Научная статья на тему 'Пролиферативно-дифференцировочный потенциал мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани при культивировании в присутствии тромбоцитарного лизата'

Пролиферативно-дифференцировочный потенциал мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани при культивировании в присутствии тромбоцитарного лизата Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
475
140
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ТРОМБОЦИТАРНЫЙ ЛИЗАТ / МУЛЬТИПО-ТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ / КОЛОНИЕО-БРАЗОВАНИЕ / ПРОЛИФЕРАЦИЯ / ДИФФЕРЕНЦИРОВКА / PLATELET LYSATE / MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS / PROLIFERATION / DIFFERENTIATION / COLONY FORMATION

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Рогульская Е.Ю., Ревенко Е.Б., Петренко Ю.А., Петренко А.Ю.

Применение мультипотентных мезенхимальных стро-мальных клеток (ММСК) в клинической практике обусловливает необходимость поиска бессывороточных сред культивирования, способных поддерживать оптимальный рост и направленную дифференцировку клеток. Использование тромбоцитарного лизата (ТЛ) в качестве альтернативы ксеногенной фетальной сыворотке (ФС) позволяет осуществлять экспансию ММСК, полученных из жировой ткани человека. При этом тромбоцитарный лизат стимулирует пролиферативную активность клеток и увеличивает эффективность колониеобразования. При культивировании ММСК в присутствии 10% ТЛ выявляются колонии тех же типов, что и в присутствии 10% ФС, однако соотношение их изменяется в пользу плотных и смешанных колоний по сравнению с диффузными, также увеличиваются размеры и плотность колоний. Мезенхимальные стромальные клетки после экспансии в среде с тромбо-цитарным лизатом сохраняют способность к дифферен-цировке в остеогенном и адипогенном направлениях, при этом эффективность индуцированной остеогенной диффе-ренцировки их выше, чем у ММСК, прошедших экспансию в присутствии ФС. Результаты настоящей работы демонстрируют, что тромбоцитарный лизат является перспективным заменителем ксеногенной сыворотки при разработке технологий культивирования ММСК для регенеративной медицины и тканевой инженерии.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Рогульская Е.Ю., Ревенко Е.Б., Петренко Ю.А., Петренко А.Ю.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Proliferative and differentiation potential of adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells in the presence of platelet lysate

Clinical application of mesenchymal stromal cells requires the development of serum-free culture medium for optimal cell growth and differentiation. Platelet lysate as an alternative for xenogeneic fetal serum is able to promote expansion of human adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells. Platelet lysate stimulates the proliferative activity of cells and increases the efficiency of colony formation. When cultured mesenchymal stromal cells in the presence of platelet lysate we identified colonies of the same types as in the presence of fetal bovine serum, but their ratio changes in favor of dense and mixed colonies compared with diffuse colonies. Size and density of the cell colonies formed in the presence of platelet lysate are higher than in those in serum. After expansion in medium with 10% platelet lysate mesenchymal stromal cells retain the ability to differentiate into osteogenic and adipogenic directions while efficiency of osteogenic differentiation of these cells is better than of cells previously expanded in the presence of serum. The results of current study show that platelet lysate is a promising natural substitute for xenogeneic serum in optimizing culture technology of human mesenchymal stromal cells for regenerative medicine and tissue engineering.

Текст научной работы на тему «Пролиферативно-дифференцировочный потенциал мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани при культивировании в присутствии тромбоцитарного лизата»

Оригинальные исследования

63

ПРОЛИФЕРАТИВНО-ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК

жировой ткани при культивировании в присутствии тромбоцитарного лизата

ЕЮ. Рогульская, Е.Б. Ревенко, Ю.А. Петренко, А.Ю. Петренко

Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, Украина

Proliferative and differentiation potential of adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells in the presence of platelet lysate

O.Yu. Rogulska, ОБ. Revenko, YuA. Petrenko, A.Yu. Petrenko

Institute for problems of cryobiology and cryomedicine of National Academy of Sciences of Ukraine,

Kharkiv, Ukraine

Применение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в клинической практике обусловливает необходимость поиска бессывороточных сред культивирования, способных поддерживать оптимальный рост и направленную дифференцировку клеток. Использование тромбоцитарного лизата (ТЛ) в качестве альтернативы ксеногенной фетальной сыворотке (ФС) позволяет осуществлять экспансию ММСК, полученных из жировой ткани человека. При этом тромбоцитарный лизат стимулирует пролиферативную активность клеток и увеличивает эффективность колониеобразования. При культивировании ММСК в присутствии 10% ТЛ выявляются колонии тех же типов, что и в присутствии 10% ФС, однако соотношение их изменяется в пользу плотных и смешанных колоний по сравнению с диффузными, также увеличиваются размеры и плотность колоний. Мезенхимальные стромальные клетки после экспансии в среде с тромбо-цитарным лизатом сохраняют способность к дифферен-цировке в остеогенном и адипогенном направлениях, при этом эффективность индуцированной остеогенной диффе-ренцировки их выше, чем у ММСК, прошедших экспансию в присутствии ФС. Результаты настоящей работы демонстрируют, что тромбоцитарный лизат является перспективным заменителем ксеногенной сыворотки при разработке технологий культивирования ММСК для регенеративной медицины и тканевой инженерии.

Ключевые слова: тромбоцитарный лизат, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, колониеобразование, пролиферация, дифференцировка.

Введение

Постоянно возрастающее внимание к мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам (ММСК) обусловлено, прежде всего, возможностью их использования для лечения широкого спектра наследственных и приобретенных заболеваний человека. Благодаря способности к направленной дифференцировке, самообновлению и низкой им-муногенности ММСК также являются наиболее перспективным объектом для создания биоинженерных конструкций.

Основным источником ММСК до недавнего времени считался костный мозг [1], хотя они могут быть выделены и из других тканей взрослого человека: жировой и мышечной тканей, синовиальной мембраны, дермы, периферической и кордовой крови и др. [2]. Жировая ткань обладает рядом преимуществ перед другими источниками клеточного материала благодаря минимальной инвазивности процедуры получения, относительной доступности и высокому содержанию клеток-предшественников [3]. Было показано [4], что среди общей популяции клеток строе-mail: rog-helen@yandex.ru

Clinical application of mesenchymal stromal cells requires the development of serum-free culture medium for optimal cell growth and differentiation. Platelet lysate as an alternative for xenogeneic fetal serum is able to promote expansion of human adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells. Platelet lysate stimulates the proliferative activity of cells and increases the efficiency of colony formation. When cultured mesenchymal stromal cells in the presence of platelet lysate we identified colonies of the same types as in the presence of fetal bovine serum, but their ratio changes in favor of dense and mixed colonies compared with diffuse colonies. Size and density of the cell colonies formed in the presence of platelet lysate are higher than in those in serum. After expansion in medium with 10% platelet lysate mesenchymal stromal cells retain the ability to differentiate into osteogenic and adipogenic directions while efficiency of osteogenic differentiation of these cells is better than of cells previously expanded in the presence of serum. The results of current study show that platelet lysate is a promising natural substitute for xenogeneic serum in optimizing culture technology of human mesenchymal stromal cells for regenerative medicine and tissue engineering.

Key words: platelet lysate, multipotent mesenchymal stromal cells, colony formation, proliferation, differentiation.

мально-сосудистой фракции жировой ткани ММСК составляют около 1—5 %, в то время как в аспирате костного мозга — лишь 0,001—0,01 %.

Перспективы широкого клинического применения ММСК во многом определяются возможностью их получения в количестве, достаточном для аутологичной трансплантации. Культивирование in vitro дает возможность получить миллиарды клеток к 3-4-му пассажу всего лишь из 10 граммов жира [5]. Экспансию ММСК обычно проводят в присутствии 10% фетальной сыворотки (ФС) крупного рогатого скота. Однако с применением ксеногенной сыворотки связан риск передачи прионных и вирусных инфекций, а также вероятность иммунного ответа после введения в организм пациента [2, 6]. Такие недостатки ФС обусловливают необходимость поиска альтернативных компонентов, способных обеспечить оптимальный рост и дифференцировку клеток.

В последнее время появились обнадеживающие результаты о перспективности использования аутогенной сыворотки, сыворотки кордовой крови и обогащенной тромбоцитами плазмы (тромбоцитарного

Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014

64

Оригинальные исследования

лизата, ТЛ) [7,8] в качестве добавки в среду культивирования. Установлено [9, 10], что ТЛ человека содержит уникальный комплекс ростовых факторов, таких как PDGF, ILGF, TGFp1, TGFp2, EGF, FGF, IL-1 и др., способный регулировать широкий спектр клеточных реакций от миграции до митогенеза и дифференцировки. В работах [9,11, 12] показано стимулирующее действие ТЛ на пролиферацию эндотелиальных клеток, фибробластов и ММСК различного происхождения. ММСК, культивированные в среде, содержащей ТЛ, сохраняют способность к направленной мультилинейной дифференцировке и специфический иммунофенотип CD29 + , CD73 + , CD90 + , CD105 + , CD34- и СD45- [13].

Целью данного исследования была сравнительная оценка пролиферативно-дифференцировочного потенциала ММСК жировой ткани взрослого человека при культивировании в средах, содержащих эмбриональную сыворотку или тромбоцитарный лизат.

Материал и методы

Приготовление тромбоцитарного лизата (ТЛ). Для получения ТЛ цельную кровь (500 мл) взрослых доноров (n = 5) фракционировали путем двукратного центрифугирования. В результате первого центрифугирования (680 g, 15 мин.) плазму, содержащую тромбоциты, отделяли от эритроцитов и лейкоцитов. Концентрирование тромбоцитов достигали при последующем центрифугировании при 2400 g (20 мин). После удаления верхней фракции бедной тромбоцитами плазмы, полученный препарат (~3х1010 тромбоцитов/мл) лизировали путем троекратного замораживания-отогрева и хранили при -20°C. Для нивелирования индивидуальных различий в содержании ростовых факторов аликвоты ТЛ от 5 доноров перед использованием смешивали, центрифугировали и фильтровали.

Выделение и культивирование клеток. Жировую ткань получали в результате хирургического удаления жировых отложений у взрослых пациентов с соблюдением норм комиссии по биоэтике ИПКиК НАН Украины после информированного письменного согласия доноров. ММСК жировой ткани получали, согласно методу, описанному нами ранее с небольшими модификациями [14]. Для этого к фрагментам жировой ткани добавляли раствор 0,1% коллагена-зы II типа (Sigma, США) в объемном соотношении 1:3, а взвесь фрагментов инкубировали в течение 1,5 ч при 37°С и интенсивном перемешивании со скоростью 500—1000 об./мин. Полученную суспензию центрифугировали при 1500—2000 об./мин в течение 20 мин. Осадок ресуспендировали в 10 мл раствора Хенкса и фильтровали через систему для переливания кровезаменителей. Очищенную от детрита суспензию центрифугировали при 1000 об./мин в течение 10 мин. Полученный осадок представлял собой стромально-сосудистую фракцию жировой ткани, содержащую ММСК.

Экспансию ММСК проводили в среде a-MEM (Sigma, США), дополненной 10% ФС (РАА, Австрия) или 5% и 10% ТЛ, 2 мМ L-глутамина, 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина при 37°С, 5% СО2 и 95% влажности. В среду, содержащую ТЛ, дополнительно вносили 2 IU/мл гепарина для предотвращения желирования. При достижении клетками 70% конфлюэнтности культуру пассиро-

вали в соотношении 1:3 по стандартной методике с использованием смеси трипсин-версен (1:4). Для исследований использовали клетки 4-6-го пассажей.

Оценка морфологии и пролиферации ММСК жировой ткани. Прижизненные микроскопические наблюдения, микрофотосъемку, а также анализ окрашенных азур-эозином препаратов культур клеток выполняли с использованием инвертированного микроскопа CETI (Бельгия), снабженного цифровой камерой Nikon CoolPix 4500.

Прирост клеток в культурах с ФС или 5 и 10% ТЛ определяли в условиях монослойного культивирования после посева ММСК в равных концентрациях (5х103/см2) на поверхность адгезивного пластика. Через 7 сут. культивирования проводили трипсини-зацию культур и прямой подсчет количества клеток.

Оценка эффективности колониеобразования. Эффективность колониеобразования оценивали при посеве ММСК в культуральные флаконы площадью 25 см2 в концентрации 40 кл./см2 в среде a-МЕМ, дополненной 15% ФС [15] или 10% ТЛ, 50 ед/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина и 0,2 мМ L-глутамина. Через 14 сут. культивирования колонии фиксировали 70% спиртом и окрашивали азур-эо-зином по Романовскому — Гимза. Затем подсчитывали число колоний, определяли их размер и количество клеток.

Направленная адипогенная дифференцировка ММСК. Для индукции адипогенной дифференци-ровки после экспансии в ФС или ТЛ, клетки переводили в культуральную среду a-МЕМ с 10% ФС, L-глутамином и антибиотиками, содержащую индукторы адипогенеза: 0.5 мМ 3-изобутил-1-метил-ксантин (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 1 uM дек-саметазон (Sigma-Aldrich), 10 ug/мл инсулина, и 100 uM индометацина (Sigma-Aldrich). Через 21 день культивирования клетки фиксировали в 4% забуференном формалине в течение 30 мин при 4°C и окрашивали раствором Oil Red O (30 мг/мл в 60% растворе изопропанола).

Эффективность адипогенной дифференцировки определяли как процентное соотношение клеток с липидными включениями, позитивно окрашивающихся Oil Red O, к общему количеству клеток. Определение общего количества клеток проводили путем прямого подсчета по ядрам, окрашенным 4',6-диа-мидино -2-фенилиндолом — DAPI.

Направленная остеогенная дифференцировка ММСК. Для индукции остеогенной дифференци-ровки после экспансии в ФС или ТЛ, клетки переводили культуральную среду a-МЕМ с 10% ФС, L-глутамином и антибиотиками, а в качестве индукторов использовали 20 mM аскорбиновую кислоту (Sigma-Aldrich, США), 10 mM р-глицеролфосфат (Sigma-Aldrich, США) и 1 uM дексаметазон (Sigma-Aldrich, США). После 21 дня культивирования клетки фиксировали в 4% забуференном формалине в течение 30 мин. при 4°C. Экспрессию щелочной фосфатазы определяли с помощью набора Fast Blue RR Salts/Naphtol kit (Sigma-Aldrich) согласно инструкции производителя.

Эффективность остеогенной дифференцировки определяли как процентное соотношение клеток, экспрессирующих щелочную фосфатазу, к общему количеству клеток. Определение общего количества клеток проводили путем прямого подсчета по ядрам, окрашенным 4',6-диамидино-2-фенилиндолом — DAPI.

Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014

Оригинальные исследования

65

Статистический анализ. Результаты представляли как среднее ± стандартное отклонение. Для оценки статистической значимости различий между группами использовался t-критерий Стьюдента для независимых переменных, при уровне значимости p<0,05.

Результаты

ММСК жировой ткани при культивировании в среде с 10% ФС или 5% и 10% ТЛ характеризовались типичной фибробластоподобной морфологией. При дополнении ростовой среды ТЛ, размеры клеток были меньше, а форма более вытянутой.

Для оценки влияния различных концентраций ТЛ (5 и 10%) на скорость роста клеточных культур, ММСК в равном количестве помещали на поверхность адгезивного культурального пластика. Через 7 сут. культивирования количество клеток в культурах с 10% ФС увеличилось в 2 раза (рис. 1). В среде, содержащей ТЛ, пролиферативная активность была значительно выше: количество клеток в культурах с 5% ТЛ возрастало в 3 раза, а с 10% ТЛ — в 4,8 раз. В связи с этим, в дальнейших исследованиях использовали ТЛ в концентрации 10%.

Эксплантация клеток с низкой посевной плотностью и последующее культивирование в ростовой среде на основе a-МЕМ позволило определить количество колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-ф). Так, при посеве 1000 клеток во флакон площадью 25 см2 с ФС наблюдалось формирование в среднем 34—36 фибробластных колоний. В присутствии 10% ТЛ эффективность колониеобразования была в 1,9 раз выше, количество колоний во флаконе варьировало от 59 до 89.

В зависимости от размера и плотности упаковки клеточных элементов, образовавшиеся колонии как в ФС, так и в ТЛ могли быть распределены на три типа: плотные (I тип), смешанные (II тип) и диффузные (III тип). Колонии первого типа (рис. 2А) обладали большими линейными размерами (5,6—8,6 мм) и были представлены мелкими, веретеновидными клетками, плотно прилегающими друг к другу. Для плотных колоний было характерно наличие выраженного центра с характерной упаковкой в фибро-бластные «потоки» на периферии. Смешанные колонии включали в себя (3,1—5,5 мм) как вытянутые, сильно распластанные клеточные элементы, так и полигональные (рис. 2Б). В диффузных колониях (1,2—3,0 см) преобладали отросчатые фибробластоподобные клетки, которые располагались разреженно и практически не контактировали между собой (рис. 2В).

Анализ количественного соотношения клеточных колоний разных типов в культурах с ФС и ТЛ выявил значительные отличия: при дополнении среды культивирования 10% ТЛ преобладали плотные и смешанные колонии, тогда как в ФС 80% колоний были диффузными (табл.).

На следующем этапе определяли влияние экспансии в ФС или ТЛ на эффективность направленной дифференцировки ММСК in vitro. При культивировании в адипогенной среде уже через 6 сут. индукции как в ФС, так и в ТЛ культурах выявлялись клетки округлой формы с вакуолями, содержащими нейтральные липиды, которые позитивно окрашивались Oil Red О (рис. 3А, Б). Размер липидных включений в клетках после экспансии в среде с ТЛ, был меньше, чем в культуре с ФС (рис. 3Б).

700 ----------------------------------------* # &

Рис. 1. Пролиферация ММСК в культурах с ФС и ТЛ (* — P<0,05 по отношению к первому дню культивирования; # — P<0,05 по отношению к группе 10% ФС; & — P<0,05 по отношению к 5% ТЛ)

А

.s' •

Б

Рис. 2. Виды колоний, образованных ММСК жировой ткани 4—6-го пассажей после 14 сут. культивирования в присутствии ТЛ:

А — плотные;

Б — смешанные;

В — диффузные. Окраска: азур-эозин.

Ув. х10

Соотношение клеточных колоний различных типов в культурах с ФС и ТЛ

Добавка в среду культивирования Тип колоний по размеру и плотности упаковки клеточных элементов

Плотные >600 клеток Смешанные 150-550 клеток Диффузные 30-100 клеток

ФС 4% 16% 80%

ТЛ 24% 33% 43%

Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014

66

Оригинальные исследования

На 21 сут. индукции остеогенной дифференци-ровки большинство клеток в обеих группах экспрессировали щелочную фосфатазу (ЩФ) (рис. 3В, Г), которая является ранним маркером остеогенеза.

Оценка дифференцировочных свойств ММСК жировой ткани после экспансии в средах, содержащих ФС или ТЛ, показала различия в эффективности

остеогенной дифференцировки клеток (рис. 4). Так, после культивирования ММСК в присутствии ФС количество ЩФ+ клеток составляло 76%±4%, а после экспансии в среде с ТЛ данный показатель был на 14% выше (р<0,05). Спонтанная дифференцировка в остеогенном и адипогенном направлениях не отличалась между группами и составляла менее 4%.

Рис. 3. Результат индукции направленной дифференцировки ММСК после экспансии в ФС или ТЛ: адипогенной (А, Б] и остеогенной (В—П: A, В — ММСК после экспансии с 10% ФС;

Б, Г — ММСК после экспансии с 10% ТЛ. Ув. х20

100

90

80

70

60

50

40

30

4 20 £

10

0

ш £ о. 5

■8-

■8-

Рис. 4. Эффективность адипогенной и остеогенной дифференцировки ММСК после экспансии с ФС и ТЛ (* — P<0,05 по отношению к группе с 10% ФС)

Обсуждение

В связи с весьма обнадеживающими результатами клинического применения ММСК, все более актуальной становится проблема разработки безопасных и стандартизованных методов получения необходимого количества клеточного материала. Экспансию клеток in vitro традиционно проводят в среде, дополненной ФС, которая служит источником питательных веществ и ростовых факторов. Однако с использованием ксеногенной ФС связан риск передачи реципиенту бактериальных, вирусных и микотических инфекций [16]. Кроме того, высока вероятность развития иммунного ответа организма на белки животного происхождения [6].

С целью повышения биологической безопасности разрабатываются альтернативные бессывороточные питательные среды, способные поддерживать рост клеток в культуре. Установлено, что в присутствии ТЛ повышается пролиферативный потенциал ММСК, кроме того клетки сохраняют стабильность фенотипа [9]. Исследования M. Lohmann и соавт. показали, что

наличие ТЛ в среде экспансии увеличивает пролиферацию ММСК костного мозга в 1,4 раза, а жировой ткани — в 5 раз по сравнению с ФС [17]. По данным I.S. Blande и соавт. через 5 дней культивирования в среде, содержащей ТЛ, количество ММСК жировой ткани было в 8—9 раз выше, чем при экспансии в ФС [13]. В нашей работе ТЛ в концентрации 10% увеличивал прирост клеток в 3 раза по сравнению со стандартными условиями культивирования. Такое активизирующее действие на скорость роста клеточных культур очевидно обусловлено комплексным влиянием ростовых факторов, входящих в состав ТЛ.

Следует отметить, что ТЛ в концентрации 10% являлся более эффективным стимулятором пролиферации ММСК, чем 5%. Аналогичные результаты получены при анализе влияний различных концентраций (5%, 7,5%, 10%) ТЛ на ММСК костного мозга [18]. Концентрационно-зависимый стимулирующий эффект ТЛ на рост фибробластов человека в культуре после 3—4 пассажей был показан Н.В. Калмыковой и соавт. [12]. Однако при анализе индивидуальных различий ТЛ от разных доноров выявлено, что довольно высока частота встречаемости образцов с низким митогенным эффектом (каждый девятый образец).

При оценке эффективности колониеобразования ММСК жировой ткани было выявлено 3 типа колоний, отличающихся по плотности упаковки и морфологическим особенностям клеток. Полученные нами данные указывают, прежде всего, на неоднородность исходной популяции КОЕф. Известно, что одни клетки способны к 5—6 удвоениям, тогда как другие к 20 и более [19]. КОЕф с высоким пролиферативным потенциалом генерируют большее количество потомков и образовывают плотные крупные колонии. Клетки смешанных и диффузных колоний характеризуются более низкой пролиферативной активностью [20].

Культивирование клеток с низкой посевной плотностью в среде, содержащей ТЛ, приводило к формированию преимущественно плотных и смешанных колоний, тогда как в ФС большинство колоний принадлежали к диффузному типу. Кроме того в присутствии

Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014

Оригинальные исследования

67

10% ТЛ количество и размер образовавшихся колоний значительно превышал аналогичные показатели в ФС, что согласуется с работами [17, 21, 22], где авторы исследовали ММСК костного мозга. В то же время, по данным С. Doucet с саоавт., 5% ТЛ влиял только на размер образующихся колоний, а не на их количество, что может быть связано с различиями в выделении и культивировании исследуемых клеток [9]. Очевидно, что присутствие факторов роста ТЛ в среде существенно повышает реализацию пролиферативного потенциала ММСК. Одним из возможных объяснений этого явления может быть вхождение части «покоящихся» клеток, находящихся в фазе G0, в митотический цикл и последующее активное деление в культуре.

Особый интерес представляют результаты анализа эффективности направленной дифференцировки ММСК после экспансии в среде с ТЛ. Полученные данные свидетельствуют о том, что ТЛ способствует реализации остеогенеза: так, более 90% клеток через 21 день индукции экспрессировали щелочную фосфатазу. В некоторых работах представлены сходные результаты по влиянию ТЛ на остеогенную дифференцировку ММСК костного мозга [23, 24]. Предварительная экспансия клеток в ТЛ также повышает вероятность формирования кости после эктопической трансплантации in vivo на моделях у животных [23, 25]. Остеоиндуктивный эффект ТЛ вероятно обусловлен действием входящих в его состав BMP 2, BMP 4, BMP 6, IGF, TGF-p, остеогенина

ЛИТЕРАТУРА:

1. Bianco P., Riminucci M., Gronthos S. et al. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells 2001; 19 (3): 180-92.

2. Thirumala S., Goebel W.S., Woods E.J. Manufacturing and banking of mesenchymal stem cells. Expert Opin. Biol. Ther. 2013; 13 (5): 673-91.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

3. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 2002; 13 (12): 4279-95.

4. Zhu Y., Liu T., Song K. et al. Adipose-derived stem cell: A better stem cell than BMSC. Cell Biochem. Funct. 2008; 26 (6): 664-75.

5. Ra J.C., Shin I.S., Kim S.H. et al. Safety of intravenous infusion of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in animals and humans. Stem Cells Dev. 2011; 20 (8): 1297-308.

6. Lange C., Cakiroglu F., Spiess A.N. et al. Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine. J. Cell Physiol. 2007; 213 (1):18-26.

7. Bieback K., Hecker A., Kocaomer A. et al. Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow. Stem Cells. 2009; 27 (9): 2331-41.

8. Phadnis S.M., Joglekar M.V., Venkateshan V. et al. Human umbilical cord blood serum promotes growth, proliferation, as well as differentiation of human bone marrow-derived progenitor cells. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 2006; 42: 283-6.

9. Doucet C., Ernou I., Zhang Y. et al. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: a safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. J. Cell Physiol. 2005; 205 (2): 228-36.

10. Rauch C., Feifel E., Amann E.M. et al. Alternatives to the use of fetal bovine serum: human platelet lysates as a serum substitute in cell culture media. Altex. 2011; 28 (4): 305-16.

11. Kilian O., Flesch I., Wenisch S. et al. Effects of platelet growth factors on human mesenchymal stem cells and human endothelial cells in vitro. Eur. J. Med. Res. 2004; 9 (7): 337-44.

12. Калмыкова Н.В., Скоробогатая Е.В., Берестовой М.А. и др. Сравнительная характеристика тромбоцитарных лизатов от разных доноров. Клеточные технологии в биологии и медицине 2011; 2: 114-7.

13. Blande I.S., Bassaneze V., Lavini-Ramos C. et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion 2009; 49 (12): 2680-5.

14. Petrenko Yu.A., Petrenko A.Yu. Phenotypical properties and ability to multilineage differentiation of adipose tissue stromal cells during subculturing. Cytology and Genetics 2012; 46 (1): 36-40.

и остеонектина, которые стимулируют образование костной ткани [23-25].

При сравнении адипогенного потенциала ММСК жировой ткани после экспансии с ТЛ и ФС было установлено, что размер внутриклеточных липидных включений в ТЛ культурах был меньше, чем при использовании ФС, хотя количество клеток, вступивших в адипогенную дифференцировку, не отличалось. W. Xia и соавт. [26] при изучении ММСК костного мозга также описали менее эффективные процессы адипогенной дифференцировки в случае ТЛ. Эти результаты могут свидетельствовать о том, что ММСК после экспансии с ТЛ в большей степени предрасположены к остеогенной дифферен-цировке. При этом известно, что ингибирование адипогенной дифференцировки сопровождается одновременной индукцией остеогенеза [27]. Такие реципрокные взаимоотношения между двумя линиями дифференцировки обусловлены существованием общих сигнальных путей, реализация которых регулируется в зависимости от поступающих к клеткам сигналов [28].

Таким образом, замена ФС в среде культивирования на ТЛ приводит к повышению пролиферации, эффективности колониеобразования и усилению остеогенной дифференцировки ММСК жировой ткани человека. Результаты настоящей работы могут послужить основой для создания новых, эффективных и безопасных протоколов получения ММСК для клинического применения.

15. Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K., Lalykina K.S. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet. 1970; 3(4): 393-403.

16. Анисимов С.В. Ксеногенные риски в применении стволових клеток. Цитология 2012; 54 (4): 289-97.

17. Lohmann M., Walenda G. Hemeda H. et al. Donor age of human platelet lysate affects proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells. PLoS One 2012; 7 (5): e37839.

18. Bernardi M., Albiero E., Alghisi A. et al. Production of human platelet lysate by use of ultrasound for ex vivo expansion of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Cytotherapy 2013; 15 (8): 920-9.

19. Sethe S, Scutt A, Stolzing A. et al. Aging of mesenchymal stem cells. Ageing Res. Rev. 2006; 5 (1): 91-116.

20. Cordeiro-Spinetti E., De-Mello W., Trindade L.S. et al. Human Bone Marrow Mesenchymal Progenitors: Perspectives on an Optimized In Vitro Manipulation. Front. Cell Dev. 2014; 2: 7.

21. Sankaranarayanan K., Chandana T., Gency Ponrose G. et al. Humanised substitutes for animal sera in human mesenchymal stem cell culture and differentiation. Cell Biol. Int. 2011 [Epub ahead of print].

22. Bernardo M.E., Avanzini M.A., Perotti C. et al. Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches: further insights in the search for a fetal calf serum substitute. J. Cell Physiol. 2007; 211 (1): 121-30.

23. Chevallier N., Anagnostou F., Zilber S. et al. Osteoblastic differentiation of human mesenchymal stem cells with platelet lysate. Biomaterials 2010; 31 (2): 270-8.

24. Horn P., Bokermann G., Cholewa D. et al. Impact of individual platelet lysates on isolation and growth of human mesenchymal stromal cells. Cytotherapy 2010; 12 (7): 888-98.

25. Zaky S.H., Ottonello A., Strada P. et al. Platelet lysate favours in vitro expansion of human bone marrow stromal cells for bone and cartilage engineering. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2008; 2 (8): 472-81.

26. Xia W., Li H., Wang Z. et al. Human platelet lysate supports ex vivo expansion and enhances osteogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Cell Biol. Int. 2011; 35 (6): 639-43.

27. Jaiswal R. K., Jaiswal N., Bruder S. P. et al. Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated by mitogen_activated protein kinase. J. Biol. Chem. 2000; 275 (13): 9645-52.

28. Буравкова Л.Б., Гершович П.М., Гершович Ю.Г. и соавт. Механизмы гравитационной чувствительности остеогенных клеток-предшественников. Acta Naturae 2010; 2 (1): 30-9.

Поступила 25.04.2014

Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.