CC BY
36
© САМБУЕВА З.Г., МАЛХАНОВА Г.Н., ПАВЛОВ И.А., ГУЛЯЕВ С.М., МОНДОДОЕВ А.Г., НИКОЛАЕВ С.М., РАДНАЕВА Л.Д. — 2009
ВЛИЯНИЕ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ ПЕРХЛОЗОНА НА МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПЕЧЕНИ И ПОЧЕК У БЕЛЫХ КРЫС
З.Г. Самбуева, Г.Н. Малханова, И.А. Павлов, С.М. Гуляев, А.Г. Мондодоев, С.М. Николаев, Л.Д. Раднаева (Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, директор — д.б.н., проф. Л.Л. Убугунов, Бурятский институт природопользования СО РАН г. Улан-Удэ директор — чл.-корр. РАН, проф. А.К. Тулохонов)
Резюме. В настоящей работе приведены результаты исследования гепато- и нефропротекторного влияния ли-посомальной формы противотуберкулезного препарата перхлозон в дозе 20 мг/кг массы в экспериментах на белых крысах.
Ключевые слова: перхлозон, рыбий жир, печень, почки.
INFLUENCE OF LIPOSOMAL FORM OF PERKHLOZONE ON MORPHO-PHUNCTIONAL STATE OF WHITE RATS LIVER AND KIDNEYS
Z.G. Sambueva, Malkhanova G.L., Pavlov I.A., Gulyaev S.M., Mondodoev A.G., Nikolaev S.M., Radnaeva L.D.
(Institute of General and Experimental Biology SD RAS Ulan-Ude Buryat Institute of Nature Management SD RAS Ulan-Ude)
Summary. It is established that liposomal form of antituberculous medical preparation Perkhlozone displayed hepato- and nephroprotective activity on white rats in experimental condition.
Key words: liposomal form, Perkhlozone, morphofunctional condition, white rats.
В клинике туберкулеза проблема гепато-нефропатий приобретает большое значение, так как лечение больных туберкулезом требует длительного, непрерывного приема нескольких препаратов, чаще обладающих токсическим действием. В связи с этим, является актуальным поиск эффективных, но менее токсичных лекарственных форм. Для повышения эффективности лекарственных средств перспективным является использование их в липосомальной форме, что позволит улучшить селективность действия, а также снизить токсичность препаратов. Наряду с этим, введение в липосомы полиненасыщенных жирных кислот повышает биологическую активность препаратов.
Целью настоящей работы явилось определение гепато-и нефротоксичности липосомальной формы перхлозона — высокоэффективного противотуберкулезного препарата, разработанного в Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН совместно с Санкт-Петербургским НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ [8].
Материалы и методы
Фосфолипиды экстрагировали из яичных желтков по классическому методу Бо1Л et а1. [2, 11]. Липосомы получали из фосфолипидов с добавлением рыбьего жира в соотношении 2:3 [9] с использованием ультразвука. Опытным путем установлено, что оптимальное время ультразвуковой обработки составляет семь минут, при которой степень загрузки составляет 67%. Продолжительное ультразвуковое воздействие приводило к повышению температуры образцов, что отрицательно отражалось на качестве получаемых липосом, поэтому ультразвуковую обработку проводили с перерывами в три минуты через каждые две минуты. В работе использовали рыбий жир аптечный, который получают из печени тресковых рыб. О высоком качестве данного жира свидетельствовали результаты исследования некоторых его физико-химических свойств: высокое значение йодного числа, характеризующее высокую степень ненасыщенности жирно — кислотных цепей; низкое перекисное число отражает незначительную степень содержания перекисных соединений. Кислотное число характеризует содержание свободных кислот в рыбьем жире (табл. 1).
Таблица 1
Физико-химические показатели рыбьего жира
Показатель Характеристика
Цвет Запах Йодное число Перекисное число Кислотное число Число омыления Светло-желтый Специфический 161 0,05 1,8 190
При исследовании жирно- кислотного состава рыбьего жира методом газо-хромато-масс-спектрометрией было установлено содержание большого количнства непредельных жирных кислот, в частности, ш-3 и ш-6 кислот, что указывает на полиненасыщенность и высокую биологическую активность жира (табл. 2).
Таблица 2
Жирно-кислотный состав рыбьего жира
Кислоты Содержание, %
Пальмитоолеиновая С16:1п9 0,989±0,156
Пальмитоолеиновая (изомер) С16:1п7 0,958±0,183
Олеиновая С18:1п9 2,498±0,126
Вакценовая С18:1п7 0,938±0,066
Линоленовая С18:2п6 6,222±0,068
Y-линоленовая С18:3п6 1,930±0,049
а-линоленовая С18:3п3 2,155±0,048
Октодикатриеновая С18:3п4 1,754±0,089
Эйкозатриеновая С20:3п3 1.310+0.038
Эйкозапентаеновая С20:5п3 24,998±1,198
Эруковая С22:1п13 6,372±1,075
Докозапентаеновая С22:5п6 1,834±0,078
Y-докозапентаеновая С22:5п3 5,656±0,316
Докозагексаеновая С22:6п3 23,459±1,594
Генейкозаеновая С21:1 6,725±0,470
Сумма мононасыщенных жирных кислот 18,48
Сумма полиненасыщенных жирных кислот 72,16
Не определено 9,36
Эксперименты по оценке гепато- и нефротоксичности липосомальной формы проведены на белых крысах линии Wistar обоего пола с массой 180-200 г. На первом этапе исследовано гепатотоксическое действие липосомальной формы перхлозона, на втором — нефротоксическое.
Крысам контрольной группы вводили per os перхлозон в экспериментально-терапевтической дозе — 20 мг/кг массы один раз в сутки в течение двух недель. Вторая группа животных получала липосомальную форму перхлозона в дозе 20 мг/кг, а крысы третьей группы — незагруженные липосомы по аналогичной схеме. Животным интактной группы вводили эквиобъемное количество очищенной воды. На первом этапе для оценки гепатотоксичности испытуемых средств определяли у наркотизированных тио-пентал — натрием (40 мг/кг) крыс скорость секреции желчи в течение 4 часов, общее количество выделенной желчи, а также содержание в желчи основных ее ингредиентов: билирубина [10], желчных кислот и холестерина [7]. В сыворотке крови определяли активность трансаминаз, содержание билирубина и холестерина [5]. Для оценки нефро-токсичности испытуемых средств у животных определяли диурез по общепринятому методу с 2,5 % водной нагрузкой [1]; депурационную функцию почек оценивали по содержа-
Таблица 4
Влияние перхлозона и его липосомальной формы на биохимические показатели сыворотки крови у белых крыс
Группы животных Показатели
АсАТ, ед/л АлАТ, ед/л Били-рубин, ммоль/л Холестерин, ммоль/л
Интактные (Н2О) 99,3±9,2 103,0±10,4 5,0±0,3 1,5±0,1
Перхлозон 172,3±11,8 135,0±18,0 6,4±0,4 2,46±0,07
Перхлозон в липосомальной форме 140,0±9,4 145,2±14,0 5,0±0,4* 2,02±0,06*
Липосомы 153,6±14,6 124,3±9,3 5,5±0,6 2,13±0,05*
нию креатинина в сыворотке крови, а также определяли содержание мочевины в сыворотке крови, в моче - белка [5] и скорость клубочковой фильтрации — по клиренсу эндогенного креатинина [3]. Для патоморфологических исследований кусочки печени фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, готовили срезы, которые окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван Гизону. Часть кусочков печени замораживали, готовили срезы и окрашивали для определения содержания липидов, гликогена, а также активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и лактатдегидроге-назы (ЛДГ) по Нахласу [4, 6].
Результаты и обсуждение
В результате проведенных исследований установлено, что у крыс, получавших чистый перхлозон , на 14 сутки опыта скорость секреции желчи снижалась на 25-31% соответственно на 2-4 часы наблюдения. Суммарное содержание желчных кислот в желчи снижалось на 18,5%, что свидетельствовало об угнетении синтетической функции печени. Под влиянием перхлозона уменьшалось содержание билирубина в желчи на 13% (табл. 3). Кроме того, в сыворотке крови повышалась активность аспартатаминотрасферазы (АсАТ) в 1,5 раза, аланинаминотрансферазы (АлАТ) - на 31%, повышалось содержание билирубина — на 28%, холестерина — на 64%, мочевины — на 34% и креатинина — на 68% (табл.4).
Курсовое введение крысам липосомаль-ной формы перхлозона ограничивало вышеуказанные нарушения желчеобразовательной и желчевыделительной функции печени. В частности, скорость секреции желчи превышала таковую у крыс контрольной группы на 10, 25, 38 и 21% соответственно за 1 — 4 часы наблюдения.
Концентрация желчных кислот в желчи сохранялась практически на уровне у интакт-ных крыс. Более того, липосомальная форма перхлозона оказывала стимулирующее влияние на секрецию билирубина с желчью, концентрация которого превышала таковую у животных контрольной группы в 1, 5 раза (табл. 3). При исследовании биохимических показателей сыворотки крови установлено, что у крыс, получавших липосомальную форму перхлозона при сравнении с таковыми у крыс контрольной группы, содержание билирубина было ниже на 22%, холестерина — на
18%, мочевины — на 33% и креатинина — на 31% (табл. 4, 5).
При патоморфологическом исследовании установлено, что в печени у крыс, получавших чистый перхлозон, наблюдаются умеренно выраженные гемодинами-ческие нарушения, отек и инфильтрация печени лейкоцитами, находили участки из гепатоцитов с выраженной гидропи-ческой, зернистой и жировой дистрофией, а также обнаруживались микроочаги со скоплениями некротизированных гепатоцитов, активность СДГ и ЛДГ была снижена. У животных, получавших перхлозон в липосомальной форме, изменения в печени были менее выраженными. Лишь в единичных случаях встречали клеточную инфильтрацию, очаги с гепатоцита-ми, подверженными зернистой дистрофии, гликоген находили в клетках печени в пылевидном состоянии, отсутствовали признаки жировой дистрофии, активность СДГ и ЛДГ была выражена.
Результаты оценки нефротоксичности исследуемых средств приведены в таблице 5, из которой следует, что чистый перхлозон в указанной дозе вызывает повышение уровня креатинина на 68%, мочевины — на 34% ,сниже-ние диуреза — на 34%, скорости клубочковой фильтрации (СКФ) — на 38% и повышение содержания белка в моче — на 51%. У крыс, получавших липосомальную форму перх-лозона, наблюдали менее выраженное нефротоксическое влияние: уровни креатинина и протеинурии были на 31% и 33% соответственно ниже, а диурез и скорость клубочковой фильтрации — на 42,5% и 29% выше чем у крыс контрольной группы. У животных, получавших липосомы, признаков нефротоксического влияния не выявлено.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что липосомальная форма перхлозона не оказыва-
Таблица 5
ет выраженного токсического влияния на печень и почки, липосомы на основе рыбьего жира предотвращают токсическое влияние самой субстанции. Гепато — и нефро-протекторное влияние липосомальной формы перхлозона обусловлено реконструктивными свойствами ненасышен-ных жирных кислот, содержащихся в рыбьем жире и особенно с пятью и шестью двойными связами, которых нет в животных жирах и растительных маслах.
Влияние перхлозона и его липосомальной формы на функциональные показатели почек
Показатели Группы животных
Интактные (Н2О) Перхлозон Перхлозон в липосомальной форме Липосомы
Диурез, мл/100 г/ч 0,637±0,039 0,416±0.025 0,593±0,037* 0,645±0,034*
Белок в моче, г/л 1,89±0,13 2,86±0,17 2,14±0,12* 1,98±0,08*
Креатинин в сывор. крови, ммоль/л 46,03±1,73 77,30±4,76 52,90±4,23* 46,03±3,45*
Мочевина, ммоль/л 5,8±0,3 7,8±0,6 5,2±0,2* 5,2±0,3*
СКФ, мл/кг/мин 1,73±0,09 1,07±0,09 1,51±0,11* 1,79±0,12*
ЛИТЕРАТУРА
1. Берхин Е.В., Иванов Ю.И. Методы экспериментального исследо- 2. Биохимия. Практикум для студентов университетов / Под
вания почек и водно-солевого обмена. — Барнаул. — 1972. — 156 с. редакцией Асатиани Н. — М.: МГУ 1989. —
Таблица 3
Влияние перхлозона и его липосомальной формы на скорость секреции и биохимический состав желчи
Группы животных Скорость ч секреции асов, мг/м желчи в т ин на 100 ечение 4 Общее количество желчи за 1-4 часы мг/100 г Желчные кислоты Билирубин Холестерин
1 ч 2 ч 3 ч 4 ч мг%
Интатные (Н.О) 8,1±0,8 8,6±0,2 7,7±0,5 7,5±0,6 1914±96 461,7 15,0 34,40
Перхлозон (контроль) 7,0±0,4 6,4±0,5 5,5±0,3 5,2±0,6 1451±125 376,2 13,0 34,65
Перхлозон в липосомальной форме 7,7±0,4 8,0±0,4* 7,6±0,6* 6,3±0,3* 1776±62* 444,6 20,0 34,70
Липосомы 7,6±0,6 7,5±0,5 7,7±0,3* 8,0±0,5* 1848±81* 490,2 15,0 35,15
Примечание: * — означает, что здесь и в таблицах 4, 5 различия значимы по отношению к контролю при р<0,05.
3. Вандер А. Физиология почек. — Спб. — Изд-во “Питер”, 2000. — 256 с.
4. Волкова О.Е., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. — М. — 1982. — 304 с.
5. Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник/Под ред. В.В.Меньшикова. — М.: Медицна, 1987. — 368 с.
6. Микроскопическая техника. Руководство для врачей и лаборантов. — М.: Медицина, 1996. — 544 с.
7. Мирошниченко В.П., Громашевская Л.Л., Касаткина М.Г.,
Козачек Г.А. Определение содержания желчных кислот и холестерина в желчи// Лаб. дело. — 1978. — № 3. — С. 149-153.
8. Патент РФ на изобретение № 1621449 от 25. 10. 1993 г.
9. Патент РФ на изобретение № 2153328. Способ получения липосом. Тыхеева Н.А., Ламажапова Г.П., Жамсаранова С.Д. Опубл. 27 июля 2000 г.
10. Скакун Н.П. Нейрогуморальный механизм желчегонного действия инсулина// Проблемы эндокринологии. — 1956. — № 6. — С. 75-78.
11. Bangham A.D., Horne R.W. // J. Mol. Biol. — 1964. — 8. — P. 660-668.
Адрес для переписки: б70047, Улан-Удэ, ул. Caxьяновой, б
© ИСАЕВА Е.Н., ИСАЕВ Ю.С., СЕМИНСКИЙ И.Ж. — 2009
СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКАЯ ОЦЕНКА ПОПУЛЯЦИОННЫХ ЧАСТОТ АЛЛЕЛЕЙ ЛОКУСОВ D16S539( ^01, D3S51358 У
БУРЯТСКОГО НАСЕЛЕНИЯ ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ
Е.Н. Исаева, Ю.С. Исаев, И.Ж. Семинский (Иркутский государственный медицинский университет, ректор — д.м.н., проф. И.В. Малов, кафедра судебной медицины и медицинского права, зав. — д.м.н., проф. Ю.С. Исаев, кафедра биологии с курсом медицинской генетики, зав. — д.б.н., проф. А.А. Майборода)
Резюме. Широкое применение молекулярно-генетических методов для идентификации личности выявило определенные трудности, связанные с применением стандартов типирования, разработанных для европейской расы. В данной работе показано несоответствие идентификационных локусов Российского стандарта и локусов, выявленных у популяции бурят, проживающих на территории Восточной Сибири. В частности, в исследуемом ло-кусе D3S51358 среди бурят самыми частыми являются аллели 15 и 16, причем частота аллеля 15 почти в два раза превышает рекомендованные данные. Существенная разница отмечается также и в аллелях 14, 17,18. Аллельные формы 19,20 среди бурят нами зарегистрированы не были.
Ключевые слова: молекулярно-генетическое типирование, буряты Восточной Сибири.
CRIMINALISTIC ANALYSIS OF THE ALLEL LOCUSES D16S539, TH01, D3S51358 IN THE BURYAT POPULATION OF EAST SIBIRIA
E. Isaeva, Y. Isaev, I. Seminskii (Irkutsk State Medical University)
Summary. 117 aborigines of East Sibiria were examined by PCR-method (allel locuses D16S539, TH01, D3S51358). In the result, there is difference between allel locuses D16S539, TH01, D3S51358 aborigines of East Sibiria and Europe population:
Key words: ciminalistic analysis, allel locuses, East Siberia.
Одним из наиболее доказательных методов изучения биологического материала при судебно-медицинских исследованиях является метод молекулярно-генетического идентификационного анализа, в основе которого лежит феномен полиморфизма длин амплифицированных фрагментов ДНК. В качестве маркерных элементов при изучении генома человека, в частности, в экспертной практике при идентификации личности и установлении кровного родства, используются генетические локусы главным образом микро-сателлитной природы, во множестве представленные в геноме человека, обладающие высоким уровнем полиморфизма длины [5,6]. Для того, чтобы определить индивидуализирующее значение выявленного геномного профиля, нужно определить его распространенность в популяции. От частотных характеристик индивидуального аллельного спектра зависит окончательная интерпретация результатов и формулировка вывода эксперта [2,3].
На практике для оценки полученных результатов пользуются базовыми данными, приводимыми фирмой производителем реагентов используемых в исследованиях или рекомендациями, появившимися в публикациях отечественных производителей [4]. Однако общеизвестно, что наиболее эффективного и объективного использования возможностей типирования того или иного локуса можно достичь, если интерпретация результатов будет происходить с учетом региональной частоты встречаемости у населения аллелей и генотипов [1,9]. Причем, чем ближе соответствие популяционных данных распределению аллелей в регионе, обслуживаемом судебно-медицинской лабораторией, тем выше достоверность результатов генетических исследований.
В частности, территорию Восточной Сибири населяет обширная и довольно изолированная популяция бурят. Многие исследователи рассматривали бурят как единое целое или как «этнический конгломерат», спаянный общими интересами и общностью культуры. Среди бурят распространена легенда о происхождении трех основных племен Прибайкалья от легендарных предков — Булагата, Эхирита и Хоредоя, а основной массы родов — от их сыновей и внуков. Все остальные родоплеменные группы считаются более поздними пришельцами. У родовых отношений была важная функция — функция регулирования семейно-брачных отношений, продолжения рода, что было связано с целой серией сложных обрядов, определенной системой родства, запретов и табу.
В прошлом у бурят и их предков существовала так называемая кольцевая система родства: мужчина из рода А, взявший жену из рода Б, уже не имел права выдать свою сестру в этот род замуж. Следовательно мужчина из рода Б должен искать себе жену а третьем роде В, а мужчина из рода В мог жениться на женщине из рода А. Кольцевая триада — сложное и противоречивое образование: с одной стороны, это закрытая система — для ее существования достаточно трех родов, с другой — открытая, так как основана на однонаправленном характере родства, в котором зять — всегда чужой человек, хурыген (в буквальном переводе — «сосед по ограде», т.е. представитель чужого рода), с которым данный род может вступать в родство, отдавать в этот род своих женщин. Брать же жен можно только в роду тестя, тоже из чужого рода. Следовательно, любой чужой род в данной системе мог оказаться родом или тестя, или зятя. При разделении рода существовал специальный обряд, сохранившийся до начала ХХ века.
