CC BY
85
К вопросу о фибробластоподобных клетках в периферической крови человека
И А. Хлусов ьз, КА. Нечаев 19,Н.М. Шевцова 2, М.Ю. Хлусова 2, М.В. Дворниченко12, К.В. Зайцев 4, Т.Д. Колокольцова 5, Е.Н. Больбасов1, Ю.П. Шаркеев Б,
ЕВ. Легостаева Б, И.Н. Сабурина 7
1 Томский филиал Российского научного центра «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. ГА. Илизарова Росмедтехнологий, Томск
2 Сибирский государственный медицинский университет, Томск
3Н0Ц «Биосовместимые материалы и биоинженерия» при Томском политехническом университете и Сибирском государственном медицинском университете, Томск
4 Томский НИИ курортологии и физиотерапии ФМБА России, Томск
5 ООО «Институт медицины и трансплантации клетки», Москва
6 Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, Томск
7 Институт патофизиологии РАМН, Москва
As to a problem of fibroblast-like cells in human peripheral blood
I A. Khlusov1-3, KA. Nechaev1-2, N.M. Shevtsova 2, M.Yu. Khlusova 2, M.V. Dvornichenko1-2,
K.V. Zaitsev 4, T.D. Kolokoltsova s, E.N. Bol'basov1, Yu.P. Sharkeev B, E.V. Legostaeva B, I.N. Saburina 7
1 Tomsk branch of Federal State Institution of Science «Russian Hizarov Scientific Center, Tomsk «Restorative Traumatology and Orthopedics» of Federal Agency of Health and Social Development»
2 Siberian State Medical University, Tomsk
3 Research and Education Center «Biocompatible Materials and Bioengineering» attached to Tomsk Polytechnic University and Siberian State Medical University, Tomsk
4 Tomsk SRI of Balneology and Physiotherapy, Tomsk
5 «Institute of medicine and transplantation of cell», Moscow
B Institute of Strength Physics and Materials Science of SB RAS, Tomsk 7 Research Institute of Pathophisiology RAMS, Moscow
Проведена оценка in vitro клеточных и молекулярных процессов в многоклеточной системе мононуклеарных клеток крови 4 здоровых добровольцев при кратковременном (52 ч) контакте с искусственными материалами, in vivo индуцирующими остеогенную дифференцировку мультипотент-ных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга. В качестве раздражителей использованы титановые диски (диаметр 10 мм) с композитным (полимерно-кальцийфос-фатным) и кальцийфосфатным покрытиями в остеогенной культуральной среде. Установлено с помощью цитологических, цитохимических методов и иммуноферментного анализа, что во фракции мононуклеарных лейкоцитов крови здорового человека может циркулировать до 18—29% стромальных, в том числе клоногенных клеток, индуцируемых in vitro к фибробластоподобной трансформации искусственным материалом с полимерно-кальцийфосфатной поверхностью. TNF— является одним из факторов, способствующих фиброб-ластоидной морфофункциональной активности мононуклеарных клеток крови при сокультивировании с полимерно-кальцийфосфатным материалом. Разработанная методология может оказаться полезной в приложении к задачам клеточной терапии и тканевой инженерии.
Ключевые слова: in vitro, имплантаты, мононуклеар-ные лейкоциты, клоногенная эффективность, TNF—.
In vitro estimation of cellular and molecular processes in multicellular system of blood mononuclear cells from 4 healthy volunteers under short-term (52 h) contact with artificial materials inducing in vivo osteogenous differentiation of bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells has been carried out. Titanium disks (10 mm diameter) with composite (polymer-calcium phosphate) and calcium phosphate coatings in osteogenous cultural media were used as irritants. It has been determined with the help of cytological, cytochemical methods and ELISA that up to 18—29% of stromal cells including clonogenic ones induced in vitro to fibroblastoid transformation by artificial material with polymer-calcium phosphate surface can circulate in mononuclear leukocytes fraction of healthy persons. TNF— is one of the factors promoting fibroblastoid morphophunctional activity of blood mononuclear cells coculturing with polymer-calcium phosphate material. The methodology developed may be useful in application of cell therapy and tissue engineering tasks.
Key words: in vitro, implants, mononuclear leukocytes, clonogenic effectiveness, TNF—.
По данным ряда авторов, в периферической крови человека обнаружена очень малая популяция прилипающих к пластику клеток, несущих морфологические и фенотипические характеристики мультипотент-ных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК)
[1, 2]. Вероятность выделения колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-Ф) из фракции мононуклеарных лейкоцитов человека варьирует от нуля у здоровых доноров [3] до 73% при мобилизации крови [4].
e-mail: khlusov63@mail.ru
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
Количество стромальных стволовых клеток увеличивается при иммуноселекции, а также заболеваниях или методиках, способствующих их выходу из костного мозга [5—7]. В частности, ранее нам удалось определить фибробластоподобные клетки в периферической крови больных несовершенным остеогенезом. При этом их доля в краткосрочной культуре увеличивалась по мере роста тяжести заболевания с 4 до 14% [8].
Необходимо подчеркнуть, что циркуляция в крови КОЕ-Ф, содержащих в составе колоний ММСК и стро-мальные предшественники [3, 6], была установлена ранее [9].
Следует отметить, что в свете активного поиска источника клеток для терапии, кровь человека более доступна по сравнению с другими источниками стволовых клеток. Однако, колониеобразующая эффективность КОЕ-Ф в крови здоровых доноров низкая, их труднее выявлять. Оценка данной популяции клеток, особенно у человека, представляет трудную задачу вследствие несовершенства методологических подходов к их выделению и культивированию. В конечном итоге это препятствует их дальнейшей характеристике и созданию клеточных препаратов, пригодных для клинического применения, тканевой инженерии и клеточной терапии [3].
Важным остается вопрос о количестве стромальных клеток различной степени зрелости, способных циркулировать в периферической крови здоровых людей [3, 6]. Поиск технологических приемов, направленных на решение данной задачи, представляет несомненный научно-практический интерес.
В связи с этим, была проведена оценка in vitro клеточных и молекулярных процессов, протекающих в многоклеточной системе мононуклеаров крови человека при кратковременном контакте с искусственными материалами, способными in vivo индуцировать остеогенную дифференцировку ММСК костного мозга [10, 11].
Материал и методы
В работе в качестве подложек для культивирования клеток применялись титановые диски ВТ1.0 (диаметр 10 мм, толщина 1 мм) с двусторонними биоактивными покрытиями.
В качестве связующего компонента для изготовления композитов на титановых подложках был выбран биоинертный сополимер тетрафторэтилена с ви-нилиденфторидом. Неорганической составляющей композитных покрытий служил синтетический гидро-ксилапатит (ГАП), фазовый состав которого доказан методом рентгенофазового анализа на дифрактометре Shimadzu XRD 6000. Раствор композита (соотношение органического и минерального компонентов 50:50 масс.%) наносили методом пневматического распыления на предварительно подготовленные и нагретые до 70°С титановые диски.
Кальцийфосфатные покрытия наносили на титановую подложку с помощью модификации способа анодно-искрового (микродугового) оксидирования в растворе 10% фосфорной кислоты, содержащей взвесь наноразмерных частиц ГАП синтетического происхождения [12]. Механохимический синтез на-норазмерного (диаметр частиц 10^40 нм) ГАП осуществляли, как описано ранее [13].
Растровую электронную микроскопию (РЗМ) рельефа искусственных поверхностей проводили на
установке Philips SEM 515 в материаловедческом центре коллективного пользования при Томском государственном университете.
Исследования выполняли с согласия локального этического комитета (протокол №4 от 01.10.2009) и ученого совета Томского филиала ФГУ РНЦ ВТО им. академика Г.А. Илизарова (протокол №7 от 27.10.2009). Использовали фракцию мононуклеарных лейкоцитов 4 доноров в возрасте 28^35 лет, не страдавших острыми и хроническими заболеваниями, подписавших информированное согласие на диагностическую процедуру. Периферическую кровь получали из локтевой вены, собирали в пробирки типа «Vacuette» для выделения мононуклеаров (BD Diagnostics, США). Кровь в стерильных условиях центрифугировали в течение 10 мин при 500 g на градиенте плотности Ficoll-Paque (Pharmacia, Швеция) (р = 1,077 г/см3) с последующим двукратным отмыванием клеточного материала от реактива.
Взвесь мононуклеаров, жизнеспособность которых составляла не менее 95%, культивировали в 12-лу-ночных планшетах (Orange Scientific, Бельгия) в течение 52 ч при температуре 36°С в концентрации 3x108 ядросодержащих клеток в 1 мл полной культуральной среды, содержащей 80% среды DMEM/F12 (GIBKO, Великобритания), 20% сыворотки крови эмбрионов коров (Sigma, США), 280 мг/л L-глутамина («Биолот», РФ), 50 мг/л гентамицина сульфат («Дар-ница», Украина), 10 мМ бета-глицерофосфата (Sigma-Aldrich, США), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты («Дальхимфарм», РФ), 10 8 М дексаметазона (КРКА, Словения).
Мононуклеарную фракцию лейкоцитов культивировали в лунках (площадь поверхности 346 мм2) с добавлением стерильного диска с кальцийфос-фатным или композитным (полимерно-кальций фосфатным) покрытием. Контролем служил рост клеток на пластике. В каждом случае использовали по 3 диска.
После культивирования супернатанты (кондиционные жидкости) получали путем забора надосадочной части клеточных культур, их центрифугирования в течение 10 мин при 500 д. В кондиционных средах методом ИФА реактивами Nordic Bioscience Diagnostics (Дания) оценивали маркеры костного ремоделирования (концентрацию остеокальцина, С-кон-цевых фрагментов молекул коллагена I типа (CrossLaps)), как описано ранее [14]. Кальций и неорганический фосфор измеряли колориметрическим стандартным методом [15]. Концентрацию фактора некроза опухоли-альфа TNF— в супернатантах определяли с помощью наборов для ИФА («Вектор Бест», Россия) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Учет результатов проводили по калибровочной кривой с использованием фотометра «Multiscan ЕХ» (США).
Мононуклеары крови, прилипшие к пластику, фиксировали 30 с в парах формалина, окрашивали на неспецифическую эстеразу по способу Леффлера, щелочную фосфатазу методом азосочетания по G. Gomori в модификации А.Г. Михеева (1972) или кислую фосфатазу методом азосочетания по A. Goldberg, Т. Вагка (1962) [16]. Применяли реактивы нафтол-AS-BI фосфат, а-нафтилацетат эстераза, прочный синий РР соль фирмы Lachema (Чехия). Кроме того, для исследования морфологии клеток препараты докрашивали гематоксилином в течение 5 мин.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
В каждом поле зрения (увеличение 400) считали долю окрашенных и неокрашенных клеток с округлой или фибробластоподобной морфологией, а также число кластерообразующих единиц фибробластов (КлОЕ-Ф), содержащих менее 50 клеток. Определяли площадь поля зрения (0,244 мм2) с использованием объект-микрометра 0М0, соответствующего ГОСТ 7513-75.
Результаты обрабатывали согласно методам компьютерной морфометрии [17, 181. Секреторную реакцию мононуклеаров крови здоровых добровольцев на контакт с искусственными материалами оценивали в процентном выражении от соответствующей реакции клеток на пластик.
Статистическую обработку данных выполняли с применением программы «STATISTICA 6.0 for Windows». Для описания изменчивости количественных признаков использовали общепринятые статистические процедуры, включая расчет параметров распределений (средние значения X, статистическую девиацию SD). Проверку на нормальность распределений осуществляли с помощью критерия Колмогорова — Смирнова. Для оценки статистической значимости различий применяли t-критерий Стьюдента, непараметрические критерии Вилкоксона (Т-тест) и Манна — Уитни (U-тест). Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.
Результаты и обсуждение
Существует прямое (свойства поверхности) и опосредованное через продукты деградации влияние имплантатов на жизнедеятельность клеток и тканей [19]. Использованные в работе имплантаты с обоими типами покрытий индуцируют остеогенную диф-ференцировку клеток костного мозга мышей в тесте эктопического костеобразования [10, 11], что подчеркивает их влияние на пул ММСК.
Постановка текущего эксперимента in vitro позволила выяснить морфофункциональное состояние клеток, прикрепляющихся к пластику вне зоны непосредственного контакта с искусственным материалом, находящимся в культуральной среде. В подобном случае реакция клеточной культуры связана с суммарным воздействием, опосредованным через их секреторную активность и продукты деградации изделий.
Проведенные исследования показали, что в остеогенной культуральной среде без дисков (контроль) морфология фибробластов отмечалась менее чем у
2,5% мононуклеарных лейкоцитов, прилипающих к пластику (рис.1). В то же время, в присутствии искусственных спутников (дисков) с композитным покрытием до 18^29% мононуклеаров периферической крови человека проявляли в культуре фиб-робластоподобную морфологию (табл.1, рис.1). При этом они демонстрировали положительную цитохимическую окраску на кислую фосфатазу и неспецифическую эстеразу (рис. 2, 3). Согласно обзору
О. Не с соавт. (2007), это соответствует ферментативному профилю ММСК в периферической крови человека.
Меньшая доля клеток (см. табл.1) проявляла слабую активность (в виде отдельных гранул) щелочной фосфатазы (рис. 4). При этом инициация активности ЩФ в культуре связана с продуктами деградации имплантатов, несущих КФ покрытие [20], в том числе с выходом в раствор ионов кальция и фосфора (табл. 2), и может свидетельствовать в пользу остеогенной дифференцировки стромальных клеток [21].
т
1 2 т
1 ■■ 2
л 1
Ш
□ 'Фибробласты окрашенные ■ Фибробласты неокрашенные
□ Округлые клетки окрашенные □ Округлые клетки неокрашенные
Рис. 1. Морфофункциональная характеристика мононуклеарных лейкоцитов человека, прилипающих к пластику и позитивно окрашивающихся на неспецифическую эстеразу, в различных условиях культивирования.
По оси абсцисс - исследуемые группы; по оси ординат -доля клеток в %. Доверительный интервал при р=0,05.
1 - культура клеток на пластике [контроль);
2 - сокультивирование клеток с дисками, несущими композитное покрытие
Таблица 1. Цитохимический профиль мононуклеарных лейкоцитов крови (% от числа клеток) здорового добровольца, прилипающих к пластику, при 52-часовом сокультивировании с дисками, несущими композитное покрытие, Х+БО
Кистая фocфатаза Щелочная фocфатаза Не^ецифичездая эстераза
Неокрашенные клетки Окрашенные клетки Неокрашенные клетки Окрашенные клетки Неокрашен. клетки Окрашенные клетки
фибро- бластоидные округлые фибро- бластоидные округлые фибро- бластоидные округлые
ЗS,З1±18,79* 2З,O2±1O,78 41,67±21,6З S8,41±19,O6 17,99±19,98 2З,6O±21,З8 44,29±9,7З* 29^±1З,92 26,67±12,18
n=1S n=1S n=1S n=9 n=9 n=9 n=14 n=14 n=14
<O,OO8 <O,OS
Примечание: * — статистические различия с долей клеток, негативных по щелочной фосфатазе согласно ^критерию Стьюдента; п — число полей зрения, в которых подсчитано 100 клеток.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
Рис. 2.
Культура мононуклеарных лейкоцитов крови человека при добавлении дисков с композитным покрытием. Окраска на кислую фосфатазу.
Ув. х750
Рис. 3. Культура мононуклеарных лейкоцитов крови человека при добавлении дисков с композитным покрытием. Окраска на неспецифическую эстеразу. Ув. х750
Рис. 4.
Культура мононуклеарных лейкоцитов крови человека при добавлении дисков с композитным покрытием.
Окраска на щелочную фосфатазу.
У в. х750
Возрастающая более чем в 2 раза концентрация CrossLaps в супернатантах культур мононуклеаров крови требует дальнейшего изучения. Однако, по существующим представлениям [21], этот факт предполагает формирование и ремоделирование коллагенового матрикса. Тем более, что стромальные клетки, окрашивающиеся на кислую фосфатазу, считаются фиброкластами [22] и остеокластами [21], ремоделирующими межклеточный матрикс соединительной ткани и ее производных.
По-видимому, присутствие в культуральной среде искусственных материалов, несущих фосфаты кальция, способствует усилению остеогенной диф-ференцировки клеточной культуры мононуклеаров крови. Циркуляция в крови взрослых людей фракции остеобластоподобных клеток, составляющей при длительном культивировании в остеогенной среде 1—2% мононуклеарных лейкоцитов и возрастающей при усилении костеобразования, показана в работе G.Z. Eghbali-Fatourechi с соавт. (2005) [23].
Одним из предполагаемых механизмов морфофункциональной трансформации клеток является выход из покрытий кальция, способного влиять на цитоскелет клеток [24]. Действительно, использованные нами в экспериментах диски с кальцийфосфатным покрытием активно растворяются в модельных биологических жидкостях [25]. При этом существуют кальций-зависимые и кальций-независимые пути выживания остеобластов [26].
Реакция клеток in vitro на контакт с искусственными поверхностями активно изучается [27]. Ответ мононуклеаров крови, включая цитокиновый профиль, различается в зависимости от свойств искусственных материалов [28].
Структура использованного нами композитного покрытия (рис. 5) представляет собой многоуровневую макропористую (линейный размер пор в пределах 100 мкм) систему, в которой частицы ГАП связаны между собой полимерным компонентом. Мезорельеф композита во многом напоминает структуру губчатой кости.
РЗМ исследование поверхности кальцийфосфат-ных покрытий, полученных с помощью микродугового оксидирования, показало выраженную микрошероховатость, образованную сферолитами с линейным размером до 30 мкм с единичными или многочисленными порами 5^20 мкм в диаметре (рис. 6).
Таблица 2. Секреторная активность мононуклеарных лейкоцитов крови, прилипающих к пластику, при 52-часовом сокультивировании с дисками, несущими композитное покрытие [в % от культуры клеток на пластике), Х+БО; п=3
Исследуемая группа Остеокальцин CrossLaps TNF-a Фосфор Кальций
Здоровые добровольцы п=3 116,67±42,36 238,80±9S,4S* <0,05 1679,66±767,30* <0,05 161,22±86,57 168,82±59,69
Примечание: * — статистически значимые различия с контрольной культурой клеток на пластике согласно Т-критерию Вилкоксона; п — число использованных дисков.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
■ мм
Рис. 5. РЭМ композитного [попимерно-капьцийфосфатного} покрытия на титановых подложках. У в. хЗОО
Рис. 6. РЭМ капьцийфосфатного покрытия на титановых подложках. Ув. хВ25
При сокультивировании с мононуклеарными лейкоцитами шероховатые диски с кальцийфосфатным покрытием не меняли их морфологию и не влияли на секрецию Т1\1Е-— (40,98 пг/мл с ошибкой среднего (т] 1,25 пг/мл при 41,74+0,60 пг/мл в культуре на пластике). С другой стороны, композитные (полимерно-кальцийфосфатные) пористые поверхности способствовали более чем 16-кратному повышению концентрации цитокина в кондиционных средах (табл. 2) и увеличению до 18^29% доли фибробластоподобных клеток (см. табл. 1). По-видимому, Т1МР— является одним из факторов, способных индуцировать фиброб-ластоидную трансформацию мононуклеаров крови в условиях их сокультивирования с материалом, несущим искусственное композитное покрытие.
Так, композитные имплантаты активируют моноциты/макрофаги [19], основные клетки-продуценты —
—
ляции ММСК [6], тормозящим их дифференцировку в остеобласты [30], стимулирующим пролиферацию фибробластов [31], их ферментативную и секреторную активности [29, 32].
Изучение клоногенной активности краткосрочной культуры мононуклеаров крови показало, что количество КлОЕ-Ф варьировало в пределах 0^3 кластера в каждом поле зрения (0,244 мм2). При этом, в случае использования искусственного раздражителя с композитным покрытием на 1 мм2 площади пластиковой поверхности наблюдалась плотность КлОЕ-Ф
в среднем около 7 кластеров, состоящих из 4^16 клеток (табл. 3, см. рис. 2). В среднем 56% клеток в составе кластеров окрашивались на кислую фосфатазу, 29% — на неспецифическую эстеразу.
В присутствии дисков, несущих кальцийфосфат-ное покрытие, плотность КлОЕ-Ф составляла в среднем немного более 1 кластера, включающего 5^8 клеток (см. табл. 3), на 1 мм2 площади пластиковой поверхности.
В контрольной культуре мононуклеаров, не контактирующих с дисками, был отмечен только 1 кластер, содержащий 19 округлых клеток, из которых 16 (84%) были окрашены на неспецифическую эстеразу, что может соответствовать морфофункциональному профилю моноцитов/макрофагов [1, 33].
Известно, что незначительная (до 0,5%) субпопуляция мононуклеарных клеток периферической крови, получивших название «фиброциты» [1], проявляет в культуре адгезирующую активность и фибробласто-подобную морфологию, промежуточный между гемо-поэтическими и стромальными стволовыми клетками иммунофенотип, экспрессирует антигены коллагенов
I и III типов [34, 35], способна дифференцироваться в том числе в производные мезенхимы [36].
Экспериментальные и клинические наблюдения свидетельствуют, что концентрация этих клеток может значительно повышаться при патологических реакциях и восстановлении повреждений [7, 36, 37], служить маркером стабилизации или обострения процесса [38].
Таблица 3. Клоногенная активность культуры мононуклеаров крови здорового добровольца
+
№ группы Искусственный материал (диск) Число КлОЕ-Ф в I мм2 Число клеток в КлОЕ-Ф
1 С композитным покрытием 6,83±2,90 8^3±3,62
п=9 п=^
2 С кальцийфосфатным покрытием 1,23±1,97* 7,00±1,73
п=10 п1=3
<0,0002
Средняя кластерообразующая эффективность 609 -
на 10е мононуклеаров, засеянных в лунки** 110
Примечание: * — статистически значимые различия с культурой клеток на пластике согласно и-критерию Манна — Уитни; в числителе — значение для 1 группы наблюдения; ** — площадь лунки 267,5 мм2; п — число полей зрения, п, — число исследованных КлОЕ-Ф.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
Согласно обзору Q. Не с соавт. (2007), колониеобразующая эффективность (число колоний на 10е культивируемых мононуклеарных клеток) интактных стромальных стволовых клеток в крови здоровых добровольцев очень невелика и варьирует в пределах 0^0,27 КОЕ-Ф. Ранее удалось обнаружить только
2 колонии фибробластоподобных клеток на 10 образцов крови здоровых доноров [39], что связывают с недостатком факторов роста в первичной культуре мононуклеаров крови [3].
В сравнении, количество ММСК в костномозговом трансплантате составляет в среднем 2^5 на 108 мононуклеарных клеток и может оказаться недостаточным для его успешного приживления [6]. В связи с этим, для регенеративной медицины и биоинженерии необходимы адекватные с точки зрения физиологии методы, повышающие концентрацию активных стволовых клеток человека. Представленная нами методология может оказаться полезной для повышения in vitro концентрации стромальных, в том числе стволовых, клеток человека до уровня, пригодного для клеточных технологий.
Расчеты показывают, что искусственные матрицы (площадь 1-й искусственной поверхности составляет 78,5 мм2) способны in vitro индуцировать кластерообразующую активность стромальных клеток в остеогенной среде. Даже с учетом того факта, что в лунке под диском клетки не растут, в короткие сроки эффективность выхода КлОЕ-Ф на пластике может достигать значительных величин. При этом поверхности, несущие полимерную составляющую, в сравнении с кальцифосфатным покрытием, являются более сильным индуктором для культуры мононуклеарных лейкоцитов крови (см. табл. 3).
С одной стороны, представленная методология позволяет задуматься над вопросом, действительно
ли в крови человека циркулирует незначительное число клеток из пула ММСК. Тем более, что полученные результаты во многом согласуются с данными других исследователей [23].
С другой стороны, вследствие краткосрочности культивирования (52 ч) мишенью могут быть более зрелые клетки крови. В частности, CD14+ моноциты периферической крови могут трансформироваться in vivo в фибробластоподобные клетки, названные фиброцитами, в течение нескольких дней. При этом выход таких клеток in vitro занимает до 2-х недель и зависит от многих условий культивирования [40].
В связи с этим, разработанную модель краткосрочного культивирования следует развивать как вариант «биореактора in vitro», позволяющего выделять и наращивать биомассу индуцированных фибробластоподобных клеток, пригодных для проведения научных исследований или практического применения в терапии заболеваний человека.
Выводы
1. Искусственные материалы с полимерно-каль-цийфосфатной остеогенной поверхностью индуцируют in vitro фибробластоподобную трансформацию мононуклеарных, в том числе клоногенных, клеток крови здорового человека.
2. TNF— может быть одним из факторов, способствующих фибробластоидной морфофункциональной активности мононуклеаров крови человека при их кратковременном контакте с полимерно-кальцийфос-фатным материалом.
3. Разработанные условия индукции дифферен-цировки мононуклеарных клеток могут быть использованы при создании новых клеточных технологий, препаратов для тканевой инженерии и регенеративной медицины.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Bucala R., Spiegel L.A., Chesney J. et al. Circulating fibrocytes define a new leukocyte subpopulation that mediates tissue repair. Mol. Med. 1994; 1(11: 71-81.
2. Zvaifler N.J., Marinova-Mutafchieva L., Adams G. et al. Mesenchymal precursors in the blood of normal individuals. Arthritis Res. 2000; 2: 477-88.
3. He Q., Wan C., Li G. Concise review: multipotent mesenchymal stromal cells in blood. Stem cells 2007; 25: 69—77.
4. Kassis I., Zangi L., Rivkin R. et al. Isolation of mesenchimal stem cells from G-CSF mobilized human peripheral blood using fibrin microbeads. Bone Marrow Transplant. 2006: 37: 967—76.
5. Shimizu N.. Asai T., Hashimoto S. et al. Mobilization factors of peripheral blood stem cells in healthy donors. Ther. Apher. 2002; 6Ш): 413-8.
6. Aerts F., Wagemaker G. Mesenchymal stem cell engineering and transplantation. In: J.A. Nolta, editor. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells. Springer; 2006: 1—44.
7. Moore B.B. Fibrocytes as potential biomarkers in idiopathic pulmonary fibrosis. Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2009; 179: 524-5.
8. Saprina T.V., Khlusov I.A., Karlov A.V. Change of properties of mononuclear leukocytes at patients with an osteogenesis imperfect after operative treatment with use nanosized hydroxylapatite coatings. In: Proceedings of the 11th Essen Symposium on Biomaterials and Biomechanics: fundamentals and clinical applications, Essen, Germany 2009: 156.
9. Фриденштейн А.Я., Лурия E.A. Клеточные основы кроветворного микроокружения.М.: Медицина; 1980.
10. Khlusov I.A., Karlov A.V., Sharkeev Yu.P. et al. Osteogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow in situ: role of physicochemical properties of artificial surfaces. Bull. Exp. Biol. Med.2005; 140(11: 144-52.
11. Bol’basov E.N., Karlov A.V., Guseev V.V., Khlusov I.A. Use of composition materials on the base of copolymer of tetrafluoroethylene with vinylidene fluoride for needs of traumatology and orthopaedics. In: Proceedings of the 11th Essen Symposium on Biomaterials and
Biomechanics: fundamentals and clinical applications, Essen, Germany; 2009: 118-19.
12. Sharkeev Yu.P., Legostaeva E.V., Eroshenko et al. The structure and physical and mechanical properties of a novel biocomposite material, nanostructured titanium-calcium-phosphate coating. Composite Interfaces. 2009; 16: 535—46.
13. Чайкина M.B., Хлусов И.А., Карлов А.В., Пайчадзе К.С. Механохимический синтез нестехиометрических и замещенных апатитов с наноразмерными частицами для использования в качестве биосовместимых материалов. Химия в интересах устойчивого развития 2004; 12: 389-99.
14. Дружинина T.B., Хлусов И.А., Карлов А.В. и др. Маркеры остеогенеза в периферической крови как патогенетические факторы и предикторы системных эффектов имплантатов для остеосинтеза. Гений ортопедии 2007; [41: 83—8.
15.Тиц Н. Клиническое руководство по лабораторным тестам: пер. с англ. М.: Юнимед-Пресс; 2003.
16. Меньшиков В.В., редактор. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник. М.: Медицина; 1987.
17. Е1овицкий В.В., Шахов В.П., Хлусов И.А., редакторы. Введение в методы культуры клеток, биоинженерии органов и тканей. Томск: STT; 2004.
18. Автандилов Г.Г. Диагностическая медицинская плоидометрия. М.: Медицина; 2006.
19. Ratner B.D., Floffman A.S., Schoen F.J., et al. editors. Biomaterials science: an introduction to materials in medicine. 2nd edition. San Diego: Elsevier Academic Press; 2004.
20. Карлов A.B., Хлусов И.А. Влияние продуктов деградации титановых имплантатов с модифицированной поверхностью на активность щелочной и кислой фосфатаз в культуре клеток костного мозга. Гений ортопедии. 2002;[4): 89—92.
21. Риггз Б.Л., Мелтон ШЛ. Остеопороз: пер. с англ.СПб.:ЗА0 «Издательство БИЕЮМ», «Е1евский диалект»; 2000.
22. Серов В.В., Шехтер А.Б. Соединительная ткань: функциональная морфология и общая патология. М.: Медицина; 1981.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
23. Eghbali-Fatourechi G.Z., Lamsam J., Fraser D., et al. Circulating osteoblast-lineage cells in humans. N.Engl. J. Med. 2DD5; 353: 737—8.
24. Браун А.Д., МоженокТ.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. Л.: Наука; 1987.
25. Легостаева Е.В., Хлусов И.А., Шаркеев Ю.П. и др. Эволюция структуры и свойств биокомпозита на основе наноструктурного титана и микродуговых кальций-фосфатных покрытий при взаимодействии с биосредой. Физическая мезомеханика 2006; [9): 205—8.
26. Ргогтндий О., Ная Е., Barbara A. et al. Calcium sensing receptor-dependent and receptor-independent activation of osteoblast replication and survival by strontium ranelate. J. Cell. Mol. Med. 2009;13t8B]; 2189-99.
27. Wiemann В. М., Bingmann D., Franzka S. Oriented growth of osteoblast-like cells on two-dimensionally structured films of functionalized calcium phosphatenanoparticles on a silicon substrate. Advanced engineering materials 2007; 9C12): 1077—81.
28. Blaine T.A., Rosier R.N., Puzas J. E. et al. Increased levels of tumor necrosis factor-б and lnterleukin-6 protein and messenger RNA in human peripheral blood monocytes due to titanium particles. J. Bone Joint Surg. 1996; 78; 1181—92.
29. Файерс У. Биологические методы лечения фактором некроза опухолей: преклинические исследования. В кн.: Де Вита В.Т., Хеллман С., Розенберг С.А., редакторы. Биологические методы лечения онкологических заболеваний: Пер. с англ. М.: Медицина; 2002: 309-43.
30. Li W., Yu В., Li М. et al. NEMO-binding domain peptide promotes osteoblast differentiation impaired by tumor necrosis factor alpha.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010; 391(21: 1228—33.
31. Насонов Е.Л. Противовоспалительная терапия ревматических болезней. Москва: М-Сити; 1996.
32. Zucali J.B., Broxmeyer Н.Е., Gross М. et al. Recombinant TNF alpha and beta stimulate fibroblast to produce hemopoietic growth factors in vitro. Immunol. 1988; 140: 840—4.
33. Хейхоу Ф.Г., Кваглино Д. Гематологическая цитохимия. М.: Медицина; 1983.
34. Chesney J., Bacher М., Bender A. et al. The peripheral blood fibrocyte is potent antigen-presenting cell capable of priming nanve T cell in situ. PNAS. 1997; 94: 6307-12.
35. Abe R., Donnely S.C., Peng T. et al. Peripheral blood fibrocytes: differentiation pathway and migration to wound sites. J. Immunol. 2001; 166: 7556-62.
36. Gomperts B.N., Strieter R.M. Fibrocytes in lung disease. J. Leuk. Biol. Biol. 2007; 82: 449-56.
37. Schmidt М., Sun G., Stacey M.A. et al. Identification of circulating fibrocytes as precursors of bronchial myofibroblasts in asthma. J. Immunol. 2003; 171: 380-9.
38. Moeller A., Gilpin S.E., Ask K. et al. Circulating fibrocytes are an indicator of poor prognosis in idiopathic pulmonary fibrosis. Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2009; 179: 588—94.
39. Kuznetsov S.A., Mankani M.H., Gronthos S. et al. Circulating skeletal stem cells. J. Cell. Biol.2001; 153C5]: 1133—9.
40. Pilling D., Vakil V., Gomer R.H. Improved serum-free culture conditions for the differentiation of human and murine fibrocytes. J. Immunol.Methods. 2009; 351(1-21: 62—70.
Поступила 8,11,2010
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
А
