CC BY
88
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 2, 2012
© Т. П. БОНДАРЬ, А. Ю. МУРАТОВА, 2012 УДК 616.151.511-055.5/.7-055.26-074:575.083
Т. П. Бондарь, А. Ю. Муратова
ВЛИЯНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА СУБЪЕДИНИЦ РЕЦЕПТОРОВ ТРОМБОЦИТОВ GP
iib/iiia на изменение показателей тромбоцитарного гемостаза в акушерской практике
ГОУ ВПО Ставропольский государственный университет, медико-биолого-химический факультет, кафедра физико-химических основ медицины, лабораторной диагностики и фармакологии
В работе приведены результаты изучения влияния полиморфизма гена субъединиц рецепторов тромбоцитов GP IIb\IIIa на изменение количественных, функциональных и морфометрических параметров тромбоцитов у 408 родильниц. Гетерозиготный вариант мутации встречался у женщин с физиологическим течением беременности и родов и у женщин с клиническими проявлениями тромбофилии, гомозиготный вариант - только в группе женщин с тромбофилией.
Выявлена связь между наличием гетеро- и гомозиготных мутаций гена субъединиц рецептора тромбоцитов GP Ilb/IIIa и склонностью к гиперкоагуляции, проявляющейся повышением степени агрегации тромбоцитов со всеми индукторами, а также повышением функциональной активности и появлением молодых, активных клеток по данным морфометрического анализа.
Использование в исследовании метода компьютерной морфометрии тромбоцитов позволило констатировать активизацию тромбоцитарного компонента гемостаза у здоровых женщин и наличие гетерозиготной мутации гена субъединиц рецепторов тромбоцитов GP Ilb/IIIa (P1A1/P1A2).
Ключевые слова: тромбофилия, тромбоциты, полиморфизм гена рецепторов тромбоцитов GP IIb/IIIa
T.P. Bondar, A.Yu. Muratova
THE IMPACT OF GEN POLYMORPHISM OF SUBUNITS OF RECEPTORS OF THROMBOCYTES GP IIB/
iiia on variation of indicators of thrombocyte hemostasis in obstetrics practice
The article presents the results of study of the impact of gen polymorphism of subunits of receptors of thrombocytes GP IIb/IIIa on variation of quantitative, functional and morphometric parameters of thrombocytes in 408 puerperae. The heterozygous variant of mutation was established in women with physiologically progress ofpregnancy and delivery and in women with clinical manifestations of thrombophilia. The homozygous variant was established only in women with thrombophilia.
The relationship is established between the presence of hetero- and homozygous mutations of gen of subunits of receptors of thrombocytes GP IIb/IIIa and inclination to hypercoagulation. This relationship manifests itselfin increasing of degree ofthrombocytes aggregation with all inductors and as well as in increasing of functional activity and appearance of young active cells, according morphometric analysis data.
The application of computer morphometry of thrombocytes in the study made it possible to ascertain the activization of thrombocyte component of hemostasis in healthy women and availability of heterozygous mutation of gen of subunits of receptors of thrombocytes GP IIb/IIIa (PA1/PA2).
Key words: thrombophilia, thrombocyte, gen polymorphism of subunits of receptors of thrombocytes GP IIb/IIIa
Тромбофилические нарушения системы гемостаза являются одним из инициальных моментов развития таких осложнений беременности, как невынашивание, синдром потери плода, неудачи экстракорпорального оплодотворения, задержка внутриутробного развития плода, гестоз, преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты [2, 8].
Тромбофилические состояния могут быть приобретенными или иметь наследственную природу. Причиной этих состояний чаще всего является патология в системе свертывания или тромбоцитов (Тр). Генетический фактор в развитии тромбофилий приводит к недостатку или дефекту тех или иных факторов свертывания крови, рецепторов Тр либо проявляется наследственной предрасположенностью, например к развитию аутоиммунной патологии [4].
Для корреспонденции:
Бондарь Татьяна Петровна, д-р мед. наук, проф. Адрес: 355009, Ставрополь, ул. Пушкина, 1А Телефон: (8652) 35-50-68 E-mail:tatiana_bond_st@mail.ra
Поскольку физиологическая адаптация системы гемостаза к беременности имеет свои особенности, абсолютное большинство генетических форм тромбофилии клинически проявляется именно в течение гестационного процесса и, как оказалось, не только в форме тромбозов, но и в форме типичных акушерских осложнений. В этот период в организме матери происходит перестройка свертывающей, противосверты-вающей и фибринолитической систем, что приводит к увеличению содержания факторов свертывания крови на 200%. Также в III триместре наполовину уменьшается скорость кровотока в венах нижних конечностей из-за частичной механической обструкции беременной маткой венозного оттока. Тенденция к стазу крови в сочетании с гиперкоагуляцией при физиологической беременности предрасполагает к развитию тромбозов и тромбоэмболий. При наличии (генетической) тромбофилии риск тромботических и акушерских осложнений повышается в десятки и сотни раз [2, 3].
В настоящее время установлено, что генетические аномалии гемостаза ответственны за развитие тромбозов в 80-90% случаев. Мутация FV Leiden выявляется у 20% пациентов с тромботическими осложнениями, дру-
46
КОАГУЛОЛОГИЯ
Таблица 1
Изменение количественных показателей Тр у здоровых женщин и женщин с тромбогеморрагическими осложнениями (X ± m; p < 0,05)
Показатель Группа родильниц
1-я 2-я 3-я 4-я 5-я
PLT, 103/мм3 265,7 ± 7,6 271,8 ± 7,9 292,6 ± 9,8* 308,8 ± 11,8** 317,4 ± 12,3***
MPV, фл 9,2 ± 0,18 9,5 ± 0,20 10,4 ± 0,25* 10,9 ± 0,25** 11,2 ± 0,27***
PCT, % 0,25 ± 0,008 0,24 ± 0,008 0,26 ± 0,008 0,25 ± 0,007 0,26 ± 0,008
PDW, % 16,9 ± 0,17 16,8 ± 0,18 18,2 ± 0,16* 18,2 ± 0,16** 18,4 ± 0,16***
Примечание. * - достоверность различий между 1-й и 3-й группами, ** - между 1-й и 4-й группами, *** - между 1-й и 5-й группами.
Таблица 2
Изменение функциональных параметров Тр у здоровых женщин и женщин с тромбогеморрагическими осложнениями (X ± m; p < 0,05)
Показатель Группа родильниц
1-я 2-я 3-я 4-я 5-я
АДФ, % 47,0 ± 0,69 49,5 ± 0,71 77,6 ± 2,93* 78,4 ± 2,97* 79,4 ± 3,68***
Коллаген, % 42,0 ± 0,83 44,0 ± 0,96 66,4 ± 2,76* 65,3 ± 2,74** 68,0 ± 2,77***
Ристоцетин, % 47,5 ± 0,74 53,3 ± 0,82 85,8 ± 5,4* 86,3 ± 5,8** 89,1 ± 6,1***
Примечание. * - достоверность различий в 1-й и 3-й группах, ** - в 1-й и 4-й группах, *** - в 1-й и 5-й группах.
гие дефекты антикоагулянтной системы (дефицит антитромбина III - AT III, протеина S, протеина С) - у 20%, синдром липких Тр - у 14%, а антифосфолипидный синдром - у 25% [2, 7].
Наследственные тромбоцитарные тромбофилии могут быть связаны с мутацией в гене гликопротеина IIb/IIIa (GP IIb/IIIa). Рецепторный комплекс GP IIb/IIIa является главным среди всех рецепторов Тр и входит в состав группы цитоадгезинов. Гены, кодирующие GP IIb/IIIa, располагаются в области 17-й хромосомы (q21.32) [4].
Под влиянием определенных стимулов (аденозиндифосфата - АДФ, тромбина, тромбоксана, коллагена и др.) комплекс GP IIb/IIIa активируется и взаимодействует с различными лигандами (фибриногеном, фибронек-тином, фактором Виллебранда, витронектином, тромбоспондином), в результате чего происходит агрегация Тр [6].
В настоящий момент в мировой литературе имеются данные об ассоциации наличия полиморфизма гена субъединиц рецепторов Тр GP IIb/IIIa с ишемической болезнью сердца, а его связь с тромбофилитическими осложнениями в акушерской практике остается неясной.
Целью исследования было изучение влияния полиморфизма гена субъединиц рецепторов Тр GP IIb/IIIa на изменение количественных, функциональных и морфометрических параметров Тр у родильниц.
Материалы и методы. Обследовано 408 женщин, находящихся в период родоразрешения в родильном отделении городской больницы Ставрополя. Возраст рожениц колебался от 20 до 35 лет (средний возраст 25,2 ± 0,6 года). Кровь брали в 1-е сутки после родов с согласия лечащего врача при соблюдении правил преаналитического этапа исследования [1].
Обследованные условно были разделены на следующие группы: 1-я - 128 женщин с физиологическим течением беременности и родов, носительством нормального варианта гена субъединиц рецепторов Тр GP IIb/IIIa (P1A1/P1A1); 2-я - 24 здоровые родильницы с гетерозиготным вариантом мутации (P1A1/P1A2); 3-я - 163 пациентки
с тромбофилиями и носительством нормального варианта гена субъединиц рецепторов Tp GP IIb/IIIa (P1A1/P1A1); 4-я - 54 пациентки с тромбофилиями и гетерозиготной мутацией P1A1/P1A2); 5-я - 39 пациенток с тромбофилиями и гомозиготной мутацией P1A2/P1A2. Из обследования были исключены пациентки с другими подтвержденными мутациями генов в системе гемостаза.
Определение генотипа по полиморфизму P1A1/P1A2 проводили амплификационно-рестрикционным методом. Источником для выделения ДНК служили пробы цельной крови, взятой из вены пациентов в пробирки с 6% раствором ЭДТА (1:20). Выделение дНк осуществляли сорбционным методом с помощью набора "ДНКсорб Б» в соответствии с инструкцией. Амплифи-кационные смеси готовили на основе универсального набора реактивов и препаратов для ПЦР "АмплиСенс-200-1» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Праймеры были синтезированы в ООО "Литех» в соответствии с последовательностями, описанными s. Bojesen и соавт., 2000. Идентификацию рестрикционных фрагментов ДНК проводили, сравнивая их размеры с эталонами в виде коммерческих маркеров молекулярных размеров фрагментов ДНК. Аллели генотипов определяли в соответствии с наборами рестрикционных фрагментов ДНК [5].
Количественные показатели Тр определяли с помощью автоматического гематологического анализатора Cell Din 1700 фирмы Abbott (США). Анализировали 4 тромбоцитарных параметра: PLT - общее количество Тр в периферической крови и тромбоцитарные индексы (MPV, PCT, PDW). Исследование функциональной активности Тр проводили в богатой Тр плазме методом G. Born с графической регистрацией на лазерном агрего-метре БИОЛА LA-23 (Россия). Анализировали степень агрегации, индуцированной АДФ (200 мкМ), коллагеном (0,2 мг/мл), ристоцетином (5 мкМ/мл). Для исследования морфометрических параметров Тр в мазках крови использовали компьютерную морфометрическую установку МЕКОС-Ц (ЗАО "Медицинские компьютерные системы", Москва). В ходе исследования анализировали
47
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 2, 2012
Таблица 3
Изменение морфометрических параметров Тр у здоровых женщин и женщин с тромбогеморрагическими осложнениями (X ± m; p < 0,05)
Показатель Тр Группа родильниц
1-я (n = 128) 2-я (n = 24) 3-я (n = 163) 4-я (n = 54) 5-я (n = 39)
Диаметр, мкм 2,24 ± 0,13 2,31 ± 0,11 2,46 ± 0,11* 2,66 ± 0,12** 2,81 ± 0,14***
Площадь, мкм2 3,65 ± 0,41 3,96 ± 0,44 5,51 ± 0,49* 5,48 ± 0,48** 6,33 ± 0,51***
Фактор формы, усл. ед. 12,8 ± 0,16 13,3 ± 0,17# 14,11 ± 0,15* 15,12 ± 0,16** 16,18 ± 0,17***
Доля синего цвета, усл. ед. 0,32 ± 0,002 0,37 ± 0,002# 0,46 ± 0,003* 0,45 ± 0,003** 0,52 ± 0,004***
Доля красного цвета, усл. ед. 0,42 ± 0,002 0,39 ± 0,002# 0,35 ± 0,001* 0,34 ± 0,001** 0,31 ± 0,001***
ИОТр, усл. ед. 0,76 ± 0,002 0,94 ± 0,003# 1,31 ± 0,07* 1,32 ± 0,07** 1,67 ± 0,11***
Поляризация, усл. ед. 0,16 ± 0,02 0,16 ± 0,02 0,17 ± 0,03 0,17 ± 0,03 0,17 ± 0,03
Примечание. * - достоверность различий между 1-й и 3-й группами, ** - между 1-й и 4-й группами, *** - между 1-й и 5-й группами, # - между 1-й и 2-й группами.
следующие геометрические и цветояркостные характеристики Тр: площадь клетки, диаметр клетки, фактор формы, поляризация клетки, доля синего и красного цвета в препарате, индекс омоложения Тр (ИОТр).
Степень достоверности различий изучаемых показателей определяли по /-критерию Стьюдента, уровень значимости считался достоверным приp < 0,05.
Результаты и обсуждение. Для выявления изменения количественных параметров Тр исследовали общее количество Тр в периферической крови и тромбоцитар-ные индексы (MPV, PCT, PDW). Полученные данные представлены в табл. 1.
При проведении сравнительного анализа данных количественных параметров Тр выявлено, что у женщин без клинических проявлений тромбофилии (1-я и 2-я группы) показатели количества Тр и тромбоцитарные индексы практически не различались между собой.
При сравнении групп женщин - носителей нормального гена рецепторов Тр GP Ilb/IIIa (группы 1-я и 3-я) выявили, что все количественные тромбоцитарные показатели не выходят за рамки референсных границ, но отмечаются общие тенденции изменений. Так, достоверно увеличивается количество Тр, увеличен средний объем Тр и показатель анизоцитоза по сравнению с аналогичными показателями у здоровых пациенток.
Проводя сравнение количественных параметров Тр у женщин без клинических проявлений тромбофилии с носительством нормального варианта гена субъединиц рецепторов Тр GP IIb/IIIa и у женщин, имеющих гетерозиготный вариант мутации (P1A1/P1A2) - 4-я группа, выявили достоверное изменение показателей PLT, MPV и PDW, которые составили в среднем 308,8 • 103/мм, 10,9 фл и 18,2% соответственно.
У пациенток с гомозиготным вариантом мутации гена рецепторов Тр GP IIb/IIIa (P1A2/P1A2) наиболее выражены изменения количественных показателей Тр. Отмечается увеличение количества Тр в периферической крови (317,4 ± 12,3 103/мм3), среднего объема Тр (11,2 ± 0,27 фл) и показателя анизоцитоза Тр (18,4 ± 0,16%) по сравнению с соответствующими показателями у здоровых родильниц.
Анализ данных агрегатограмм со всеми индукторами показал, что показатели в группах здоровых родильниц достоверно не различались между собой, но имелась тенденция к увеличению степени агрегации в группе женщин, имеющих гетерозиготную мутацию в гене рецепторов Тр GP IIb/IIIa. Данные представлены в табл. 2.
Сравнивая показатели агрегационной активности Тр
в группах женщин с тромбофилией, выявили повышение степени и скорости агрегации Тр со всеми индукторами. При этом самая высокая достоверность показателей отмечена в группе пациенток с гомозиготной мутацией в гене рецепторов Тр, а наиболее низкая - у женщин с нормальным генотипом.
В группе беременных с нормальным генотипом отмечена повышенная агрегационная активность Тр при воздействии АДФ в дозе 200 мкМ на 65%, ристоцети-на в дозе 5 мкМ/мл на 80%, коллагена в дозе 0,2 мг/мл на 58% в сравнении с показателями в группе здоровых женщин с нормальным генотипом. В группе женщин, имеющих полиморфизм гена рецепторов Тр GP IIb/IIIa P1A1/P1A2, отмечено повышение агрегации Тр при воздействии АДФ в дозе 200 мкМ на 66%, ристоцетина в дозе 5 мкМ/мл на 81%, коллагена в дозе 0,2 мг/мл на 55% в сравнении с показателями в группе здоровых женщин с нормальным генотипом. В группе женщин с гомозиготной мутацией (P1A2/P1A2) агрегационная активность, индуцированная АДФ, ристоцетином и коллагеном в указанных выше дозах, повысилась на 68, 87 и 61% соответственно.
Дефект в гене рецепторов Тр способствует снижению порога для тромбоцитарного ответа, индуцированного агонистами.
В патогенезе тромбофилий большая роль отводится функциональному состоянию Тр. При этом в научной литературе практически нет данных об изменении формы, размера и поверхностной архитектоники Тр у больных с тромбофилиями.
Поскольку у больных с тромбофилиями изменяются функциональные и количественные показатели Тр по сравнению с данными здоровых родильниц, можно предположить, что изменяются и морфометрические параметры клеток. С этой целью проведено исследование морфометрических показателей у 408 родильниц с наличием полиморфизма гена рецепторов Тр GP IIb/IIIa P1A1/P1A2, P1A2/P1A2 и нормальным генотипом.
Компьютерный микроскоп МЕКОС-Ц позволяет определить диаметр, площадь, форму клеток, а также оценить возраст Тр и степень функциональной активности. Табл. 3 иллюстрирует изменение морфометрических показателей Тр у здоровых женщин и женщин с клиническими проявлениями тромбофилии.
При анализе морфометрических показателей Тр здоровых женщин выявлено повышение функциональной активности Тр во 2-й группе, о чем свидетельствует достоверный рост показателя фактора формы, также
48
КОАГУЛОЛОГИЯ
наблюдается повышение содержания молодых Тр, что проявляется увеличением доли синего и уменьшением доли красного цвета в препарате. ИОТр достоверно выше во 2-й группе и составляет 0,94 усл. ед. (в 1-й группе 0,76 усл. ед.), что отражает активацию Тр у пациенток, имеющих полиморфизм p 1A1/p 1А2, по сравнению с женщинами с нормальным генотипом. Наблюдается тенденция к увеличению диаметра и площади Тр, но это увеличение недостоверно.
У пациенток с клиническими проявлениями тромбофилии достоверно увеличены средний диаметр Тр, площадь клетки, фактор формы и ИОТр. Оценку изменения морфометрических показателей Тр родильниц проводили в группах с наличием полиморфизма гена рецепторов Тр Gp IIb/IIIa p1A1/p1A2, p 1 a2/p 1a2 и нормальным генотипом. В результате анализа полученных данных установлены достоверные различия большинства показателей, что отражено в табл. 3.
Сравнив степень выраженности изменения морфометрических показателей Тр пациенток с клиническими проявлениями тромбофилии, установили определенные закономерности. Так, наиболее ярко все геометрические и цветояркостные параметры изменяются у пациенток с клиническими проявлениями тромбофилии и гомозиготным вариантом мутации (P1A2/P1A2) - 5-я группа. При этом разница между средним диаметром Тр, выраженная в процентах, в 5-й группе и группе здоровых женщин с нормальным генотипом составила 25,4%, между показателями площади Тр - 73,4%, фактора формы - 26,4%. Аналогичные результаты в группе с гетерозиготной мутацией составили 18,7, 50,1 и 18,1% соответственно, а в группе с нормальным генотипом - 9,8, 50,9 и 10,2% соответственно.
Интенсивность омоложения Тр оценивали по степени изменения ИОТр. Появление молодых Тр отмечено во всех группах женщин с клиническими признаками тромбофилии, но наиболее выражено у пациенток с гомозиготной мутацией (1,67 усл. ед.). В группах с нормальным генотипом и гетерозиготной мутацией этот показатель составил 1,31 и 1,32 усл. ед. соответственно.
Таким образом, у пациенток, имеющих гомозиготную мутацию, отмечается достоверное увеличение размеров клеток (увеличение площади и среднего диаметра Тр), большая функциональная активность (повышение фактора формы) и появление молодых клеток в периферической крови. В группах родильниц с нормальным генотипом и полиморфизмом P1A1/P1A2 выявлены аналогичные изменения, но степень повышения показателей у них немного ниже, чем у пациенток с полиморфизмом P1A2/P1A2.
Заключение. При проведении сравнительного анализа полученных данных выявлено, что количественные и функциональные параметры Тр женщин без клинических проявлений тромбофилии достоверно не различались между собой, но имелась тенденция к увеличению степени агрегации в группе с гетерозиготной мутацией в гене рецепторов Тр GP IIb/IIIa. При анализе морфометрических показателей Тр здоровых женщин выявлено достоверное повышение функциональной активности Тр и увеличение количества молодых форм Тр в группе пациенток, имеющих полиморфизм P1A1/P1A2, по сравнению с нормальным генотипом.
Сравнивая показатели у пациенток с тромбофилиями, выявили, что все количественные тромбоцитарные показатели не выходят за рамки референсных границ, но отмечаются достоверное увеличение количества Тр, среднего объема Тр и показателя анизоцитоза. Выявлено
повышение степени и скорости агрегации Тр со всеми индукторами, а также повышение функциональной активности и появление молодых клеток по данным морфометрического анализа. При этом наиболее выраженные изменения показателей отмечены в группе пациенток с гомозиготной мутацией.
Наличие у пациенток дефекта в гене рецептора Тр IIb/IIIa привело к гиперагрегации Тр, выявленной при оценке их функциональных свойств, что могло способствовать гиперкоагуляции и развитию тромбофилии. О возможной роли генетического дефекта гена субъединиц рецепторов Тр Gp IIb/IIIa в развитии тромбофилии свидетельствует тот факт, что наиболее выраженные изменения количественных, функциональных и морфометрических параметров Тр наблюдались в группе пациенток с гомозиготной мутацией этого гена.
Так как гетерозиготный вариант мутации (P1A1/P1A2) встречался у здоровых женщин, не имеющих клинических проявлений тромбофилии, можно предположить, что генетический полиморфизм субъединиц рецепторов Тр Gp IIb/IIIa не обязательно ведет к состоянию болезни, возможно, действуют другие провоцирующие факторы, например экстрагенитальная патология, применение гормональных контрацептивов. Обнаружение мутации в гене является показанием к мониторингу состояния системы гемостаза, так как наличие мутации в гене субъединиц рецепторов Тр Gp IIb/IIIa может ассоциироваться с риском развития тромбофилии. Критерием активизации тромбоцитарного компонента гемостаза у здоровых женщин с наличием гетерозиготной мутации гена субъединиц рецепторов Тр GP IIb/IIIa (P1A1/P1A2) являются показатели морфометрии как наиболее чувствительные.
Наличие клинической картины тромбофилии у женщин с носительством нормального варианта гена субъединиц рецепторов Тр Gp IIb/IIIa свидетельствует о по-лиэтиологичности заболевания, среди факторов, вызывающих патологические изменения в системе гемостаза, описаны мутация гена протромбина G 20210 A, гиперго-моцистеинемия, дефицит AT III, протеина S и С и др.
Таким образом, предрасположенность к тромбофилиям может реализовываться с помощью нескольких патогенетических механизмов. Изучение этих механизмов позволит более дифференцированно, а значит более эффективно, осуществлять профилактику развития тромбофилий. Своевременное выявление лиц с повышенным риском тромбообразования позволит проводить подбор антиагрегантной и антикоагулянтной терапии и предотвращать тромботические осложнения у женщины во время беременности и в послеродовом периоде.
ЛИТЕРАТУРА
1. Клиническая лабораторная аналитика. Т. 3 / Под ред. В. В. Меньшикова. - М., 2000.
2. Макацария А. Д., Бицадзе В. О. и др. Тромбофилитические состояния в акушерской практике. - М., 2001.
3. Муратова А. Ю., Бондарь Т. П., Сафонова Л. Г. // Клин. лаб. диагн. - 2008. - № 9. - С. 10-11.
4. Хаспекова С. Г. и др. // Биомед. химия. - 2008. - Т. 54, № 3. - С. 361-371.
5. Bojesen S. E., Juul K., Schnohr P. et al. // J. Am. Coll. Cardiol. -2003. - Vol. 42, N 4. - P. 661-667.
6. Frey U. H., AralN., MullerN., Siffert W. // Thromb. Res. - 2003. -Vol. 109, N 5-6. - P. 279-286.
7. Levine J. S., Branch D. W., Rauch J. // N. Engl. J. Med. - 2002. - Vol. 346, N 10. - P. 752-763.
8. PrestonF. et al. // Lancet. - 1996. - Vol. 348. - P. 913-916.
Поступила 31.03.11
49
