Влияние лекарственных препаратов на состояние тромбоцитарного гемостаза у лабораторных животных Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© Коллектив авторов, 2011 УДК 616.151.5/618.507

ВЛИЯНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА СОСТОЯНИЕ ТРОМБОЦИТАРНОГО ГЕМОСТАЗА У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

Т. П. Бондарь, Г. Ю. Шаталова, А. Ю. Муратова Ставропольский государственный университет

Известно, что участие тромбоцитов (Тр) в гемостазе определяется их способностью к адгезии у места повреждения эндотелия, к агрегации и образованию первичной тромбоцитаной пробки, а также их способностью поддерживать спазм сосудов путем секреции вазоактивных веществ (адреналина, норадреналина, серотонина, АДФ и др.) [7]. В значительной степени механизм агрегации тромбоцитов стал понятен после открытия простагландинов в тромбоцитах и сосудистой стенке. Различные агрегирующие агенты активируют фосфолипазу А2, которая вызывает отщепление от фосфолипидов арахидоновой кислоты -мощного агрегирующего вещества. Под влиянием простагландинсинтетазы образуются циклические эндоперекиси простагландинов, стимулирующие в тромбоцитах сокращение фибрилл и оказывающие мощное агрегирующее действие [2].

В настоящее время описаны патологические состояния и некоторые лекарственные препараты, которые вызывают дисбаланс в системе свертывания крови. Так, снижение агрегации наблюдается при лечении антиагрегантами (аспирин, другие нестероидные противовоспалительные средства, клопидогрель)[2]. Повышение агрегационной активности тромбоцитов характерно для беременности [1, 8]. Тромбогеморрагические нарушения являются частым осложнением тяжелых форм неонатальной патологии и одной из непосредственных причин смертности в этом периоде [8]. Несмотря на актуальность проблемы, резервные возможности системы гемостаза матери и плода исследованы недостаточно. При этом отсутствие однозначных критериев оценки, невозможность проведения исследований на беременных женщинах, плодах и новорожденных детях послужили основанием для изучения влияния лекарственных препаратов на морфофункциональное состояние тромбоцитов в эксперименте.

Целью исследования явилось изучение влияния лекарственных препаратов на морфофункциональную активность тромбоцитов у лабораторных животных.

Бондарь Татьяна Петровна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой физико-химических основ медицины и клинической лабораторной диагностики Ставропольского государственного университета, тел.: (8652)355068; e-mail: tatiana_bond_st@mail.ru.

Шаталова Галина Юрьевна, соискатель кафедры физико-химических основ медицины и клинической лабораторной диагностики Ставропольского государственного университета, ассистент кафедры клинической фармакологии, микробиологии, аллергологии и иммунологии ИПДО Ставропольской государственной медицинской академии, врач аллерголог-иммунолог Ставропольского краевого клинического кожно-венерологического диспансера, тел.: 436475.

Муратова Анна Юрьевна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры физико-химических основ медицины и клинической лабораторной диагностики Ставропольского государственного университета; тел. 89624549042.

Материал и методы. Для достижения поставленных задач были выбраны белые крысы линии Вистар. Обследовано 30 беременных крыс, из них - 3 взрослые небеременные самки, 9 - здоровых беременных самок с нормально протекающей беременностью, 9 - получавших кардиомагнил и 9 - получавших метионин. Исследование проводилось за 1 сутки до родов, в день родов и через 5 дней после родов.

В качестве лекарственных препаратов, влияющих на морфофункциональное состояние тромбоцитов, были выбраны кардиомагнил и метионин. Основной механизм антиагрегантного действия аспирина, входящего в состав кардиомагнила, заключается в ингибировании циклооксигеназы [2]. Аспирин назначали в суточной дозе, рассчитанной с учетом массы животного, после установления факта наличия беременности.

Из числа препаратов, способствующих микротром-бообразованию и нарушению микроциркуляции, был выбран метионин, являющийся одной из незаменимых аминокислот. Продуктом превращения метионина является гомоцистеин, избыток которого накапливается в организме и обладает токсическим воздействием на клетку. Гипергомоцистеинемия приводит к повреждению и активации эндотелиальных клеток, выстилающих кровеносные сосуды, что значительно повышает развитие тромбозов [1,8]. Метионин назначали с учетом массы тела животного, на фоне ограничения питьевого режима.

Белые крысы линии Вистар на 34 сутки после спаривания и установления наличия беременности известным способом получали кардиомагнил и метионин, растворенные в суточном объеме воды, в течение всей беременности. Кровь у животных брали из хвостовой вены. Правомерность использования этих животных обусловлена наибольшим интересом к гемохо-риальной плацентации грызунов как наиболее близкой к плацентации человека [3].

Для оценки состояния тромбоцитарного гемостаза проводили изучение количественных и функциональных тромбоцитарных показателей периферической крови. Определяли длительность кровотечения по Дьюку. С помощью автоматического анализатора фирмы «АЫЫоН» США, анализировали Р^Г - количество тромбоцитов, - средний объем тромбоцитов, РСТ - тромбокрит. Функциональные параметры определялись по скорости и степени агрегации с индукторами АДФ (200мкМ), высвобождающимся из поврежденных клеток, коллагеном (0,2 мг/мл) и ристо-мицином (5 мкМ/мл) [8]. Исследование агрегационной активности тромбоцитов проводилось с помощью лазерного агрегометра модель БИОЛА LA230 (Россия).

Для исследования архитектоники Тр в мазках крови методом автоматизированной КЦТр была использована компьютерная морфометрическая установка МЕКОСЦ (ЗАО «Медицинские компьютерные системы» г. Москва) [6,10].

Были проанализированы следующие морфометрические характеристики Тр: площадь клетки, средний диаметр, фактор формы, характеризующий образова-

ние псевдоподий, удельная оптическая плотность по зеленой компоненте, свидетельствующая о степени насыщенности Тр гранулами, т. е. об их функциональной активности, доля синего цвета и доля красного цвета в препарате [5,6,10].

Доли синего и красного цветов в препарате отражают возраст Тр. Увеличение доли синего цвета указывает на появление большого количества молодых форм Тр, доли красного цвета - более старых [8]. Для оценки «степени омоложения» Тр рассчитывался индекс омоложения Тр (ИОТр), т. е. отношение доли синего цвета в препарате к доле красного. Повышение ИОТр свидетельствует об увеличении количества «молодых», активных форм Тр в периферической крови, снижение - об увеличении старых форм Тр [8].

Для получения достоверной информации при исследовании Тр методом КЦТр измеряется не менее 500 клеток на один препарат [5,10].

Статистическую обработку данных проводили с использованием методов параметрического анализа и пакета Microsoft Excel. Определялись следующие статистические параметры: среднее (Х), ошибка среднего (м) и стандартное отклонение (5). Достоверность различия средних определяли по критерию Стьюдента (t) для коэффициентов вариации, уровень значимости р выбран менее 0,05.

Результаты и обсуждение. В результате статистического анализа полученных в эксперименте данных установлены некоторые закономерности.

Длительность кровотечения увеличивается при применении кардиомагнила за счет угнетения функций тромбоцитов, что подтверждается показателями количества, объема и показателями агрегации Тр, а при введении метионина происходят противоположные изменения. Так, отмечается увеличение длительности кровотечения на фоне применения кардиомагнила с 6 мин. 50 сек. до 8 мин. 28 сек. и уменьшение - на фоне применения метионина - до 5 мин. 55 сек.

Изменение длительности кровотечения послужило основанием для изучения морфофункционального состояния тромбоцитовубеременныхкрыс при созданных моделях гипер- и гипокоагуляции. Оценивали изменение количества тромбоцитов, среднего объема клетки, тромбокрита и агрегации экспериментальных животных в группах здоровых небеременных и беременных самок в разные сроки течения беременности. Достоверных различий показателей активности тромбоцитов крови небеременной крысы и беременной самки в дородовый период не наблюдалось. Повышение активности тромбоцитов отмечалось в первые сутки после родов, что свидетельствует об изменении коагуляционного потенциала в период родовой деятельности. При этом в крови крыс в день родов определялось достоверное увеличение количества и среднего объема Тр, а также

усиление их функциональной активности: увеличение агрегации с индуктором АДФ по сравнению с данными на 5 день после родов, что является подтверждением адаптационных изменений системы гемостаза при физиологическом течении беременности. В послеродовом периоде рассматриваемые выше показатели имеют тенденцию приближения к дородовым показателям, сохраняя склонность к гиперкоагуляции.

При моделировании усиленного тромбообразова-ния с помощью назначения метионина и снижения питьевого режима у беременных самок крыс в условиях гиперкоагуляции отмечалось достоверное увеличение количества, среднего объема тромбоцитов и тромбокрита в дородовом периоде, в родах и на 5-е сутки после родов. Также отмечалось усиление агрегации со всеми индукторами в период родов. Полученные данные представлены в таблице 1.

Как видно из данных таблицы, у беременных самок крыс, получавших метионин с целью усиления тром-бообразования, отмечалось увеличение морфофункциональных показателей в сравнении с данными у здоровых беременных крыс, проявляющееся в росте среднего объема, количества тромбоцитов, тромбокрита, показателей агрегации с АДФ, ристомицином и коллагеном при сохранении пика гиперкоагуляции в период родов. В послеродовом периоде отмечается тенденция к снижению гиперкоагуляции. Клинически у самок крыс, получавших метионин, отмечались сгущение крови и склонность к тромбозам. У двух самок крыс было отмечено замирание беременности. В послеродовом периоде обсуждаемые показатели имеют тенденцию к приближению к дородовым.

При создании модели кровоточивости с помощью назначения кардиомагнила у беременных самок крыс отмечались противоположные изменения в виде достоверного уменьшения количества, среднего объема тромбоцитов и показателей агрегации.

Как видно на таблице 2, у беременных самок крыс, получавших кардиомагнил с целью усиления текучести крови для создания модели гипокоагуляции, отмечалось достоверное снижение морфофункциональных показателей тромбоцитов: уменьшение размера, количества тромбоцитов и агрегации со всеми индукторами. Клинически у данных самок крыс отмечались явления тромбофилии.

Представленные выше закономерности изменения количественных и функциональных параметров Тр самок крыс позволили предположить изменения их архитектоники и ультраструктуры в зависимости от состояния гемостаза. Для этого исследовали морфометрические характеристики Тр методом КЦТр. Полученные результаты при моделировании усиленного тромбообразования по сравнению с данными здоровых беременных крыс представлены в таблице 3.

Таблица 1

Морфо-функциональные показатели Тр в экспериментальной группе самок крыс с усиленным тромбообразованием

Показатели До родов Роды 5-е сутки после родов

здоровая беременная крыса получающая метионин здоровая беременная крыса получающая метионин здоровая беременная крыса получающая метионин

PLT, 109 449,2±23 533,8±27* 568,2±28 692,4±35** 488,4±24 565,2±28***

MPV, fl 7,1 ±0,4 8,4±0,4* 8,6±0,4 9,1±0,5 6,6±0,3 6,9±0,4

РСТ, % 0,347±0,02 0,416±0,02* 0,39±0,02 0,47±0,02** 0,35±0,02 0,40±0,02

Агрегация с АДФ, % 4,38±0,24 6,06±0,3* 4,89±0,2 6,73±0,3** 4,61±0,2 5,91±0,3***

С ристомицином, % 11,06±0,2 17,64±0,85* 12,01±0,8 18,24±0,9** 11,01±0,7 17,14±0,8***

С коллагеном, % 6,79±0,3 12,74±0,4* 6,98±0,4 13,01±0,4** 6,84±0,4 12,96±0,4***

Примечание: * р<0,01 до родов; ** р<0,01 в день родов; *** р<0,01 на 5-е сутки после родов

Таблица 2

Морфо-функциональные показатели Тр и показатели агрегации в группе самок крыс при кровоточивости

Показатели До родов Роды 5-е сутки после родов

здоровая беременная крыса получающая кардиомагнил здоровая беременная крыса получающая кардиомагнил здоровая беременная крыса получающая кардиомагнил

PLT 449,2±23 386,9±19* 568,2±28 485,1±24** 488,4±24 419,1±21***

MPV 7,1±0,4 6,32±0,3 8,6±0,4 6,9±0,4** 6,6±0,3 6,3±0,3

РСТ 0,347±0,02 0,312±0,02 0,39±0,02 0,35±0,02 0,35±0,02 0,314±0,02

Агрегация с АДФ 4,38±0,24 3,85±0,1* 4,89±0,2 3,77±0,2** 4,61±0,2 3,91±0,2***

С ристомицином 11,06±0,2 8,89±0,58* 12,01±0,8 9,84±0,6** 11,01±0,7 9,07±0,5***

С коллагеном 6,79±0,3 5,94±0,3* 6,98±0,4 6,0±0,2** 6,84±0,4 5,69±0,2***

Примечание: * р<0,01 до родов; ** р<0,01 в день родов; *** р<0,01 на 5-е сутки после родов

Таблица 3

Морфометрические показатели Тр в группе самок крыс с усиленным тромбообразованием

Показатели До родов Роды 5-е сутки после родов

здоровая беременная крыса получающая метионин здоровая беременная крыса получающая метионин здоровая беременная крыса получающая метионин

Средний диаметр Тр, мкм 2,50±0,12 3,79±0,2* 1,85±0,09 2,2±0,1** 1,74±0,09 1,93±0,1

Площадь Тр, мкм 4,9±0,24 5,9±0,2* 3,0±0,15 3,8±0,2** 2,4±0,1 2,9±0,1***

Фактор формы 13,60±0,67 17,6±0,9* 14±0,7 14,1±0,7 18,7±0,8 11,7±0,6***

УОП кр 0,621±0,03 0,71±0,03* 0,368±0,02 0,388±0,4 0,357±0,02 0,377±0,01***

УОП син 0,249±0,01 0,299±0,09 0,289±0,01 0,28±0,01** 0,253±0,01 0,276±0,01**

ИОТр 0,4±0,02 0,42±0,02* 0,78±0,04 0,72±0,01 0,7±0,02 0,73±0,03***

Примечание: * р<0,01 до родов; ** р<0,01 в день родов; *** р<0,01 на 5-е сутки после родов

Отмечено достоверное увеличение клетки в размере, увеличение фактора формы, т. е. усиление изре-занности краев Тр за счет образования псевдоподий. Повышение значений таких показателей как средний диаметр, площадь и фактор формы тромбоцитов свидетельствует об активации тромбоцитарного звена гемостаза. Также достоверно увеличивается насыщение Тр гранулами, что проявляется в увеличении УОП кр и, следовательно, достоверно увеличивается ИОТр, характеризуя увеличение «молодых» форм Тр и их функциональной активности.

Аналогичные параметры оценивались в группе самок крыс, получавших кардиомагнил с целью создания модели гипокоагуляции (при кровоточивости). Отмечалось уменьшение среднего диаметра, площади Тр, фактора формы, характеризующего изрезан-ность краев Тр и степень его реактивности, способность активироваться и распластываться на стекле. Также отмечалось достоверное уменьшение насыщения Тр гранулами, что проявляется в снижении УОП кр и уменьшении ИОТр, свидетельствуя об уменьшении доли «молодых» активных форм клеток.

Заключение. Установлено, что введение животному препаратов кардиомагнила и метионина позволяет выявить общие закономерности на модели гипо- и гиперкоагуляции в эксперименте у лабораторных животных. Так, при введении кардиомагнила происходит угнетение функции тромбоцитов, что подтверждается уменьшением количества, среднего объема тромбоцитов и их агрегации, морфометрических свойств, а при введении метионина происходят противоположные изменения. Изменения наблюдались в дородовый период, в первые сутки после родов, сохранялись на 5-й день после родов, но отмечена тенденция к восстановлению исходных показателей в послеродовом периоде. Во всех группах отмечался «пик 1-го дня».

Причём, в группе самок крыс с патологией гемостаза пик выражен сильнее, чем в группе здоровых беременных крыс.

У беременных самок крыс, получающих кардиомагнил, определялись клинические признаки тромбо-филии, что подтверждалось снижением агрегации со всеми индукторами, а при введении метионина беременным самкам отмечались явления гиперкоагуляции, что клинически проявлялось сгущением крови, склонностью к тромбозам и подтверждалось увеличением агрегации со всеми индукторами.

В условиях гиперкоагуляции (метионин) индекс омоложения Тр увеличивается, что свидетельствует о повышенной склонности к тромбозам. В условиях гипокоагуляции (кардиомагнил) отмечается уменьшение ИОТр, т. е. доли активных форм Тр, что клинически подтверждается кровоточивостью.

Лабораторный контроль показателей тромбоцитов во время беременности и в раннем постнатальном периоде может быть использован для оценки риска возникновения тромбогеморрагических осложнений и поиска путей их устранения.

Литература

1. Арутюнян, А. А. Сравнительная оценка гемостаза у женщин с антифосфолипидным синдромом в зависимости от проводимой терапии / А. А. Арутюнян // Врач. - 2007. - № 7. - С. 63-65.

2. Баркаган, З. С. Основы диагностики нарушений гемостаза / З. С. Баркаган, А. П. Момот. - М, 1999. -224 с.

3. Бондарева, Н. И. Морфофункциональные особенности развития потомства сенсибилизированных самок крыс: автореф. дис. ... канд. мед. наук / Н. И. Бондарева. - Ставрополь, 2008. - 22 с.

4. Иванова, Т. В. Клиническое значение компьютерной морфометрии тромбоцитов при хроническом

мегакариоцитарном лейкозе: автореф. дис. ... канд.мед.наук / Т. В. Иванова. - М., 2002. - 27 с.

5. Козинец, Г. И. Клетки крови, современные технологии их анализа / Г. И. Козинец [и др]. - М, 2002. -534 с.

6. Коробова, Ф. В. Анализ тромбоцитов периферической крови компьютерная морфометрия / Ф. В. Коробова [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. - 2000. - № 7. - С. 36-39.

7. Мацакария, А. Д. Тромбофилии и противотром-биотическая терапия в акушерской практике / А. Д. Мацакария. - М., 2003. - С. 144-159.

8. Муратова, А. Ю. Диагностика тромбофилических состояний в акушерской практике / А. Ю. Муратова. - Ставрополь, 2008. - С. 118-121.

9. Муратова, А. Ю. Состояние тромбоцитарного звена гемостаза у больных с сосудистыми осложнениями сахарного диабета 2 типа при развитии анемического синдрома: автореф. дис. ... канд.мед. наук / А. Ю. Муратова. - Саратов, 2004. - 26 с.

10. Korobova, F. V. Morphological properties of human thrombocytes / F. V. Korobova, G. I. Kozinets // A com-puteriezed morphometric cellular pathology. - 2001. -Vol. 20, № 7. - Р. 60-61.

ВЛИЯНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА СОСТОЯНИЕ ТРОМБОЦИТАРНОГО ГЕМОСТАЗА У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

Т. П. БОНДАРЬ, Г. Ю. ШАТАЛОВА,

А. Ю. МУРАТОВА

В статье предпринята попытка изучить влияние лекарственных препаратов на морфо-функциональную активность тромбоцитов у лабораторных животных с целью создания экспериментальных моделей гипо-и гиперкоагуляции. В качестве лекарственных препаратов, влияющих на морфо-функциональное состояние тромбоцитов, были выбраны кардиомагнил и метионин. Определялись интенсивность тромбоцито-поэза (определение количества тромбоцитов), функции тромбоцитов (размеров тромбоцитов, агрегации), степени зрелости (морфометрические характеристики). Установлены закономерности изменения количественных и функциональных параметров тромбоцитов у лабораторных животных при развитии тромбогеморрагических нарушений.

Ключевые слова: тромбоцит, тромбогеморрагические нарушения, агрегация, лабораторные животные, модель гипокоагуляции, модель гиперкоагуляции

DRUGS INFLUENCE THROMBOCYTE HEMOSTASIS IN EXPERIMENTAL MODELS

BONDAR T. P, SHATALOVA G. U,

MURATOVA A. U.

The aim was to study the influence of drugs on morphofunctional activ-ity of thrombocytes. Cardiomagnil and methionine were used to create the experi-mental models of hyper- and hypocoagulation in 30 pregnant white rats of Wistar line in the antenatal and early postnatal period. Intensity of thrombocytopoiesis, platelets functions and maturity were investigated.

The general patterns of platelets quantitative and functional parameters dynamics and risk of thrombotic and hemorrhagic com-plications in pregnancy were defined.

Key words: thrombocyte, thrombotic and hemorrhagic com-plications, aggrega-tion, laboratory animals, hypocoagulation and hypercoagulation models

© Коллектив авторов, 2011

УДК 611.13/.14: 611.98] - 073.48 - 053.7/.8

ХАРАКТЕРИСТИКА СОСУДОВ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ, ПО ДАННЫМ УЗИ, У ДЕВУШЕК РАЗЛИЧНЫХ СОМАТОТИПОВ

Е.В. Чаплыгина1, О.А. Каплунова1, А.И. Шульгин1, Е.С. Макаренко2

1 Ростовский государственный медицинский университет

2 ООО «Кардиоцентр», Ростов-на-Дону

Чаплыгина Елена Викторовна, доктор медицинских наук, доцент, заведующая кафедрой нормальной анатомии Ростовского государственного медицинского университета; тел.: (863) 2504037, 89034018705; e-mail: chaplygina@aaanet.ru

Каплунова Ольга Антониновна, доктор медицинских наук, профессор кафедры нормальной анатомии Ростовского государственного медицинского университета, тел.: (863) 2504037, 89054528060; e-mail: kaplunova @bk.ru

Шульгин Антон Иванович, аспирант кафедры нормальной анатомии Ростовского государственного медицинского университета; тел.: (863) 2504037, 89043413888; e-mail: medshai@rambler.ru

Макаренко Елена Сафроновна, кандидат медицинских наук, врач ультразвуковой диагностики ОоО «Кардиоцентр», г. Ростов-на-Дону, тел.: (863) 2100500

В Ростовском государственном медицинском университете в течение многих лет проводится работа по изучению индивидуально-типологических особенностей жителей южного региона России с использованием метрической схемы Р. Н. Дорохова и В. Г. Петрухина [4]. Эта схема позволяет оценить индивидуально-типологические особенности популяции в возрастном аспекте, апробирована в педагогической и клинической практике [7, 12].

Заболевания вен нижних конечностей являются распространенным патологическим состоянием человека. Тромбоз глубоких вен, хроническая венозная недостаточность значительно снижают качество жизни, приводят к инвалидизации людей трудоспособ-