CC BY
52
УДК 34.15.19: 34.57.21:62.33.31
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕАКЦИИ СТРОМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И МОНОНУКЛЕАРОВ КРОВИ НА КРАТКОВРЕМЕННЫЙ КОНТАКТ С ИСКУССТВЕННЫМИ МАТЕРИАЛАМИ
И.А. Хлусов, К.А. Нечаев, М.В. Дворниченко, М.Ю. Хлусова, Н.В. Рязанцева*,
О.Е. Савельева*, В.Ф. Пичугин, Ю.П. Шаркеев**, Е.В. Легостаева**, К.В. Зайцев***
Научно-образовательный центр «Биосовместимые материалы и биоинженерия»
Томского политехнического университета и Сибирского государственного медицинского университета, г.
Томск
*Научно-образовательный центр молекулярной медицины Сибирского государственного медицинского университета, г. Томск **Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, г. Томск ***Томский НИИ курортологии и физиотерапии ФМБА
России E-mail: [email protected]
Изучены секреция цитокинов, апоптоз и продукция активных форм кислорода в клеточных культурах при их контакте in vitro с имплантатами, несущими микродуговые, магнетрон-ные или абляционные кальцийфосфатные покрытия. Установлено, что клетками, способными контролировать процессы приживления/отторжения имплантатов с разной шероховатостью, являются, в первую очередь, мононуклеарные лейкоциты крови. Тесты in vitro подтвердили факт, что имплантаты с «гладкими» (Ra менее 1 мкм) кальцийфосфатными покрытиями менее пригодны для стимуляции репаративной регенерации костной ткани.
Ключевые слова:
Фибробластоподобные клетки, мононуклеарные лейкоциты крови человека, кальцийфосфатные покрытия, цитокины, апоптоз.
По мнению исследователей в области медицинского материаловедения и биоинженерии тканей, именно на границе раздела искусственного материала (имплантата) и биологических структур развиваются основные события, связанные с гистогенезом и жизнедеятельностью клеток, на основе общебиологических процессов пролиферации, комми-тирования, дифференцировки, созревания и гибели [1, 2]. В подобном случае судьба клеточной культуры связана с суммарным воздействием, опосредованным через прямое взаимодействие клеток с искусственной поверхностью и секреторную активность многоклеточной системы.
Биологическая реакция на искусственные материалы определяется рядом факторов, включая топографию поверхности, химический состав, скорость деградации, тип продукта растворения и механические свойства имплантата. Поэтому в настоящее время разрабаты-
Хлусов Игорь Альбертович,
д-р мед. наук, профессор, профессор кафедры морфологии и общей патологии Сибирского государственного медицинского университета, профессор кафедры теоретической и экспериментальной физики ТПУ.
E-mail: [email protected] Область научных интересов: клеточные технологии, биоинженерия.
Нечаев Кирилл Андреевич,
аспирант кафедры фармакологии Сибирского государственного медицинского университета.
E-mail: [email protected].
Область научных интересов: клеточные технологии. Дворниченко Марина Владимировна, канд. мед. наук, докторант кафедры патофизиологии Сибирского государственного медицинского университета, инженер кафедры теоретической и экспериментальной физики ТПУ.
E-mail: [email protected] Область научных интересов: молекулярная и клеточная биология.
Хлусова Марина Юрьевна,
канд. мед. наук, доцент кафедры патофизиологии Сибирского государственного медицинского университета. E-mail: [email protected].
Область научных интересов: патофизиология клеточного роста.
Рязанцева Наталья Владимировна, д-р мед. наук, профессор, проректор Сибирского государственного медицинского университета, зав. кафедрой фундаментальных основ клинической медицины, научный руководитель НОЦ молекулярной медицины Сибирского государственного медицинского университета.
E-mail: [email protected].
Область научных интересов: молекулярная медицина. Савельева Ольга Евгеньевна, канд. мед. наук, руководитель НОЦ молекулярной медицины Сибирского государственного медицинского университета.
E-mail: [email protected] Область научных интересов: молекулярная медицина. Пичугин Владимир Федорович, д-р. физ.-мат. наук, профессор, зав. кафедрой теоретической и экспериментальной физики ТПУ, председатель совета НОЦ «Биосовместимые материалы и биоинженерия» при ТПУ и Сибирском государственном медицинском университете.
E-mail: [email protected] Область научных интересов: физика тонких пленок, медицинское материаловедение. Шаркеев Юрий Петрович, д-р. физ.-мат. наук, профессор, заведующий лабораторией физики наноструктурных биосов-местимых композитов Института физики прочности и материаловедения СО РАН.
E-mail: [email protected] Область научных интересов: физика конденсированного состояния, медицинское материаловедение.
ваются подходы к использованию материалов с технологическими и биологическими свойствами для конкретных заболеваний и пациентов, что входит в понятие «интеллигентные имплантаты» [1] и «персонализированная терапия» [3].
В основе негативного влияния материала лежит каскад событий, характерных для воспаления. Показано, что эти события приводят к развитию гранулематозной реакции со стороны окружающих тканей и активации секреции цитокинов и протеолитических ферментов, выраженность и длительность выделения которых, согласно [4], является определяющей для развития патологического состояния.
Тем не менее, до сих пор не выработаны надежные критерии, позволяющие прогнозировать судьбу (приживление/отторжение) имплантата в организме.
В связи с этим цель исследования связана с изучением секреции цитокинов, процессов апоптоза и продукции активных форм кислорода (АФК) в клеточных культурах при их контакте in vitro с имплантатами, несущими различные кальцийфосфатные покрытия.
Для культивирования тестируемых клеток применяли подложки из наноструктурного титана ВТ1.0 (диаметр 12 мм, толщина 1 мм), несущие двусторонние каль-цийфосфатные (КФ) покрытия. Покрытия наносили на титановую подложку с помощью модификации способа микродугового оксидирования [5], магнетронного напыления [6] либо абляционной плазмы [7].
Шероховатость поверхности искусственных КФ покрытий оценивали по значениям параметров вертикальных неровностей профиля с помощью измерительной системы Talysurf 5-120 (разрешающая способность 1 нм). Определяли Ra (мкм) как средний результат шероховатости в пределах нескольких длин участков измерений согласно ГОСТ 2789-73.
В качестве тестируемых многоклеточных систем использовали культуру пренатальных фибробла-стоподобных клеток легкого, как источник стромаль-ных стволовых клеток, или мононуклеаров периферической крови человека. Культуральной посудой служили 24-луночные пластиковые планшеты Costar (площадь лунки 1,77 см2). Биологическое тестирование выполняли in vitro при 37 °С в течение 24 часов.
Характеристики популяций мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) из различных тканей очень схожи [8]. Они обнаружены в эмбриональной [9] и легочной тканях [10], в связи с чем использованная нами в экспериментах культура пренатальных фибробластоидных клеток легкого человека (ООО «Банк стволовых клеток», г. Томск) может служить источником ММСК. Препараты представляют собой популяцию клеток разной формы и размеров, что характерно для пула ММСК [9], сохраняющую при
пассажах стабильный кариотип. Клетки свободны от посторонних вирусных (ВИЧ, гепатит, герпес и др.) и бактериальных агентов (сифилис, микоплазмы, хламидии и др.). Жизнеспособность клеток, определяемая согласно ISO 10993-5 по исключению окрашивания в тесте с 0,4 % трипановым синим, составила 95 %.
Изучение активности щелочной фосфатазы (ЩФ) и ее костного изофермента в кондиционных средах культуры ММСК, имеющей фибробластоподобный фенотип, выполнялось по общепринятой биохимической технике с применением стандартного колориметрического метода [11].
Взвесь стромальных клеток использовалась в концентрации 9*104 жизнеспособных кариоцитов в 1 мл культуральной среды следующего состава: 15 % инактивированной при 56 °С эмбриональной телячьей сыворотки (НПО «Вектор»), 280 мг/л L-глутамина, DMEM среды до 100 мл. Контролем роста служила культура фибробластоподобных клеток на пластиковой поверхности.
Фракционирование периферической крови взрослого человека для выделения мононуклеарных лейкоцитов проводили центрифугированием на градиенте плотности 1,077 г/см3 Ficoll-Paque («Pharmacia» Швеция) с центробежным ускорением 500 g в течение 45 мин. Содержание мононуклеаров составило 85 % при жизнеспособности 90 % в тесте с 0,4 % трипановым синим. В каждую лунку добавляли взвесь мононукле-аров в конечной концентрации 106 клеток в 1 мл культуральной среды следующего состава: 10 % инактивированной при 56 °С эмбриональной телячьей сыворотки, 90 % среды RPMI-1640.
После культивирования жидкую часть культуры забирали, центрифугировали с центробежным ускорением 500 g в течение 15 мин. В надосадочной жидкости (супернатантах) определяли уровни фактора некроза опухоли (TNFa) и интерлейкинов (IL-2, IL-4) методом имму-ноферментного анализа (ИФА).
Концентрацию TNFa, IL-2, IL-4 в супернатантах фибробластоподобных и мононуклеар-ных клеток определяли с помощью наборов для ИФА производства «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Учет результатов проводили с использованием фотометра для микропланшетов («Multiscan EX», США). Концентрацию TNFa, IL-2 или IL-4 рассчитывали по калибровочной кривой.
Исследуемые мононуклеары крови в количестве 106 переносили в объеме 1 мл в пробирки для проточного цитофлюориметра, ресуспендировали в аннексиновом буфере, содержащем аннексин V, меченный флуоресцеинизотиоцианатом, и пропидий йодид, инкубировали 15 мин в темноте при комнатной температуре [12]. Анализ образцов клеточных суспензий проводили на проточном цитометре FACSCalibur (BD, США).
Уровень наработки АФК в клетках определяли методом проточной цитометрии с помощью дихлорфлуоресцеина диацетата (ДХФ-ДА). Анализ образцов клеток проводился на проточном цитометре FACSCalibur (BD, США) с помощью гистограмм FL-1, и соответствующих им окон статистики, содержащих показатели средней геометрической интенсивности свечения меченых клеток.
Для анализа имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (критерий Колмогорова-Смирнова). Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (U-тест). С целью выявления связи между исследуемыми показателями
Легостаева Елена Викторовна, канд. физ.-мат. наук, ст. науч. сотр. лаборатории физики наноструктурных биосовмести-мых композитов Института физики прочности и материаловедения СО РАН.
E-mail: [email protected] Область научных интересов: физика конденсированного
состояния.
Зайцев Константин Васильевич, канд. мед. наук, зав. лабораторией изучения механизмов действия физических факторов Томского НИИ курортологии и физиотерапии ФМБА России.
E-mail: [email protected]
Область научных интересов: клеточные технологии.
определяли коэффициенты ранговой корреляции Спирмена (г). Различия считались статистически значимыми при уровне значимости р < 0,05.
Постановка эксперимента позволила выяснить секреторную активность фибробласто-подобных клеток, в которой костная фракция ЩФ занимала 88 % в общем пуле секретируемого в культуре фермента. Костная ЩФ считается маркером остеобластов [13], дифференцирующихся в течение 3-4-х суток культивирования из ММСК. Другими клетками в культуре, судя по морфологии, были производные кроветворной стволовой клетки (нейтрофилы, моноциты/макрофаги). Цитохимическая окраска культуры фибробластоподобных клеток на неспецифическую эстеразу [14] подтвердила результаты морфологического исследования. Согласно изменению секреции IL-2 и IL-4 при контакте с искусственными поверхностями (табл. 1), среди фибробластоподобных стромальных клеток присутствовали также Т-лимфоциты.
Имплантаты с шероховатым (среднее Ra = 2,947 мкм, n = 3) КФ покрытием, сформированным микродуговым способом, не влияли на секрецию цитокинов в культуре фибробластоподобных клеток (табл. 1). Судьба ММСК в данном случае определяется, преимущественно, физическими свойствами искусственной поверхности, что и было отмечено ранее [2].
При контакте с «гладкими» КФ покрытиями жизнедеятельность клеточной культуры стромальных стволовых клеток может зависеть от выделения TNFa (магнетронный способ нанесения покрытия, Ra = 0,197 мкм, n = 3) или торможения секреции IL-2 и IL-4 (абляционный способ нанесения покрытия, Ra = 0,127 мкм, n = 3). При этом эффективность роста костной ткани на подобных покрытиях в тесте эктопического остеогенеза in vivo не превышала 30 % при 75.. .80 % для шероховатых микродуговых покрытий [15].
Таким образом, секреторная активность многоклеточной системы в культуре фибробла-стоподобных клеток при контакте с «гладкими» искусственными покрытиями может быть одним из молекулярных механизмов в регуляции функциональной активности клеток и судьбы имплантатов в организме.
Таблица 1. Уровни цитокинов в супернатанте при культивировании фибробластоподобных клеток человека с искусственными материалами, Х+т____________________________________
№ группы Исследуемая группа, n = 3 Уровень цитокинов, пг/мл
TNFa IL-2 IL-4
Контроль секреции
1 Культура фибробластоподобных клеток человека на пластике 46,52 ± 0,67 78,01 ± 0,44 66,33 ± 1,28
Культуры клеток на образцах наноструктурного титана с кальцийфосфатным покрытием
2 Микродуговое покрытие 51,56 ± 3,93 77,57 ± 1,07 68,77 ± 3,61
3 Абляционное покрытие 46,91 ± 2,79 72,14 ± 1,16* 49,98 ± 0,67*
4 Магнетронное покрытие 62,26 ± 3,47* 77,32 ± 1,59 65,86 ± 3,33
Примечание: здесь и в табл. 2, 3 п - число наблюдений (образцов) в каждой группе; указаны различия по и-критерию Вилкоксона: (*) - с группой 1 (р < 0,05)
С одной стороны, кооперация макрофагов и Т-хелперов через цитокиновую регуляцию функции остеокластов (TNFa и IL-2) и фибробластов (TNFa) способна запускать воспалитель-ный/остеолитический (склеротический) процесс [1]. Избыток TNFa, недостаток IL-2 и IL-4, выявленные нами для разных изделий (табл. 1), являются проапоптотическими сигналами для лейкоцитов [16], мигрирующих в очаг постимплантационного воспаления. В связи с этим, тканевая многоклеточная система при контакте с «гладкими» КФ покрытиями может вызывать апоптоз иммунокомпетентных клеток крови, опосредованный через цитокины. Внутриклеточные пути реализации подобного варианта клеточной смерти описаны в работах [17, 18]. Данные процессы могут затруднять прогноз выживаемости подобных имплантатов в конкретном организме.
Известно, что при использовании медицинских изделий развивается воспалительная реакция, активность и исход которой модулируется не только местными стромальными элемен-
тами, но и циркулирующими во фракции мононуклеаров крови иммунными клетками [1]. In vitro ответ мононуклеаров периферической крови, включая цитокиновый профиль, различается в зависимости от состава искусственных материалов [19].
В наших экспериментах образцы наноструктурного титана с КФ покрытиями дифференцированно стимулировали in vitro секреторную активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека (табл. 2). Так, отмечалось увеличение концентрации TNFa (на 93 %) и IL-4 (на 15 %) в культуре клеток при контакте с абляционным и микродуговым покрытиями соответственно.
Тестируемые материалы обладают хорошей биосовместимостью на клеточном уровне, поскольку не вызывают увеличения апоптоза мононуклеаров крови и концентраций внутриклеточных АФК (табл. 3). Тем не менее, тест на окрашивание с 0,4 % трипановым синим показал некоторый рост числа окрашенных клеток (с 9 % до 14 %) при контакте культуры клеток крови с абляционным КФ материалом. По-видимому, часть клеток в данной группе погибала путем некроза, индуцированного высокими дозами TNFa (табл. 2), что уменьшало долю апоптотиче-ски измененных мононуклеаров (табл. 3).
Таблица 2. Уровни цитокинов в супернатанте при культивировании мононуклеаров крови человека с искусственными материалами, X+m__________________________________________________
№ группы Исследуемая группа, n = 3 Уровень цитокинов, пг/мл
TNFa IL-2 IL-4
Контроль секреции
1 Культура мононуклеаров крови человека на пластике 41,74 ± 0,60 63,74 ± 0,93 63,91 ± 0,70
Культуры клеток на образцах наноструктурного титана с кальцийфосфатным покрытием
2 Микродуговое покрытие 40,98 ± 1,25 66,88 ± 1,30 73,36 ± 1,66*
3 Абляционное покрытие 79,19 ± 2,08* 61,51 ± 1,02 61,73 ± 0,80
4 Магнетронное покрытие 59,74 ± 15,53 67,27 ± 1,45 68,35 ± 3,41
Таблица 3. Количество апоптозных клеток и уровень внутриклеточных активных форм кислорода при культивировании мононуклеаров крови человека с искусственными материалами, Х+т
№ группы Исследуемая группа, п = 3 Результаты измерений
Уровень апопто- за, % Уровень активных форм кислорода, (у.е.о.п.)
1 Культура мононуклеаров крови человека на пластике 13,78± 5,31 0,550 ± 0,290
Культуры клеток на образцах наноструктурного титана с кальцийфосфатным покрытием
2 Микродуговое покрытие 11,66± 2,41 0,236 ± 0,048
3 Абляционное покрытие 7,99± 0,66* 0,190 ± 0,010*
4 Магнетронное покрытие 13,34± 0,46 0,316 ± 0,050
Использование корреляционного анализа для выявления механизмов описанных феноменов показало, что секреторная активность культуры фибробластоподобных клеток не зависела от шероховатости КФ покрытий. В то же время, выявлены тесные зависимости Иа покрытий с секрецией ТОТа мононуклеарами крови (г = -0,80; р = 0,01; п = 9), 11-2 (г = 0,69; р = 0,04; п = 9) и 1Ь-4 (г = 0,83; р = 0,006; п = 9).
Представленные данные раскрывают взаимосвязь физических свойств поверхности имплантатов и цитокиновых механизмов их различной способности к остеоинтеграции, показанной нами ранее [15]. Согласно корреляционному анализу, клетками-мишенями («стражниками»), осуществляющими регуляцию приживления/отторжения имплантатов с разной шероховатостью, являются, в первую очередь, мононуклеары крови. При средней шероховатости кальцийфос-фатных покрытий в диапазоне 0Д...3 мкм, в качестве статистически значимого критерия, позволя-
ющего в модельных экспериментах in vitro на 80 % прогнозировать поведение имплантата в организме, можно рекомендовать определение секреции TNFa мононуклеарами периферической крови. При этом «гладкие» КФ покрытия менее пригодны для репаративной регенерации костной ткани вследствие высокой вероятности секреции TNFa, по-видимому, как проявление неспецифического адаптационного синдрома клеточных систем [20].
Исследование выполнено при поддержке федеральных целевых программ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» (государственные контракты № 16.512.11.2087 и № 16.513.11.3075), «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 20092013 годы (государственный контракт П861 от 25.05.2010), Аналитической ведомственной целевой программы (АВЦП) «Развитие научного потенциала высшей школы на 2009-2011 годы» (регистрационный номер проекта 2.1.1/14204), гранта №5ФНМ-27 программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», интеграционного проекта №126 СО РАН и гранта РФФИ№09-04-00287а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Biomaterials science: an introduction to materials in medicine. 2nd edition / ed. by B.D. Ratner, A.S. Hoffman, F.J. Schoen, J.E. Lemons. - San Diego: Elsevier Academic Press, 2004. - 851 p.
2. Khlusov I.A., Zagrebin L.V., Shestov S.S., Naumov S.A. Physical-Chemical Manipulations with Microbial and Mammalian Cells: From Experiments to Clinics // Stem Cell Applications in Disease and Health / ed. by W.B. Burnsides and R.H. Ellsley. - N.Y.: Nova Science Publishers Inc, 2008. - P. 3780.
3. Vogiatzi P., Cassone M., Clfudio P.P. Personalizing gene therapy in gastric cancer // Drug News Perspect. - 2006. - V. 19. - № 9. - P. 533-540.
4. Rollins B.J. Chemokines // Blood. - 1997. - V. 90 - P. 909-928.
5. Sharkeev Yu.P., Legostaeva E.V., Eroshenko A.Yu., Khlusov I.A., Kashin O.A. The structure and physical and mechanical properties of a novel biocomposite material, nanostructured titanium-calcium-phosphate coating // Composite Interfaces. - 2009. - V. 16. - P. 535-546.
6. Pichugin V.F., Eshenko E.V., Surmenev R.A., Shesterikov E.V., Tverdokhlebov S.I., Ryabtseva M.A., Sokhoreva V.V., Khlusov I.A. Application of High-Frequency Magnetron Sputtering to Deposit Thin Calcium-Phosphate Biocompatible Coatings on a Titanium Surface // Journal of Surface Investigation. X-ray, Synchrotron and Neutron Techniques. - 2007. - V. 1. - № 6. - P. 679682.
7. Струц В.К., Петров А.В., Матвиенко В.М, Пичугин В.Ф., Твердохлебов С.И. Свойства кальций-фосфатных покрытий, осаждаемых из абляционной плазмы, создаваемой мощными ионными пучками // Взаимодействие ионов с поверхностью: Труды XIX международной конференции (ВИП-2009). - Звенигород, 21-25 августа 2009. - М.: Издательство «Галлея-принт», 2009. - Т. 2. - С. 402-405.
8. Da Silva Meirelles L., Chagastelles P.C., Nardi N.B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues // Journal of Cell Science. - 2006. - V. 119. - P. 2204-2213.
9. Aerts F., Wagemaker G. Mesenchymal stem cell engineering and transplantation // Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells / ed. by J.A. Nolta. - The Netherlands, Dordrecht: Springer, 2006. - P. 1-44.
10. Lama V.N., Smith L., Badri L., Flint A., Andrei A.-C., Murray S., Wang Zh., Liao H., Toews G.B., Krebsbach P.H., Peters-Golden M., Pinsky D.J., Martinez F.J., Thannickal V.J. Evidence for tissue-resident mesenchymal stem cells in human adult lung from studies of transplanted allografts // The Journal of Clinical Investigation. - 2007. - V. 117. - P. 989-996.
11. Тиц Н. Клиническое руководство по лабораторным тестам: пер. с англ. / под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Юнимед-Пресс, 2003. - 943 с.
12. Van Engeland M., Nieland L.J.W., Ramaekers F.C.S., et al. Annexin V-affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure // Cytometry. - 1998. - V. 31. - P. 1-9.
13. Риггз Б.Л., Мелтон III Л.Дж. Остеопороз: пер. с англ. - СПб.: ЗАО «Издательство БИНОМ», «Невский диалект», 2000. - 560 с.
14. Запускалов И.В., Кривошеина О.И., Хлусов И.А., Мартусевич Я.А., Шевцова Н.М., Зайцев К.В., Кочмала О.Б. Морфофункциональные свойства стромальных стволовых клеток при культивировании in vitro в динамических условиях // Бюллетень Сибирской медицины. -2009.- № 4. - С. 28-32.
15. Khlusov I.A., Karlov A.V., Sharkeev Yu.P., Pichugin V.F., Kolobov Yu.R., Shashkina G.A., Ivanov M.B., Legostaeva E.V., Sukhikh G.T. Osteogenic Potential of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow in Situ: Role of Physicochemical Properties of Artificial Surfaces // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2005. - V. 140. - P. 144-152.
16. Белушкина Н.Н., Хасан Х.А., Северин С.Е. Молекулярные основы апоптоза // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 1998. - № 4. - С. 15-23.
17. Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., Жукова О.Б., Биктасова А.К., Чечина О.Е., Сазонова Е.В., Радзивил Т.Т., Вайс А.Н., Часовских Н.Ю. Роль NF-kB, p53 и р21 в регуляции ФНО-опосредованного апоптоза лимфоцитов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 148. - № 2. - С. 56-60.
18. Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., Жукова О.Б., Биктасова А.К., Чечина О.Е., Сазонова Е.В., Белкина М.В., Часовских Н.Ю., Хаитова З.К. Роль активных форм кислорода и белков семейства Вс1-2 в реализации ФНО-опосредованного апоптоза лимфоцитов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 148. - № 2. - С. 139-143.
19. Blaine T.A., Rosier R.N., Puzas J. E., Looney R. J., et al. Increased levels of tumor necrosis factor-а and Interleukin-6 protein and messenger RNA in human peripheral blood monocytes due to titanium particles / // The journal of bone and Joint Surgery (American). - 1996. - V. 78. - P. 1181-1192.
20. Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. - Л.: Наука, 1987. - 232 с.
Поступила 17.11.2011 г.
