CC BY
45
В. Миронов
Печатанье органов: тканевые сфероиды как строительные блоки
Медицинский университет Северной Каролины,
Чарльстон, США [email protected] V. Mironov
Organ printing: tissue spheroids as building blacks
Печатанье органов может быть определено как роботизированное послойное строительство трехмерных жизнеспособных биоартифициальных тканей и органов с использованием тканевых (клеточных) сфероидов в качестве составных элементов. Получение тканеподобных сфероидов позволяет использовать известные клеточные популяции, стандартизировать состав и предсказуемые свойства. Таким образом становится возможным собирать небольшие участки внутриорган-ной сосудистой сети, для чего используются цельные и просветные тканевые сфероиды.
Органное печатанье способно значитеьно расширить возможности тканевой инженерии. Кроме того, подобные технологии формируют новую парадигму развития биологии и биопротезирования
Ш. Миталипов
Плюрипотентные клетки в онтогенезе
Oregon National Primate Research Center, Oregon Stem Cell Center, Department of Obstetrics & Gynecology, Department of Molecular & Medicals Genetics and Department of Pediatrics, School of Medicine, Oregon Health & Science University,
Орегон, США [email protected] Sh. Mitalipov
Pluripotent cells during development
Развитие млекопитающих начинается с тотипотент-ной зиготы — клетки, из которой развиваются все специализированные виды клеток взрослого организма. По мере развития клетки ранних эмбрионов размножаются и дифференцируются в первые 2 линии — плюрипотентные клетки внутренней клеточной массы и трофоэкто-дерму. Плюрипотентные клетки могут быть выделены из эмбриона, адаптированы и размножены in vitro с сохранением их недифференцированного состояния; они получили название эмбриональных стволовых клеток ИСК). ЭСК сохраняют способность дифференцироваться в клетки трех зародшевых листков зародыша: эктодерму, мезодерму и энтодерму или любой из более чем двухсот видов клеток взрослого организма.
Поскольку многие болезни человека развиваются в результате повреждений в одном из видов клеток, то следует рассматривать плюрипотентные стволовые клетки как неограниченный источник для заместительной терапии. Плюрипотентные клетки, напоминающие ЭСК, могут быть получены также и экспериментальным путем — методом перепрограммирования дифференцированных соматических клеток. Внесение изменений в геном соматических клеток, возможно, будет играть более важную роль в заместительной клеточной терапии, поскольку для этих целей возможно использовать аутогенный материал, что устраняет иммунологические проблемы при трансплантации.
В докладе будут обсуждаться два подхода к перепрограммированию соматических клеток: 1) перенос ядер соматических клеток и 2) прямое перепрограммирование с использованием генетических манипуляций.
Схема развития организма и перепрограммирования соматических клеток. Онтогенез начинается с одной клетки -зиготы. Зигота и каждый бластомер раннего эмбриона тотипотентны, т.е. помимо возможности дифференцироваться во все многообразие клеток, они несут в себе потенциал к развитию в целый организм. Походу эмбрионального этапа онтогенеза дифференцироваочный потенциал отдельных бластомеров постепенно уменьшается, в результате дочерние клетки постепенно переходят в плюрипотентное состояние, затем - мульти-, унипотентные клетки, а в дальнейшем в терминально дифференцированное состояние. Однако путем перепрограммирования соматических клеток можно восстановить плюрипотентный статус клеток
В.М. Михайлов
Клеточная терапия моногенных заболеваний на примере миодистрофии мышей mdx
Группа генетики клеточных популяций
Отдела внутриклеточной сигнализациии транспорта
Института цитологии РАН,
Санкт-Петербург, Россия [email protected]
V.M. Mikhailov
Cell therapy of monogenic diseases by the example miodistrofii mdx mice
Группа моногенных заболеваний включает в себя многочисленные формы патологии, обусловленные мутациями чаще всего структурных генов. Спектр заболеваний постоянно расширяется в связи с успехами молекулярной диагностики. Возможности лечения, как правило, ограничены лекарственной терапией. В настоящее время накапливаются данные об использовании как генной, так и клеточной терапии при лечении моногенных заболеваний. Клеточная терапия включает в себя как местную или общую трансплантацию стволовых клеток дикого типа, так и замену мутантных популяций стволовых клеток костного мозга на стволовые клетки дикого типа. Последний подход используется при лечении серповидно-клеточной анемии и ß-талас-семии. Известно, что стволовые клетки костного мозга участвуют в регенерации не только клеток гемопоэ-тического ряда, но также мышц и нервных клеток. Представляет интерес возможность использования замены мутантного костного мозга на костный мозг дикого типа при лечении нейромышечных заболеваний.
Одним из распространенных моногенных заболеваний такого типа является миодистрофия Дюшенна, при которой нарушен синтез белка дистрофина. На экспериментальных моделях мышей и собаках показано, что некоторые типы клеточных линий с выраженными стволовыми свойствами при местной трансплантации в аллогенных условиях оказывают на мышечные ткани значительный терапевтический эффект, оцениваемый по усилению синтеза дистрофина,снижению уровня клеточной гибели и другим признакам дифференци-ровки. Однако продолжительность терапевтического эффекта ограничена во времени. В наших экспериментах однократная трансплантация в сингенных условиях стволовых клеток костного мозга дикого типа усиливала синтез дистрофина через 4—6 мес. только у 2% мышечных волокон. По литературным данным синтез дистрофина также не усиливается при трансплантации мутантным мышам mdx костного мозга дикого типа после смертельного рентгеновского облучения в дозах 7 и 11 Гр. В наших экспериментах на радиационных химерах мышей mdx замена мутантного костного мозга после рентгеновского облучения в дозе 5 Гр на костный мозг дикого типа через 2 мес. вызывала синтез дистрофина только у 1,2% мышечных волокон. Факт транскрипционной инертности трансплантированных стволовых клеток костного мозга, ядра которых входят в состав мышечных волокон, общепризнан. Нам удалось преодолеть транскрипционную инертность ядер трансплантированных стволовых клеток после воздействия на радиационных химер мышей mdx Са-специфи-ческого параметрического (циклотронного) магнитного резонанса, в результате которого синтез дистрофина через 2 мес. после трансплантации был обнаружен у 16% мышечных волокон. Также было показано, что у радиационных химер мышей mdx после облучения в дозе 3 Гр трансплантация стволовых клеток костного мозга дикого типа приводит через 2 и 6 мес. к усилению синтеза дистрофина у 4 и 27% мышечных волокон соответственно. Полученные данные указывают на возможность сравнительно быстрого преодоления транскрипционной инертности трансплантированных стволовых клеток в мышцах и на перспективность дальнейшего изучения замены мутантного костного мозга на костный мозг дикого типа для лечения моногенных заболеваний тканевых систем, которые имеют предшественники — стволовые клетки — в костном мозге.
Г.В. Мкртчян \ К.С. Десятниченко а, A.A. Докторов 3,
С.Г. Курдюмов а, Г.А. Воложин 1
Тестирование in vitro остеопластического
материала в гелевой форме
1МГМСУ, Москва, Россия
2 НПО «ПОЛИСТОМ», Москва, Россия
3 НИЦ БМТ ГНУ ВИЛ АР, Москва, Россия
G.V. Mkrtchyan, K.S. Desyatnichenko, A.A. Doctorov,
S.G. Kurdyumov, G.A. Volozhin
In vitro testing of a gel-formed osteoplastic material
Альтернативой имплантации остеопластического материала в виде керамики, гранул, губок, пластин в костные дефекты с целью их возмещения новообразованной костью, требующей открытого хирургического доступа, может быть использование остеопластического материала в виде геля, мягкой пасты, эмульсии, которые можно вводить в костный дефект с минимальной травматизацией здоровых тканей из шприца или
аналогичного устройства. Материалом такого назначения является «ИНДОСТ-гель + », разработаный в НПО «ПОЛИСТОМ» (патент РФ № 2360663), выпускаемый там же по ТУ 9391-008-77330104-2006, разрешенный для клинического использования, который получил положительную оценку и пользуется спросом у стоматологов различных специальностей и челюстнолицевых хирургов.
«ИНДОСТ-гель + » представляет собой композицию из ортофосфатов кальция — гидроксиапатит и трикаль-ций фосфат — в виде гранул и нанодисперсного порошка, комплекса полипептидов, обладающих свойствами факторов роста, из ксенокости, антиоксиданта и гелеобразующей основы — линейного полимера биологического или синтетического происхождения с тиксотропными свойствами. В настоящем сообщении приводятся данные о взаимоотношениях in vitro данного материала с мультипотентными мезенхимальными стро-мальными клетками (ММСК) из тканей пародонта.
Работу проводили с ММСК из губчатого вещества альвеолярного отростка челюсти и надкостницы челюсти, показавшими наилучшие показатели костеобразовательной активности и активности ЩФ. Клетки культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) («ПанЗко», РФ), 10% эмбриональной сыворотки коров («HyClon», Новая Зеландия) и 40 ед./мл гентамицина. Использовали культуральные флаконы площадью 25 см2 («Corning», США), которые инкубировали при 37°С в атмосфере с 5% углекислого газа в термостате (Sanyo МСО-15АС, Япония). По достижении клетками монослоя их пересевали, используя трипсин («ПанЗко», РФ) или смесь трипсин/Версен («ПанЗко», РФ) по обычной схеме. В работе использовали клетки 8—15 пассажа.
Клетки высаживали в культуральной среде в 24-или 96-луночные планшеты для культивирования клеток («Corning», США) с плотностью 1000 клеток на
1 см2. На следующий день вносили в лунки «Индост-гель+». Клетки с гелевым материалом культивировали
2 и 7 сут. Производили фотографические наблюдения и на определенном сроке для определения количества клеток в лунках производили МТТ-тест, основанный на способности дегидрогеназ в живых клетках восстанавливать водорастворимый желтый 3-(4,5-диметил-тиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в темно синий водонерастворимый формазан, который накапливается внутри клетки. Количество образовавшегося формазана, пропорциональное числу жизнеспособных клеток, измеряли спектрофотометрически на плашечном денситометре Chameleon V (Hidex, Финляндия).
Для индукции остеогенной дифференцировки клетки высаживали в культуральной среде в 24- или 96-луночные планшеты для культивирования клеток («Corning», США) в плотности 20 ООО клеток на 1 см2. На следующий день уже после внесения гелевого материала клетки переводили в среду следующего состава: среда DMEM, 10% эмбриональной сыворотки коров, 50 мкМ аскорбат-2-фосфата, 10 мМ р-глицеро-фосфата и 0,1 мкМ дексаметазона (все реактивы Sigma, США). Среду меняли каждые 3^4 сут. В качестве маркера остеогенной дифференцировки определяли активность щелочной фосфатазы (ЩФ). Активность щелочной фосфатазы определяли на сроках от 4-го до 21-го дня с использованием реактивов набора «Щелочная фосфатаза-Ново» (В-8327, Вектор-Вест, Россия) согласно инструкции производителя.
