CC BY
56
УДК: 632.95.02
ВЛИЯНИЕ МОНОЙОДАЦЕТАТА НАТРИЯ (МИА) - МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ИНГИБИТОРА НА КАРТОФЕЛЬ IN VITRO
А.И. Перфильева
Иркутский государственный технический университет, 664074, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83, [email protected]. Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132.
Многие из применяемых на сегодняшний день пестицидов подавляют функционирование митохондрий патогенных бактерий и грибов. Однако действие таких препаратов на растения не достаточно изучено. В настоящей работе был исследован эффект влияния монойодацетата натрия (МИА) -митохондриального ингибитора на картофель in vitro. Показано подавление неспецифической защитной реакции растений (синтез белков теплового шока) при обработке МИА. Полученные результаты косвенно указывают, что пестициды - митохондриальные ингибиторы, накапливаясь в почве после обработки сельскохозяйственных культур, могут снижать защитные барьеры не только патогенов, но и угнетать растения. Ил. 1. Библиогр. 22 назв.
Ключевые слова: пестициды; ингибиторы; монойодацетат натрия; картофель; тепловой стресс; белки теплового шока.
THE EFFECT OF IODOACETIC ACID SODIUM SALT (PESTICIDES-INHIBITOR OF MITOCHONDRIONS) ON POTATOES PLANTS BY THE EXAMPLE OF MODEL SYSTEM IN VITRO A.I. Perfileva
Irkutsk State Technical University,
83, Lermontov St., Irkutsk, 664074, Russia, [email protected]. Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, 132, Lermontov St., Irkutsk, 664033, Russia.
Many of pesticides applied today suppress functioning of mitochondrions of pathogenic bacteria and mushrooms. However the effect of such preparations on plants is still not adequately studied. In this work, the effect of iodoacetic acid sodium salt (MIA) - mitochondrial inhibitor - on in vitro potatoes was investigated. Suppression of nonspecific protective reaction of plants (synthesis of heat shock proteins) is shown on application of MIA. The received results indirectly specify that pesticides - mitochondrial inhibitors, to be collected in the soil after crops treatment, can not only reduce protective barriers of pathogens, but also oppress the plants. 1 figure. 22 sources.
Keywords: pesticides; inhibitors; iodoacetic acid sodium salt; potatoes; heat stress; heat shock proteins. ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время в сельском хозяйстве тов для борьбы с возбудителями заболеваний активно применяется широкий спектр препара- культурных растений. Используемые пестициды,
ограничивающие численность фитопатогенов, представляют значительную опасность для обитателей природы, накапливаясь в окружающей среде [1-3]. Попадая в организм человека, они вызывают аллергические реакции, отрицательно влияют на иммунную систему, некоторые из них обладают канцерогенным действием [1,4]. Механизм действия применяемых химических агентов для обработки растений от патогенов разнообразен [5-7]. Бактерицидное и фунгицидное действие многих препаратов определяется их способностью ингибировать функционирование дыхательной цепи патогенной микрофлоры. Так пестициды, содержащие ртуть, мышьяк, кадмий, свинец, подавляют функцию митохондрий [5]. Известно, что по направленности действия на митохондрии различают три вида пестицидов. Первые из таких пестицидов (каптафол, каптан, фолпет, манкоцеб) блокируют тиол-содержащие ферменты - редуктазы и дегидрогеназы, участвующие в дыхании. Другие (например, динокап) препятствуют процессу образования АТФ из АДФ, сопряженного с переносом электронов, т.е. разобщают окислительное фосфорилирование в клетке патогена. Третьи (азоксистробин, крезок-сим-метил, циазофомид, амисульбром, карбок-син), связываясь с цитохромом Ь, являются ингибиторами митохондриального комплекса III (убихинол-цитохром с оксиредуктазный) дыхательной цепи. В качестве пестицидов также применяются ингибиторы, подавляющие сукцинат-дегидрогенный комплекс. Многие из используемых в настоящее время препаратов (дитан, но-возир, пенкоцеб) являются мультисайтовыми ингибиторами, т.е. способны действовать на несколько мишеней [6,7].
На сегодняшний день не имеется достаточно информации о влиянии пестицидов, ингиби-рующих функционирование митохондрий, на растения. Слабая изученность влияния пестицидов на растения объясняется, во-первых, их сложностью, во-вторых, отсутствием методов и модельных систем, посредством которых можно было бы разграничить и воспроизвести различные этапы влияния пестицида как на патогены, так и на растения и дать им качественные характеристики.
В качестве модельного агента для изучения влияния митохондриальных ингибиторов на растения нами был исследован монойодацетат натрия (МИА) - ингибитор ключевого фермента гликолиза глицеральдегид-3-фосфатдегидроге-назы [8]. МИА ингибирует гликолиз, следовательно, в клетке также подавляется функционирование митохондрий. Ранее нами были получены данные, что МИА обладает бактерицидным и фунгицидным эффектом [9]. Было интересно изучить, как такой агент, как митохондриальный ингибитор, влияет на растения. Из литературы известно, что митохондрии растительной клетки
участвуют не только в энергообеспечении клетки, но и в регуляции экспрессии ядерных генов (митохондриальная ретроградная регуляция), в частности, генов, кодирующих белки теплового шока (БТШ) [10]. БТШ обеспечивают защиту растений от стрессовых факторов биотической и абиотической природы [11-13].
Цель настоящей работы - изучить влияние пестицидов-ингибиторов митохондрий на растения на примере модельной системы: картофель in vitro - ингибитор монойодацетата натрия. В качестве биохимической характеристики влияния в работе рассматривается синтез БТШ в растениях картофеля in vitro.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Нами были проведены исследования на растениях картофеля in vitro (Solanum tuberosum) двух сортов: Лукьяновский и Луговской.
Сорт картофеля Луговской - устойчивый к бактериальному фитопатогену Clavibacter michi-ganensis ssp. sepedonicus (Украинский НИИ картофельного хозяйства). Клубни розовые, глазки красные, мелкие. Мякоть белая, цветки белые. Устойчив к фитофторозу. Среднеустойчив к вирусным болезням, ризоктониозу и парше обыкновенной. Восприимчив к чёрной ножке [14].
Сорт картофеля Лукьяновский - восприимчивый к Clavibacter michiganensis ssp. Sepedonicus (ВНИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха). Клубни овальные, белые, крупные, мякоть светло-жёлтая. Цветки белые. Отличается устойчивостью к картофельной нематоде, мало устойчив к вирусным болезням. Данный сорт устойчив к фитофторе [14].
Микроклональное размножение пробирочных растений осуществляли с помощью черенкования. Данный метод размножения растений основан на подавлении апикального доминирования и активации пазушных меристем при удалении верхушки побега. Из пазушных почек на питательной среде образуются побеги. Растения, сформировавшие 5-6 листьев, в стерильных условиях извлекали из пробирок и разрезали на части (отрезок стебля с листом и пазушной почкой). Черенки высаживали на глубину междоузлия в агаризованную питательную среду Му-расиге-Скуга (МС) 4,2 г/л с добавлением сахарозы 20 г/л, пиридоксина 1 мл/л, тиамина 1 мл/л и феруловой кислоты 1 мл/л, рН 5,8-6,0. Черенки культивировали при температуре 24-25 оС, освещенности 5-6 кЛк и продолжительности фотопериода 16 ч. Каждое последующее черенкование проводили через 14-20 дней [15].
Для экспериментов с растениями картофеля in vitro применяли концентрацию МИА 1 мМ. В пробирки с растениями картофеля добавляли МИА. Далее растения выдерживали 2 ч при комнатной температуре, после чего подвергали тепловому стрессу 39 оС в течение 2 ч. После тер-
с. Лукьяновский с. Луговской
26 26М 39 39М 26 26М 39 39М
Ы III 101 ------------
ШШ БТШ 17,6(1)
Рисунок. Синтез БТШ в картофеле in vitro. 26 - контрольные растения; 26М - растения, обработанные 1 мМ МИА; 39 - растения, обработанные при 39 °С (2 ч); 39М - растения, обработанные МИА и обработанные при 39 °С (2 ч). В среду роста растений картофеля in vitro (сорт Лукьяновский и сорт Луговской) добавляли 1 мМ МИА, выдерживали 1 ч, после чего обрабатывали при 39 °С (2 ч). Затем растение отмывали от МИА и определяли содержание БТШ. Представлены данные типичного эксперимента, n=3
мообработки производили выделение белка из растений по стандартной методике [16]. Количество белка определяли по методу Лоури [17]. Электрофорез в ПААГ проводили по модифицированной системе Лэммли [18], на приборе Mini-PRONEAN III Electrophoretic Cell фирма Bio-Rad (USA). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану («Sigma», США) проводили в специальном приборе для блоттинга («BIO-RAD», США). В работе использовали антитела против БТШ101 (Agrisera As 07253) и БТШ17,6 TTP 2 (Agrisera As 07255) класс I.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Ранее в наших исследованиях было показано, что МИА в концентрации 1 мМ снижал интенсивность поглощения кислорода и активность дегидрогеназ в клетках микроорганизмов Clavi-bacter michiganensis spp. sepedonicus (Cms) -палочковидная бактерия, вызывает заболевание, известное как кольцевая гниль картофеля [19] и дрожжах Saccharomyces cerevisiae, т.е. обладал бактерицидным и фунгицидным эффектом [9]. Причем, исследуемый агент не оказывал никакого влияния на прорастание клубней картофеля при обработке в различные периоды хранения [20]. Таким образом, МИА оказывал губительный эффект на активно делящиеся клетки микроорганизмов, но не влиял на клетки клубней картофеля, для которых характерен более замедленный метаболизм. Влияние МИА на жизнеспособность картофеля in vitro также не наблюдалось. В полевых экспериментах, проведенных в 2009-2011 гг. было показано повышение продуктивности картофеля после предпосадочной обработки клубней МИА [20], что может быть объяснено поверхностной дезинфекцией клубней и повышением содержания фитоаллек-синов в растительных клетках после обработки МИА [21].
В настоящей работе были изучены биохимические изменения, происходящие в организме растений после обработки МИА. Растения картофеля in vitro двух сортов Лукьяновский и Лу-
говской подвергали обработке 1 мМ водным раствором МИА, выдерживали 2 ч, после чего подвергали тепловому стрессу (39 оС, 2 ч), при котором происходит синтез БТШ. После тепловой обработки производили выделение белка. Результаты показали снижение БТШ в картофеле in vitro после обработки растений МИА (рисунок). По-видимому, обработка растений картофеля in vitro ингибитором привела к его проникновению в активно метаболизирующие клетки растения и вызвала подавление функционирования митохондрий клеток картофеля. Блокирование функционирования митохондрий препятствовало их участию в процессе митохондриальной ретроградной регуляции при тепловом стрессе растений (39 оС, 2 ч), в результате чего не синтезиро вались БТШ, обеспечивающие защиту растений при стрессе.
Ранее нами были проведены исследования по изучению влияния мИа на колонизацию растений картофеля in vitro сортов Лукьяновский и Луговской бактерией Cms - возбудителем кольцевой гнили картофеля [22]. Растения обрабатывали МИА, затем в среду культивирования растений вносили Cms. Спустя 2 сут. инкубации производили высев гомогената растений из корневой, стеблевой и верхушечной зон. Интенсивность колонизации растений патогеном оценивали по колониеобразованию (КОЕ). Результаты показали усиление колонизации растений патогеном, что, по-видимому, связано с ослаблением защитных реакций растений [22]. Однако было не ясно, чем обусловлен полученный эффект. Приведенные в настоящем исследовании результаты о снижении синтеза БТШ после обработки растений МИА позволяют предположить, что угнетение функционирования митохондрий растительной клетки после обработки МИА способствует повышению колонизации растений патогенными микроорганизмами.
Таким образом, представлены данные, полученные на модельной системе: картофель in vitro - монойодацетат натрия указывает, что ми-тохондриальные ингибиторы способны снижать
защитные барьеры растений. Данный эффект обусловлен нарушением митохондриальной ретроградной регуляции экспрессии генов, в частности, генов защитных белков, например, БТШ, поддерживающих гомеостаз растений при стрессах различной природы.
Из литературы известно, что применяемые на сегодняшний день пестициды являются устойчивыми соединениями и накапливаются в почве после обработки растений [3]. Учитывая представленные в настоящей работе данные, можно предположить, что оставшиеся в почве
пестициды могут поглощаться другими растениями, в результате чего будет усиливаться их колонизация патогенными бактериями и грибами, имеющимися в почве. Это будет способствовать повышению инфекционного фона. Поэтому для снижения экологического риска очень важно использовать химические агенты, которые, влияя на патогенную микрофлору, не загрязняли бы окружающую среду. Для этого необходимо использовать пестициды, быстро разлагающиеся после обработки на неопасные соединения.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИИ СПИСОК
1. Горбатов В.С., Матвеев Ю.М., Кононова Т.В. Экологическая оценка пестицидов: источники и формы информации // Агро XXI. 2008. № 1-3. С. 7-9.
2. Очистка природных и сточных вод от пестицидов / М.А. Шевченко [и др.]. Л.: Химия, 1989. 184 с.
3. Филатов Б.Н., Колодий Т.Н., Кононов В.М., Кононов М.В. Загрязнение хлорорганическими пестицидами сельскохозяйственных угодий и риск для здоровья населения Волгоградской области: материалы конф. «Национальный план действий по экологически обоснованному управлению диоксинами/фуранами и диоксиноподобными веществами». г. Санкт-Петербург, 2001. С. 245.
4. Защита растений от болезней: учебник. 2-е изд. / В.А. Шкаликов [и др.]. М.: Наука, 2005. 327 с.
5. Каталог средств защиты растений, 2011 (Электронный ресурс). Режим доступа: http : // www.agro. basf. ru
6. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков / Б.В. Анисимов [и др.]. М.: Картофелевод, 2009. 272 с.
7. Leroux P., Gredt M., Leroch M., Walker P. Exploring mechanisms of resistance to respiratory inhibitors in field strains of Botrytis cinerea, the causal agent of gray mold // Appl Environ Microbiol. 2010. V. 76, № 19. P. 6615-6630.
8. Справочник биохимика / Р. Досон [и др.]. М.: Мир, 1991. 543 с.
9. Влияние монойодацетата на термотолерантность Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus и дрожжей Sa^haromyces cerevisiaе /Е.В. Рымарева [и др.] // J. of Stress Physiology & Biochemistry. 2008. V. 4, № 2. P. 4-13.
10.Юрина Н.П., Одинцова М.С. Сигнальные системы митохондрий растений: ретроградная регуляция // Физиология растений. 2010. Т.57, № 1. С. 9-22.
11.Role of plant heat-shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response / W. Wang [и др.] // Trends Plant Sci. 2004. V.9, № 5. P. 244-252.
12.Characterization of a wheat HSP70 gene and its expression in response to stripe rust infection and abiotic stresses / Y.H. Duan [at all.] // Mol Biol Rep. 2011. V. 38, № 1. P. 301-307.
13.Induction of a small heat shock protein and its functional roles in Nicotiana plants in the defense response against Ralstonia solanacearum / M. Maimbo [at all.] // Plant Physiol. 2007. V.145, № 4. P. 1588-1599.
14.Сорта картофеля, возделываемые в России: 2010. Ежегодное справочное издание / Е.А. Симаков [и др.]. М.: Агроспас, 2010. 128 с.
15.Методические указания по получению вариантных клеточных линий и растений у разных сортов картофеля / Р.Г. Бутенко, Л.М. Хромова, Г.Г. Седнина. М.: ВАСХНИЛ, 1984. 28 с.
16.Методы изучения митохондрий растений. Полярография и электрофорез / Т.П. Побежимова [и др.]. М.: ООО « НПК «Промэкобезопасность», 2004. 98 с.
17.Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1957. V. 193. P. 265-275.
18.Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assemble of the head bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227, № 5259. P. 680-685.
19.Eichenlaub R., Gartemann K.H. The Clavibacter michiganensis subspecies: molecular investigation of gram-positive bacterial plant pathogens // Annu Rev Phy-topathol. 2011. V. 49. P. 445-464.
20.Перфильева А.И. Влияние теплового шока и монойодацетата натрия на взаимодействие Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus с картофелем: дис... канд. биол. наук. Иркутск, 2012. 152 с.
21.Inhibition of the hypersensitive reaction of soybean leaves to incompatible Pseudomonas spp. by blasti-cidin S, streptomycin or elevated temperature / N.T. Keen [at all.] // Physiology Plant Pathology. 1981. V. 18. P. 325-337.
22.Перфильева А.И., Рымарева Е.В. Действие монойодацетата натрия на колонизацию растений картофеля in vitro возбудителем кольцевой гнили // Защита и карантин растений. 2013. № 3. С. 49-50.
Поступило в редакцию 29 апреля 2013 г. После переработки 3 июня 2013 г.
