CC BY
26
Г.А. Воложин 1, A.A. Докторов а, К.С. Десятниченко 3,
Г. В. Мкртчян 1
Тестирование in vitro остеогенных потенций недифференцированных клеток парадонтальных тканей
1МГМСУ, Москва, Россия 2 НИЦ БМТ ГНУ ВИЛ АР, Москва, Россия 3НП0 «ПОЛИСТОМ», Москва, Россия G.A. Volozhin, A.A. Doktorov, K.S. Desyatnichenko,
G.V. Mkrtchyan
Testing of osteogenic capacity of undeffirentiated cells of periodontal tissues in vitro
В стоматологии и челюстно-лицевой хирургии для возмещения костных дефектов все большее распространение находят технологии с использованием полученных от взрослых людей прогениторных клеток различной степени зрелости (М. Spector, 1999; P. Bianco, P. Robey, 2000). Ранее мы сообщали о возможности пролиферации in vitro клеток-предшественников остеогенеза из биоптатов губчатой кости (БГК), оболочки Гертвига (ОП и надкостницы альвеолярного отростка (НК), получаемых при санации ротовой полости (Воложин Г.А. с соавт., 2010). Известно, что предварительная дифференцировка ММСК в остеогенном направлении повышает эффективность клеточно-инженерной конструкции при имплантации в костный дефект (Р.В. Деев с соавт., 2008). В настоящем сообщении приводятся результаты, показывающие возможность остеогенной дифференцировки 3 типов клеток паро-донта.
Материал для цитологических исследований был получен от 25 пациентов в возрасте от 17 лет до 61 года: БГК —12, НК — 10, ОГ — 3. Образцы тканей с соблюдением асептики переносили в пробирки с кондиционной средой, и проводили 4 пассажа культивирования по стандартной методике, после чего подвергали криоконсервации. За сутки до нее заменяли культуральную среду, с помощью 0,25% раствора трипсина клетки снимали с подложки и переводили в ростовую среду с повышенным содержанием (40%) эмбриональной сыворотки коров. Полученную суспензию охлаждали до +4°С. Затем при тщательном перемешивании в нее добавляли диметилсульфоксид, для замораживания клеток до 10% общего объема. Полученную суспензию, содержащую примерно 1 млн клеток в мл, разливали по 1 мл в пробирки для криоконсервирования. Пробирки запаковывали в пенопластовые пеналы и на сутки помещали в кельвинатор с температурой -70°С. После этого пробирки переносили в специализированный сосуд Дюара с жидким азотом.
Клетки из тканей всех 3 типов исследовали на способность к колониеобразованию — доля колоний, содержащих более 16 клеток, при культивировании 100 клеток 4-го пассажа. Суммарное количество колоний, содержащих более 16 клеток, выраженное в процентах, мы называли эффективностью клонирования. Данный анализ, помимо эффективности клонирования, позволяет определить средний и максимальный размер колоний. Способность культивированных клеток к индукции остеогенной дифференцировки определяли после инкубирования в кондиционной среде без ФРФо, содержащей 50 мкМ аскорбат-2-фосфата, 10 мМ ß-глицерофосфата и 0,1 мкМ дексаметазона с измерением размеров костных узелков. Оценку активности щелочной фосфатазы (ЩФ, КФ 3.1.3.1) проводили по методу McGadey (1970), а способность экспресси-
рованного матрикса к минерализации — выявлением кальция ализариновым красным.
Сравнительный анализ всех культур ММСК, полученных из материала БГК, НК и ОГ, проводили с помощью визуального ранжирования по степени выраженности изучаемых признаков: способности образовывать минерализованный матрикс и активности ЩФ. Достоверность различий между группами сравнения определяли с помощью непараметрических критериев, составляя общие упорядоченные ряды.
Анализ полученных результатов показал, что в культурах клеток от всех пациентов после индукции остеогенной дифференцировки отчетливо выявлялись как костеобразующая активность ММСК, так и активность щелочной фосфатазы. При этом клетки, полученные из БГК, ОГ и НК имели сходные свойства. В то же время, можно отметить, что культуры ММСК, полученные из ОГ, всегда давали более интенсивную окраску ализариновым красным, формировали наиболее крупные костные узелки и чаще окрашивались на щелочную фосфатазу. Статистический анализ материала с помощью составления общих упорядоченных рядов подтвердил превышение костеобразующих свойств клеток ОГ над БГК (ри=0,05) и активности щелочной фосфатазы в культурах клеток ОГ по сравнению с культурами из НК (ри=0,05). Однако, не найдено различий в костеобразующих свойствах между ММСК из ОГ и НК (ри>0,05), так же, как и в активности ЩФ между МСК из ОГ и БГК (ри>0,05). Учитывая небольшое количество наблюдений в группе ОГ (п = 3), такой результат можно рассматривать лишь как тенденцию к более высокой способности к костеобразованию у клеток из ОГ, по сравнению с БГК и НК. Сравнение активности костеобразования и окраски на ЩФ между группами культур БГК и НК с использованием непараметрического U-критерия не обнаружило достоверных отличий (ри>0,05).
Таким образом, проведенное исследование показало, что в культурах ММСК из БГК, НК и ОГ после индукции остеогенной дифференцировки во всех случаях отчетливо прослеживались признаки костеобразования, заключающиеся в формировании минерализованного костного эквивалента. Их выраженность тесно коррелировала с активностью ЩФ, но не зависела от эффективности колониеобразования клеток.
Полученные данные доказывают возможность использования взятых при санации ротовой полости биоптатов губчатой кости, надкостницы и оболочки Гертвига для выделения, криоконсервации и размножения in vitro ММСК с сохранением их остеогенного потенциала. В дальнейшем эти клетки могут быть использованы для усиления остеоинтегративных свойств ткане-инже-нерных конструкций, применяющихся в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. В настоящее время ясно, что использование для этих целей размноженных in vitro ММСК предпочтительнее, чем применение препаратов диспергированного костного мозга, поскольку вызывает более быстрый и равномерно протекающий процесс костеобразования (J.E. Dennis, 1992). Существенным достоинством предложенных способов получения тканевых образцов является отсутствие для этих целей необходимости в проведении дополнительной хирургической процедуры, что позволяет отнести эту методику к категории малоинвазивных.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 3, 2010
