксперимента, n = 2
Рис. 4. Динамика изменения скорости поглощения кислорода клетками Cms (штамм 5369). Клетки Cms культивировали в жидкой среде YPGA при 26 оС и ежесуточно определяли скорость поглощения кислорода, n = 3-4, M ± S.D
ВЫВОДЫ
1. МИА подавлял активность дегидроге-наз в клетках Cms на 50% по сравнению с контролем в логарифмической фазе роста.
2. МИА угнетал поглощение кислорода бактериями, тепловой шок усиливал этот эф-
фект.
3. По мере старения бактериальной культуры угнетающий эффект МИА на дыхание бактерий уменьшался, что объясняется снижением интенсивности поглощения кислорода клетками Cms.
1. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков / Б.В. Анисимов [и др.]. М.: Картофелевод, 2009. 272 с.
2. Горбатов В.С., Матвеев Ю.М., Кононова Т.В. Экологическая оценка пестицидов: источники и формы информации // Агро XXI. 2008. № 1-3. С. 7-9.
3. Карамова Н.С., Денисова А.П., Сташевски З. Мутагенное действие экстрактов растений картофеля Solanum tiberosum L., обработанных пестицидами // Ученые записки Казанского ун-та. Сер.: Естественные науки. 2009. Т. 151, кн. 1. С. 155-163.
4. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации: справочное издание. М.: АНО «Редакция журнала «Защита и карантин растений», 2013. 636 с.
5. Справочник биохимика / Р. Досон [и др.].
СИЙ СПИСОК
М.: Мир, 1991. 543 с.
6. Webb E.C. Enzyme and metabolic inhibitors / New York, 1963. V. 1. 340 p.
7. Eichenlaub R., Gartemann K.H. The Clavibacter michiganensis subspecies: molecular investigation of gram-positive bacterial plant pathogens // Annu Rev Phytopathol. 2011. V. 49. P. 445-464.
8. Трушанов В.Н. Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом. М.: Наука, 1973. 221 с.
9. Об использовании 2,3,5-трифенил-тетразолий хлорида для оценки жизнеспособности культур растительных клеток / А.Г. Еникеев [и др.] // Физиология растений. 1995. Т. 42. С. 423-426.
10.Chang W.C., Chen M.-H., Lee T.M. 2,3,5-Triphenyltetrazolium reduction in the viability assay of Ulva fasciata (Chlorophyta) in response to salinity stress // Bot. Bull. Acad. 1999. V. 40. P. 207-212.
11.Адаптация дрожжей Yarrowia lipolytica к тепловому воздействию / Е.Н. Бирюкова [и др.] // Микробиология. 2007. Т. 76, № 2. С. 184-190.
12.Дыхательная активность дрожжей Yarrowia lipolytica в условиях окислительного и теплового стрессов / Е.Н. Бирюкова [и др.] // Микробиология. 2008. Т. 77, № 4. С. 448-452.
13.Варакина Н.Н. Дыхание растущих и ста-
реющих колеоптилей кукурузы: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.12 . Иркутск, 1971. 187 с.
14.Изменение дыхания при действии теплового шока на дрожжи Saccharomyces cerevisiae / Е.Г. Рихванов [и др.] // Микробиология. 2001. Т. 70, № 4. С. 531-535.
15.Банакьян И.А. Стресс у бактерий. М.: Медицина, 2003. 136 с.
Поступило в редакцию 28 февраля 2014 г
