CC BY
24
удк 616-71/ А. Ю. Муратова [Muratova Anna],
616.151.5 Т. П. Бондарь [Bondar Tatiana],
Е. А. Мельченко [Melchenko Evgeny]
ПРИМЕНЕНИЕ СКАНИРУЮЩЕЙ зондовой МИКРОСКОПИИ ПРИ ИССЛЕДОВАНИ СПОНТАННОЙ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ У ПАЦИЕНТОК С МУТАЦИЕЙ В ГЕНЕ ГЛИКОПРОТЕИНА РЕЦЕПТОРА ТРОМБОЦИТОВ NB/iNA
Application of Scanning Probe Microscopy in the study of spontaneous aggregation of thrombocytes in patients with mutations in the platelet receptor glycoprotein lib / IIIa
В работе представлены результаты использования сканирующей зондовой микроскопии в анализе тромбоцитарных агрегатов у женщин с физиологически протекающей беременностью и при наличии полиморфизма в гене гликопротеина тромбоцитов IIb/ IIIa. Установлено, что размеры агрегатов здоровых беременных женщин выше показателей здоровых не беременных, но не достигают показателей женщин с тромбофилиями. Отмечено, что дефект в гене гликопротеина 11 b/ IIIa усиливает функциональную активность тромбоцитов. Ключевые слова: беременные женщины, тромбоциты, гиперкоагуляция, тромбофилия.
The paper presents the results of the use of scanning probe microscopy to analyze platelet aggregates in women with normal pregnancy and in the presence of polymorphisms in the gene for platelet glycoprotein IIb / IIIa. It was found that the size of the aggregates healthy pregnant women is higher in healthy non-pregnant women, but do not reach the performance of women with thrombophilia. It is noted that a defect in the gene for glycoprotein IIb / IIIa platelet functional activity increases.
Key words: pregnant women, platelets, hypercoagulability, thrombophilia.
Система гемостаза играет важную роль в жизнедеятельности организма и представляет собой сложную биологическую систему, которая обеспечивает жидкое агрегатное состояние крови, предупреждение и остановку кровотечения.
Во время беременности с появлением маточно-плацентарного круга кровообращения происходит перестройка системы гемостаза с усилением
прокоагулянтной активности. Гиперкоагуляция при беременности - физиологическое состояние, которое обеспечивает эффективную имплантацию яйцеклетки, адекватное соединение плаценты с маткой и остановку кровотечения во время родов. Однако необходимо учитывать, что при беременности повышен риск развития тромбофилитических состояний (2).
Тромбофилии могут быть приобретенными или иметь наследственную природу. Причина этих состояний чаше всего - патология в системе свертывания или тромбоцитов (Тр). Генетический фактор в развитии тромбофилий приводит к недостатку или дефекту тех или иных факторов свертывания крови, рецепторов Тр (3).
Наследственные тромбоцитарные тромбофилии могут быть связаны с мутацией в гене гликопротеина рецептора Тр ПЪ/Ша ^Р ПЬ/Ша). Рецепторный комплекс GP ИЪ/Ша является главным среди всех рецепторов Тр (5). Под влиянием определенных стимулов (аденозиндифосфата - АДФ, тромбина, тромбоксана, коллагена и др.) комплекс GP ПЪ/Ша активируется и взаимодействует с различными лигандами (фибриногеном, фибронектином, фактором фон Виллебранда, витронектином, тромбос-пондином), в результате чего происходит агрегация Тр (4).
Наличие полиморфизмов рецептора Тр GP ПЪ/Ша ассоциируется с изменением цитоскелета Тр, повышением связывания с «иммобилизиро-ванным» фибриногеном, что приводит к усилению агрегационной активности Тр и снижению ретракции (2).
Для выявления предрасположенности к развитию тромбофилити-ческих состояний требуются методы, позволяющие адекватно оценить функциональную активность Тр.
В клинической практике для определения функциональной активности тромбоцитов принято изучать агрегацию тромбоцитов, индуцированную коллагеном, АДФ, ристомицином и другими индукторами. Ранее применялись методы изучения спонтанной агрегации Тр, позволяющие в условиях приближенных к естественным изучать функциональные свойства тромбоцитов. Однако существующие методы трудны в исполнении и оценке полученных результатов. В связи с этим поиск новых методов определения спонтанной агрегации представляет большой практический и научный интерес.
Преимуществом сканирующей зондовой микроскопии можно считать получение информации о микро- и наноархитектоники поверхности клетки, а также структур субмембранных слоев, включая цитоскелет (1).
В патогенезе тромбофилитических состояний большая роль отводится функциональному состоянию Тр. При этом в научной литературе практически нет данных об изменении формы, размера и поверхностной архитектоники Тр у больных с тромбофилиями.
Цель исследования: изучить изменение показателей спонтанной агрегации Тр у женщин, имеющих полиморфизм Р1А1/Р1А2 гена субъединиц рецепторов Тр GP ПЪ/Ша с использованием метода сканирующей зон-довой микроскопии.
Материал и методы. Обследовано 52 пациентки, находящиеся в период родоразрешения в родильном отделении городской больницы г. Ставрополя. Возраст рожениц колебался от 20 до 35 лет, в среднем 25,2±0,6 лет. Взятие крови проводилось первые сутки после родов с согласия лечащего врача при соблюдении правил преаналитического этапа исследования.
Обследованные условно были разделены на следующие группы: 1 -пациентки с тромбофилиями и гетерозиготным вариантом мутации Р1А1/ Р1А2 (п = 28); 2 - женщины с физиологическим течением беременности и родов, носительством нормального варианта гена субъединиц рецепторов Тр GP ПЪ/Ша (Р1А1/Р1А1) (п = 22). Контрольную группу составили здоровые не беременные женщины без полиморфизма рецептора Тр GP ПЪ/Ша (п=18), согласившиеся добровольно участвовать в нашем исследовании. Из обследования были исключены пациентки с другими подтвержденными мутациями генов системы гемостаза.
Определение генотипа по полиморфизму Р1А1/ Р1А2 проводили ам-плификационно-рестрикционным методом. Источником для выделения ДНК служили пробы цельной крови, отобранной из вены пациентов в пробирки с 6 % раствором ЭДТА (1:20). Выделение ДНК осуществляли сорбционным методом при помощи набора «ДНКсорб Б» в соответствии с инструкцией. Амплификационные смеси готовили на основе универсального набора реактивов и препаратов для ПЦР «Ампли Сенс-200-1» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Праймеры были синтезированы в ООО «Литех» в соответствии с последовательностями описанными Bojesen S.E. et а1., 2000. Идентификацию рестрикционных фрагментов ДНК проводили, сравнивая их размеры с эталонами в виде коммерческих маркеров молекулярных размеров фрагментов ДНК. Аллели генотипов определяли в соответствии с наборами рестрикционных фрагментов ДНК [5].
Изучение наностроения агрегатов Тр периферической крови пациентов проводилось при помощи СЗМ «Интегра Прима» в НОЦ «Фундаментальных проблем диагностической медицины» СКФУ. Методика оценки спонтанной агрегации Тр разработана на кафедре медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации (авторы Мельченко Е. А., Бондарь Т. П.).
Обогащенную Тр плазму получали центрифугированием крови при 500 об/мин в течение 10 минут. Далее образцы плазмы инкубировали в термостате при 37оС. Затем готовили препараты для микроскопии. При инкубации проб в термостате менее 5 минут агрегаты Тр не обнаруживались. Исследование проводили на 5, 10, 15, 20, 25, 30 минутных мазках. При экспозиции более 30 минут достоверных изменений не обнаружено.
Перед помещением образца в зондовый микроскоп, его предварительно исследовали на оптическом микроскопе при увеличении 40х10. При нахождении на стекле участка с агрегатом, для помещения его на предметный столик СЗМ, с помощью стеклореза выделяли интересующую зону 10х10 мм. Далее участок сканировали в различных режимах, выводили изображение и производили его изучение.
С помощью СЗМ стало возможным получить двухмерное и трехмерное изображение агрегатов. В каждом мазке исследовалось от 10 до 25 агрегатов. Конечные результаты сканирующей зондовой микроскопии агрегатов Тр включали в себя: анализ их геометрических параметров (измерение высоты, длины и ширины) и статистические характеристики.
Степень достоверности различий изучаемых показателей определялась по критерию ^Стьюдента, уровень значимости считался достоверным при р<0,05.
Результаты и обсуждение.
Анализ агрегатов проводился на фиксированных препаратах обогащенной Тр плазмы, с использованием метода сканирующей зондовой микроскопии. Это позволило получить основную информацию об изменении морфологических показателей тромбоцитарных агрегатов у женщин с нормальным генотипом и при полиморфизме гена субъединиц рецепторов Тр ПМПа.
Результаты геометрических показателей (длины) агрегатов представлены в таблице 1.
Таблица 1. ИЗМЕНЕНИЕ ГЕОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТРОМБОЦИ-
ТАРНЫХ АГРЕГАТОВ (ДЛИНЫ) У ОБСЛЕДОВАННЫХ ЖЕНЩИН (Х±М), МКМ
Минуты 1 группа 2 группа 3 группа Р Р1 Р2
(п=28), (п=22), (п=23),
мкм мкм мкм
10
15
20
25
30
44,81±2,15 22,85±0,68 16,19±0,68 Р<0,001 Р<0,001 Р<0,001
59,32±3,15 37,39±1,33 24,67±1,03 Р<0,001 Р<0,001 Р<0,001
79,24±3,07 53,61±2,85 37,47±2,76 Р<0,001 Р<0,001 Р<0,001
85,61±1,92 74,97±2,42 45,74±1,29 Р<0,001 Р<0,001 Р<0,001
93,66±3,81 84,02±2,41 57,32±2,67 Р<0,001 Р<0,001 Р<0,001
101,6±1,3 94,24±1,83 87,54±2,03 Р<0,001 Р<0,001 Р<0,001
5
Примечание: Р - между 1 и 2 группой, Р1 - между 1 и 3 группой,
Р2 - между 2 и 3 группой
В результате статистического анализа полученных данных выявлено, что показатели длины агрегатов Тр здоровых беременных женщин достоверно выше показателей здоровых не беременных на всех этапах проведения эксперимента. Однако это увеличение может отражать процессы физиологической гиперкоагуляции, имеющей место при нормальном течении гестационного процесса.
Показатели длины агрегатов пациенток наличием полиморфизма гена субъединиц рецепторов Тр GP ПЪ/Ша в значительной степени отличались от показателей здоровых женщин 2 и 3 групп. Наглядно это иллюстрируют рисунки 2 и 3. На изображении обращает на себя внимание увеличение ширины, высоты и плотности агрегатов Тр у пациенток, с полиморфизмом в гене рецепторов Тр. Изменения в наибольшей степени выражены на этапе инкубации 15 и 30 минут .
При проведении сравнительного анализа показателей ширины тромбоцитарных агрегатов выявлены достоверные различия во всех груп-
пах обследуемых женщин. Так у здоровых беременных женщин имели больший диаметр по сравнению со здоровыми не беременными пациентками, но не достигали показателей пациенток с генетической тромбофи-лией (таблица 2).
Таблица 2. ИЗМЕНЕНИЕ ГЕОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ
ТРОМБОЦИТАРНЫХ АГРЕГАТОВ (ШИРИНЫ) У ЗДОРОВЫХ ЖЕНЩИН И ПАЦИЕНТОК С ТРОМБОФИЛИЯМИ (Х±М), МКМ
Минуты 1 группа 2 группа 3 группа Р р1 р2
(п=28), (п=22), (п=23),
мкм мкм мкм
5 28,43±1,89 16,22±0,38 12,49±0,44 Р<0,001 Р<0,001 Р<0,001
10 41,41±2,95 24,64±1,11 17,62±1,53 Р<0,001 Р<0,001 Р<0,001
15 57,78±4,11 33,01±1,64 24,25±1,45 Р<0,001 Р<0,001 Р<0,001
20 60,01±3,11 36,32±2,07 27,26±1,59 Р<0,001 Р<0,001 Р<0,001
25 71,75±2,96 63,32±3,71 38,94±2,72 Р<0,005 Р<0,001 Р<0,001
30 89,38±1,95 77,89±2,39 66,24±2,61 Р<0,001 Р<0,001 Р<0,001
Примечание: Р - между 1 и 2 группой, Р1 - между 1 и 3 группой,
Р2 - между 2 и 3 группой
Также была исследована высота тромбоцитарных агрегатов. При сравнении результатов также были выявлены достоверные отличия во всех группах (таблица 3).
Таблица 3. ИЗМЕНЕНИЕ ГЕОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТРОМБОЦИ-
ТАРНЫХ АГРЕГАТОВ (ВЫСОТЫ) У ЗДОРОВЫХ БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН И ЖЕНЩИН С ТРОМБОФИЛИЯМИ (Х±М), МКМ
Минуты 1 группа, мкм 2 группа, мкм 3 группа, мкм Р Р1 Р2
5 1,18±0,03 1,07±0,02 0,961±0,017 Р<0,01 Р<0,001 Р<0,001
10 1,26±0,02 1,18±0,02 1,044±0,017 Р<0,01 Р<0,001 Р<0,001
15 1,31±0,02 1,21±0,02 1,072±0,019 Р<0,01 Р<0,001 Р<0,001
20 1,47±0,02 1,34±0,04 1,096±0,025 Р<0,01 Р<0,001 Р<0,001
25 1,32± 0,04 1,21±0,04 1,161±0,036 Р<0,01 Р<0,001 Р<0,005
30 1,51± 0,02 1,43±0,02 1,282±0,034 Р<0,01 Р<0,001 Р<0,001
Примечание: Р - между 1 и 2 группой, Р, - между 1 и 3 группой, Р2 - между 2 и 3 группой
При исследовании мазков при помощи сканирующего зондового микроскопа, выяснили что количество агрегатов у здоровых женщин и женщин с тромбофилиями визуально схожи. Данные о количестве были подтверждены с помощью традиционной методики исследования агрега-ционной активности Тр методом Born G. V. R. Однако при исследовании геометрических показателей различных экспозиций, выявили, что чем дольше проходила инкубация проб в термостате, тем более различны геометрические показатели агрегатов (таких как высота, длина и ширина). Более наглядно данную тенденцию можно проследить на рисунках 1-3.
Анализ полученных данных показал, что геометрические размеры агрегатов Тр здоровых беременных женщин несколько выше показателей здоровых не беременных. Однако это может быть следствие повышения коагуляционного потенциала крови при физиологической беременности. Но в то же время размеры агрегатов при нормальной беременности не достигают морфологических показателей агрегатов пациенток с генетическими тромбофилиями. Дефект в гене рецепторов Тр способствует снижению порога для тромбоцитарного ответа и усиливают агрегационную активность Тр.
Таким образом, проведенное исследование показало, что изучение спонтанной агрегации Тр позволяет оценить их естественную функциональную активность. Визуализация агрегатов убедительно доказывает и иллюстрирует увеличение скорости образования агрегатов при тром-ботических осложнениях беременности. Также метод СЗМ может быть использован с большей степенью надежности для фундаментальных исследований морфофункциональных свойств Тр. А также в клинико-ла-бораторной диагностике тромботических состояний различного генеза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бондарь Т. П., Мельченко Е. А Использование сканирующей зондовой микроскопии для оценки состояния периферического звена эритрона у детей // Вестник Северо-Кавказского федерального университета. 2013. №1 (34). С. 113-115.
2. Мацакария А. Д., Бицадзе В. О. и др. Тромбофилитические состояния в акушерской практике. М.: Медицина, 2001. 703 с.
3. Муратова А. Ю., Бондарь Т. П., Сафонова Л. Г. Показатели тромбо-цитарного звена гемостаза в диагностике тромбофилий у беременных // Клинич. лабораторная диагностика. 2008. № 9. С. 10-11.
Рисунок 1
Рисунок 2,
Рисунок 3
3й изображение агрегатов Тр пациенток контрольной группы (спонтанная агрегация на 5 мин, на 15 мин., на 30 мин.)
3й изображение агрегатов Тр здоровых беременных женщин (спонтанная агрегация на 5 мин, на 15 мин., на 30 мин.)
♦
3й изображение агрегатов Тр беременных с генетической тромбофилией (спонтанная агрегация на 5 мин, на 15 мин., на 30 мин.)
4. Хаспекова С. Г и соавт. Вариации содержания гликопротеина IIb-IIIa (альфа11Ь/бэта3 интегрина) у здоровых доноров. Влияние на аг-регационную активность тромбоцитов и эффективность действия аспирина // Биомедицинская химия: научно-практический журнал / НИИ биомедицинской химии РАМН (Москва). 2008. Том 54. № 3. С. 361-371.
5. Bojesen S. E., Juul K., Schnohr P. et al. Platelet Glycoprotein IIb/ IIIa P1A2/ P1A2 Homozygosity Associated With Risk of Ischemic Cardiovascular Disease and Myocardial Infarction in Young Men // Journal of the American College of Cardiology. 2003. V. 42. № 4. P. 661-667.
ОБ АВТОРАХ
Муратова Анна Юрьевна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации Института живых систем Северо-Кавказского федерального университета. Телефон: +79624549042. E-mail: Anna.murato@yandex.ru
Muratova Anna, Candidate of medical science, Associate professor, North-Caucasus Federal University, Institute of Living Systems, Department of Medical Biochemistry, Clinical Laboratory Diagnostics and Pharmacy. Phone: +79624549042. E-mail: Anna.murato@yandex.ru.
Бондарь Татьяна Петровна, заведующий кафедрой медицинской биохимии Северо-Кавказского федерального университета, доктор медицинских наук, профессор. Адрес: 355000, г. Ставрополь, ул. Пушкина 1. Телефон: (8652) 35-50-68. E-mail: Tatiana_bond_st@mail.ru
Tatiana Petrovna Bondar, head of the Department of Medical Biochemistry in the North Caucasus Federal University, doctor of medical sciences, professor. Address: 355000, Stavropol, street. Pushkina 1. Tel. (8652) 35-50-68. E-mail: Tatiana_bond_st@mail.ru.
Мельченко Евгений Александрович, кандидат медицинских наук, доцент кафедры медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации Института живых систем Северо-Кавказского федерального университета. Тел. +79282306419. E-mail: evgenmell@mail.ru
Melchenko Evgeny, Candidate of medical science, Associate professor, North-Caucasus Federal University, Institute of Living Systems, Department of Medical Biochemistry, Clinical Laboratory Diagnostics and Pharmacy. Phone: +79282306419. E-mail: evgenmell@mail.ru
