CC BY
32
К.С. Десятниченко 1, И.И. Селезнева а,
С.Г. Курдюмов 1
Влияние композиции костных неколлагеновых белков на остеогенную дифференцировку фибробластов эмбрионов мышей
1 НПО «ПОЛИСТОМ», Москва, Россия
2 ИТЭБФ, Пущино, Россия
K.S. Desyatnichenko, l.l. Seleznjova, S.G. Kurdyumov.
Influence of the composition of bone noncollagtnous proteins at osteogenous differentiation of fibroblasts embryos mice
Известно, что зрелая компактная костная ткань в качестве минорной фракции содержит композицию водорастворимых белков неколлагеновай природы (НБК), имеющих электрофоретическую подвижность в области 61 и 62 глобулинов, аффинных к коллагену и ортофосфатам кальция, дозозависимо влияющих на пролиферацию и дифференцировку клеток мезенхимального происхождения (К.С. Десятниченко с соавт., 1982-2000). Перечисленные свойства были использованы при создании серии остеопластических материалов (патент РФ № 2317088), прошедшей все регламентные испытания и разрешенной к клиническому применению. Необходимость дальнейшего совершенствования медицинских изделий, предназначенных для регенерации костной ткани в ортопедии, стоматологии, челюстно-лицевой хирургии и пр., побудило нас исследовать влияние композиции НБК на остеогенную дифференцировку культивируемых in vitro фибробластов эмбрионов мыши.
Для испытания выбран раствор НБК крупного рогатого скота, приготовленных, как ранее было описано (V. Shevcov, К. Desyatnichenko, 1997), осветленный и стерилизованный ультрафильрацией последовательно через фильтры 0,44 и 0,22 мкм (Millipor, США) с исходной концентрацией 475 мг/л в деионизированной воде.
Исследование проводили с использованием первичной культуры фибробластов мыши, полученных из кожно-мышечной ткани 1 3 дневных эмбрионов мышей линии C57BL/6-Tg(ACTbEGFP)1 Osb/J. Трансгенные мыши с геном-репортером, кодирующим синтез улучшенного зеленого флуоресцирующего белка (EGFP) под контролем промотора в-актина цыпленка, были получены из Jackson Laboratory (США) с любезного разрешения А.В. Червонского. Клетки культивировали при температуре 37°С в атмосфере 5% С02в среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки коров (ЗТС) и 100 Ед/мл пенициллин/стрептомицина.
Культура клеток на 5 пассаже была использована для тестирования материалов в различных вариантах дополнительных добавок.
1. Среда 1 — без дополнительных добавок (контроль).
2. Среда 2 — с добавкой 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ p-глицерофосфата и 0,1 мкМ декса-метазона (стандартная среда, стимулирующая остеогенную дифференцировку).
3. Среда 3 — 0,1 мкМ дексаметазона, 20 нг/мл фактора роста фибробластов основного (bFGF).
4. Среда 4 — 0,1 мкМ дексаметазона и 47,5 нг/мл НБК (разведение в 100 раз).
5. Среда 5 — 0,1 мкМ дексаметазона и 4,75 мкг/мл НБК (разведение в 1000 раз).
6. Среда 6 — 0,1 мкМ дексаметазона и 0,475 мкг/мл НБК (разведение в 10 ООО раз).
Клетки высевали на поверхности образцов с плотностью 15 тыс./см2и культивировали в течение 20 сут., при этом объем среды составил 0,5 мл/лунку. Смену среды производили каждые 3^4 сут. После окончания культивирования клетки были промыты фосфатным буфером (pH = 7,4) и зафиксированы в течение 20 мин. в 3,7% забуференном растворе формальдегида.
После удаления фиксатора и промывки деионизованной водой клетки были окрашены 2% раствором ализаринового красного в течение 5 минут для выявления образования минерализованного матрикса по степени окрашивания соединений кальция и определения активности щелочной фосфатазы (ЩФ, КФ 3.1.3.1.), используя набор и для выявления активности щелочной фосфатазы (Sigma, Кат. № 86-R) по инструкции производителя. Исследовали на микроскопе Axiovert 200.
Получены следующие результаты. В контроле отсутствовала спонтанная дифференцировка клеток в остеогенном направлении. Среда 2 — в данном эксперименте было показано, что используемые клетки способны дифференцироваться в остеогенном направлении и продуцировать кальцийсодержащий матрикс. Среда 3 — показала способность к индукции остеогенной дифференцировки у сравнительно небольшого числа клеток. Среда 4 показала наибольшую активность в стимуляции жизненной активности клеток (она быстрее всех сред закислялась клетками), на 20-е сут. культивирования видны множественные центры кальцификации небольшого размера, что говорит о более позднем начале дифференцировки, чем в среде 2. Морфология клеток в центрах кальцификации соответствует фенотипу остеобластов. Среда 5 — показала меньшее число кальциевых узелков, чем в среде 4 при меньшей интенсивности окраски на ЩФ, однако была более активной, чем среда 3. Среда 6 — практически не оказывала дифференцирующего действия. Отмечены лишь единичные клетки, продуцирующие минерализованный матрикс. В этой и меньшей концентрации композиция НБК стимулирует пролиферацию фибробластов из свода черепа эмбрионов, подавляемую в данном эксперименте дексаметазоном (К.С. Десятниченко, О.П. Березовская, 1990).
Таким образом, в настоящей работе подтверждено, что композиция НБК, содержащая, как установлено, ряд местных факторов роста (Е. Canalis, 1984; R.D Fincelman, 1992; P.J. Boyne, 1990; T.L. Me Cartny, M. Centrella, 2000 e.a.). стимулирует остеогенную дифференцировку эмбриональных фибробластов in vitro и способна повышать остеогенные потенции тканеинженерных конструкций, предназначаемых для возмещения костных дефектов.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010
