CC BY
18
Актуальт проблемы сучасно! медицины
УДК 577.154.25+547.85
ВЛИЯНИЕ ЛАКТАТА НА АКТИВНОСТЬ АДЕНОЗИНДЕЗАМИНАЗЫ
Шатова О.П., Хомутов Е.В., Зинкович И.И. Донецкий национальный медицинский университет им.М.Горького
В гомогенатах опухолевых и в смежных с опухолью тканях изучено влияние лактата на активность ключевого фермента обмена пуриновых нуклеотидов — аденозиндезаминазу (АДА). Для сравнения использовали соляную кислоту. Было обнаружено, что лактатацидоз и солянокислый ацидоз по-разному влияют на активность АДА в различных тканях. В гомогенате смежной с опухолью ткани при рН 6,5 с добавлением лактата активность фермента статистически достоверно увеличивается по сравнению с активностью фермента при оптимальной рН=7,0. В пробах с такими же значениями рН, но при добавлении соляной кислоты наблюдалось достоверное снижение активности АДА. Интересно, что в опухолевой ткани АДА более чувствительна к солянокислому ацидозу. Ключевые слова: лактат, обмен пуриновых нуклеотидов, аденозиндезаминаза, рак молочной железы
Характерной чертой злокачественного роста является активация гликолиза, которая сопровождается избыточным образованием лактата
[6]. Существует статистически достоверная корреляция между уровнем сывороточного лактата и тяжестью заболевания [3]. В то же время известно, что лактат (молочная кислота) влияет на иммунную функцию in vitro. Увеличение концентрации молочной кислоты уменьшает пролиферацию Т-лимфоцитов, снижая их цитоток-сическую активность. Цитотоксические Т-лимфоциты, которые инфильтрируют опухоль, под ее воздейстием изменяют свою форму и способность продуцировать цитокины. В свою очередь показателем функциональной активности лимфоцитов является изменение активности аденозиндезаминазы (АДА). При иммуно-дефицитных состояниях происходит снижение АДА в лимфоцитах и увеличение АДА в сыворотке крови [2, 4].
Интересно, что опухолевые клетки в отличие от нормальных развивают резистентность к индуцированной кислотой токсичности в процессе канцерогенеза, что дает им возможность выжить и делиться в кислых условиях среды. В нормальных клетках снижение рН вызывает клеточную гибель путем некроза или апоптоза из-за падения трансмембранного градиента Н+ и деградации внутриклеточного матрикса путем высвобождения катепсина В и других протеолити-ческих ферментов. Изменение кислотного градиента дает возможность опухолевым клеткам разрушать смежные немалигнизированные ткани. В современных работах описаны доказательства кислотозависимой опухолевой инвазии при нарушении метаболизма глюкозы [5].
В недавних исследованиях было показано влияние лактата на промоцию Р-19 субъединицы ИЛ-23, которая гиперэкспрессируется в окружающих опухоль тканях, индуцирует локальное воспаление и способствует развитию рака
[7].
Целью нашей работы было изучение влияния лактата на активность фермента обмена пуриновых нуклеотидов - АДА.
Материалы и методы исследования
Материалом исследования послужили гомоге-наты опухолевой и окружающих узел смежных железистых тканей 10 женщин в возрасте от 47 до 72 лет с диагнозом рак молочной железы на разной стадии заболевания согласно системе TNM. Перед исследованием все пациентки получили от 2 до 4 курсов неоадъювантной полихимиотерапии по схеме ЦМФ (циклофосфан, метатрексат, фторурацил).
Для приготовления гомогенатов образцы тканей массой 5 г тщательно промывали охлажденным физиологическим раствором, измельчали ножницами, гомогенизировали на льду в 0,25 М растворе сахарозы на 5 мМ трис-Н^-буфере (рН=8,1) и 0,15 М К^ в стеклянном гомогенизаторе. Полученный гомогенат центрифугировали в течение 60 мин при 3000 об/мин (центрифуга ОПН-3, g=1200). К супернатанту добавляли раствор NH4SO2 до 40% насыщения, после чего центрифугировали в течение 60 мин при 3000 об/мин, к надосадочной жидкости добавляли 5 мМ тpиc-HCl буфер (рН=8,1), который содержал 0,001 М меркаптоэтанола. Определение АДА основано на изменении оптической плотности реакционной смеси при длине волны 265 нм, обусловленном дезаминированием аде-нозина до инозина [1]. Активность АДА определяли при различных значениях рН: 7,0, 6,5, 6,0. Необходимые значения рН создавались добавлением соляной и молочной кислоты к гомоге-нату тканей в фосфатном буфере рН 7,4, Активность ферментов выражена на 1 мг белка, определение которого проводили по методу O.H Lowry.
Протокол исследования был одобрен Комитетом по вопросам биоэтики Донецкого национального медицинского университета им. М. Горького. Было получено информированное согласие больных на взятие и исследование их крови и тканей.
Статистическая обработка результатов проведена с помощью пакета STATISTICA-6,0. Цифровые данные в тексте и таблицах представлены в виде средних арифметических и их стандартных ошибок. Различия между значениями показателей считали достоверными при р< 0,05.
Том 9, Выпуск 4
163
Результаты и их обсуждение
Лактат играет важную роль в модуляции активности ферментов обмена нуклеотидов в опухолевых клетках. Вызванный лактатом ацидоз имеет аномальное влияние на распад пурино-
вых нуклеотидов (Рис.1). В опухолевой ткани лактат инициирует поглощение аденозина, которое не сопровождается образованием продуктов реакции, в сравнении с нормальными смежными тканями.
влияние лактатацидоза на активность АДА в гомогенате
опухолевой ткани
Рис. 1 Зависимость активности АДА от рН в опухолевых тканях при добавлении молочной кислоты 1- активность АДА при рН = 7,0 2 - активность АДА при рН = 6,5 3 - активность АДА
при рН = 6,0
При моделировании солянокислого ацидоза такого феномена не отмечается.
При уменьшении рН активность АДА уменьшается и при рН=6,0 почти равна нулю (Рис.2).
Рис. 2 Зависимость активности АДА от рН в опухолевых тканях при добавлении соляной кислоты 1- активность АДА при рН = 7,0 2 - активность АДА при рН = 6,5 3 - активность АДА при
рН = 6,0
В смежной ткани наблюдается противоположная картина. В отличие от влияния, которое мы отметили в опухолевой ткани, в смежной ткани при снижении рН до 6,5 наблюдается статистически достоверное увеличение активности АДА (Рис. 3)._
влияние лактатацидоза на активность АДА в гомогенате
смежной ткани
1 2 3
Рис.3 Зависимость активности АДА от рН в смежных с опухолью тканях при добавлении молочной кислоты 1- активность АДА при рН = 7,0 2 - активность АДА при рН = 6,5 3 - активность
АДА при рН = 6,0
Актуальт проблемы сучасно!" медицины
Примечательно, что в опухолевой ткани аденозиндезаминаза более чувствительна к уменьшению рН при добавлении соляной кислоты. В смежной ткани изучаемый фермент также ингибируется. При снижении рН до 6,5 при добавлении НС! к гомогенату смежной ткани активность фермента уменьшается на 10%, а при добавлении к гомогенату опухолевых тканей активность АДА снижается почти на 40%. При последующем изменении рН в кислую сторону (рН 6,0) в опухолевой ткани активность падает до нулевых значений, а вот в смежной ткани снижается всего на 15% (Рис.4).
влияние солянокислого ацидоза на активность АДА в гомогенате смежной ткани
34
^ зз
5 5 32
11 31 й 130
1^29
к о 28
£ I 27 ^ 26 25
1
2
3
Рис.4 Зависимость активности АДА от рН в смежных с опухолью тканях при добавлении соляной кислоты 1- активность АДА при рН = 7,0 2 - активность АДА при рН = 6,5 3 - активность
АДА при рН = 6,0
Таким образом, следует отметить различное влияние лактатацидоза и солянокислого ацидоза на активность АДА в тканях. Примечательно, что влияние лактата на активность АДА зависит от того, какая это ткань - опухолевая или смежная. Следует отметить, что лактат увеличивает активность АДА в гомогенате смежной ткани при рН 6,5. Можно было бы предположить, что рН 6,5 это оптимум рН для изучаемого фермента, но в пробе с таким же значением рН, но при добавлении соляной кислоты мы видим достоверное снижение активности АДА. Интересно, что в опухолевой ткани АДА более чуствительна к солянокислому ацидозу. Возможно, это связано с тем, что в узле опухоли гиперподукция лактата и так приводит к изменению рН в кислую сторону.
Одним из связующих звеньев между обменом нуклеиновых кислот и обменом углеводов может быть анион молочной кислоты - лактат. Лактат способен прямо взаимодействовать с ферментами. При увеличении концентрации лактата изменяется активность фермента нуклеотидного обмена - АДА.
Литература
1. Шатова О.П., Зинкович И.И., Борзенко Б.Г. Особенности гликолиза при раке молочной железы / Шатова О.П. // Патология - 2008 - №5.- С.133.
2. Шатова О.П., ЗЫкович М.Метаболмш змши адено-зиндезамшази та ¡мунного стану хворих при ендо-л1мфальнш xiMioTepaniï / Матерели 1-Ï науково-практично'1' конференцп "Актуальы питання патологи за умов fliï надзвичайних факторв на органам", 6-7 листопада 2008 р., м. Тернопть // Здо-бутки KniHiHHOï i експериментально'1' медицини. -С.160-161.
3. Fischer K., Hoffmann P., Voelkl S. et al. Inhibitory effect of tumor cell-derived lactic acid on human T cells //. Blood - 2007 - №.109.- P.3812-3819.
4. Gallagher S.M., Castorino J.J., Wang D., Philp N.J. Monocarboxylate transporter 4 regulates maturation and trafficking of CD147 to the plasma membrane in the metastatic breast cancer cell line MDA-MB-231 // Cancer Res.- 2001.- №.67.- P.4182-4189.
5. Gatenby,R.A., Gawlinski,E.T., Gmitro,A.F., Kaylor,B. and Gillies,R.J. Acid-mediated tumor invasion: a mul-tidisciplinary study // Cancer Res.-2006 - №.66. -P.5216-5223.
6. Naruse K., Yamada Y., Aoki S. et al. Lactate dehydrogenase is a prognostic indicator for prostate cancer patients with bone metastasis // Hinyokika Kiyo -2007 - №.53. - P.287-292.
7. Shime H., Yabu M., Akazawa T. et al. Tumor-secreted lactic acid promotes IL-23/IL-17 proinflammatory pathway // J. Immunol. - 2008 - №.180. -P.7175-7183.
Tom 9, Выпуск 4
165
Реферат
ВПЛИВ ЛАКТАТУ НА АКТИВНЮТЬ АДЕНОЭ1НДЕЗАМ1НАЗИ Шатова О.П., Хомутов G.B., 31нкович 1.1.
Ключов1 слова: лактат, обм1н пуршових нуклеотидв, аденозшдезамЫаза, рак молочноТ залози
В гомогенатах пухлинних та в сум1жних з пухлиною тканинах вивчений вплив лактату на активнють ключового ферменту обмшу пуршових нуклеотид1в - аденозшдезамшазу (АДА). Для пор1вняння вико-ристовували соляну кислоту. Була знайдено, що лактатацидоз i солянокислий ацидоз по-р1зному впливають на активнють АДА в р1зних тканинах. У гомогенат1 сум1жноТ з пухлиною тканини при рН 6,5, при додаванш лактату, активнють ферменту статистично BiporiflHO збтьшуеться у пор1внянн1 з актив-нютю ферменту при оптимальнш рН=7,0. В пробах з таким же значениям рН, але при додаванш со-ляно1 кислоти спостер1галося достов1рне зниження активносп АДА. Ц1каво, що в пухпиннш тканиш АДА чутлив1ша до солянокислого ацидозу.
Summary
INFLUENCE OF LACTATE ON ADENOSINE DEAMINASE ACTIVITY Shatova O.P., Khomutov Ye.V., Zinkovych I.I.
Key words: lactate, purine nucleotide metabolism, adenosine deaminase, breast cancer
In the homogenates of tumorous tissues and adjacent tissues there have been studied the effect of lactate on the activity of adenosine deaminase (ADA) which is known to be a key enzyme in purine metabolism. Hydrochloric acid was used for the comparison. It has been found out the lactate acidosis and hydrochloric acidosis have different effect on ADA activity in various tissues. In adjacent tissue when pH 6.5, on addition of lactate, enzyme's activity certain increased. At test of the same pH upon addition of hydrochloric acid ADA's activity decreased. It's interest that in tumor tissue ADA is more sensible that ones in adjacent tissue.
УДК: 616.831-001+546.41-008.9:616.71-007.234
РАССТРОЙСТВА КАЛЬЦИЕВОГО ОБМЕНА ПРИ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМЕ, ПРОТЕКАЮЩЕЙ НА ФОНЕ СТЕРОИДНОГО ОСТЕОПОРОЗА
Шпаченко H.H., Зенько H.A., Золотухин С.Е., Чирах Т.М. Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького
Работа посвящена выявлению особенностей и основных закономерностей формирования нарушений кальциевого обмена при черепно-мозговой травме, протекающей на фоне стероидного ос-теопороза. В работе использованы физиологичные, патофизиологические, рентгенологические, биохимические, иммуноферментные и статистические методы. Установлены новые механизмы расстройств кальциевого обмена, которые уточняют диагностику и оценку тяжести черепно-мозговой травмы, протекающей на фоне глюкокортикоидного остеопороза. Показано, что отягощение течения посттравматической реакции остеопорозом вызывается механизмом недостаточной продукции КТ, соответствующими изменениями ПТГ, ТТГ, Т4, Т3 и показателями гиперцитокинемии. Ключевые слова: черепно-мозговая травма, глюкокортикоидный остеопороз, обмен кальция, цитокины.
Современный этап развития общества харак- соединения к ней шока - она увеличивается до теризуется неуклонным ростом травматизма, 90 % [4, 10].
увеличением частоты и тяжести сочетанных по- В последние годы растет частота заболеваний, для лечения которых больные вынуждены длительное время применять глюкокортикоид-ные гормоны и их аналоги [1, 7]. Их используют при ряде ревматических, аллергических, онкологических заболеваний. Вместе с лечебной эффективностью глюкокортикоидных препаратов при указанных заболеваниях, растет и частота осложнений в виде остеопороза [2, 7].
Тяжелая механическая травма, особенно травма головного мозга, полученная на фоне глюкокортикоидного остеопороза, характеризуется высокой летальностью и частотой осложнений [2, 9, 10]. В настоящее время механизмы
вреждений [4, 5, 10]. По данным ВООЗ смертность от травм занимает третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, а у людей в возрасте до 40 лет выходит на первое место [3]. В структуре общего травматизма поражения головного мозга составляют 25-30 % [9]. На долю черепно-мозговой травмы (ЧМТ) приходится 2/3 смертельных исходов [8]. Среди всех сочетанных повреждений сочетан-ная ЧМТ составляет 89,4 % [10]. Травмы мозга являются одной из причин высокой инвалидности и временной утраты трудоспособности [3, 9]. Летальность от ЧМТ возрастает в случае при-
