CC BY
105
ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2013
ИММУНОЛОГИЯ СПИДА
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 616.98:578.828.6]-092:612.017.1.064]-06-085.281.8.015.8
B. А. Черешнев1, К.В. Шмагель2, Л.Б. Королевская2, Е.В. Сайдакова2, Н.Г. Шмагель3,
C. В. Слободчикова2, С.я. Зверев3, А.В. Таранин4
ВЛИЯНИЕ КОИНФЕКЦИИ ВИРУСОМ ГЕПАТИТА С НА АКТИВАЦИЮ И АПОПТОЗ Т-ЛИМФОЦИТОВ у вич-инфицированных пациентов, получающих антиретровирусную терапию
1ФГБУН Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук, 620049, Екатеринбург; 2ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук, 614081, Пермь; 3Пермский краевой центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями, 614088, Пермь; 4ФгБУН Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук, 630090, Новосибирск
Исследована роль активации и апоптоза Т-лимфоцитов в развитии иммунологической неотвечаемости на антиретровирусную терапию (АРТ) у ВИЧ-инфицированных пациентов с коинфекцией вирусом гепатита С (ВгС). Все пациенты были разделены на 2 группы. 1-я группа - ВИЧ+/ВГС+ с числом CD4+ Т-клеток > 350 в 1 мкл (наличие иммунологического ответа на АРТ); 2-я группа - ВИЧ+/ВГС+ с числом CD4+ Т-клеток < 350 в 1 мкл (иммунологические неответчики). Контролем служили 2 группы ВИЧ-инфицированных больных с аналогичным количеством CD4+ Т-лимфоцитов в крови, но без ВГС-коинфекции, а также относительно здоровые добровольцы без ВИЧ и ВГС-инфекций. Установлено, что для ВГС/ВИЧ-инфекции характерны: 1) более низкое, чем при ВИЧ-моноинфекции содержание CD4+ Т-лимфоцитов; 2) высокая активация CD8+ Т-клеток; 3) усиление апоптоза CD8+ Т-лимфоцитов. Полученные данные свидетельствуют о том, что коинфицирование ВГС, по-видимому, может вносить дополнительный вклад в нарушение восстановления иммунитета при проведении АРТ у ВИЧ-инфицированных пациентов. При этом следует отметить, что повышение активации и апоптоза CD8+ Т-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов с ВГС-коинфекцией не объясняет причину развития иммунологической неотвечаемости на лечение. Механизмы, лежащие в ее основе, требуют дальнейшего исследования.
Ключевые слова: ВИЧ-инфекция, вирус гепатита С, антиретровирусная терапия, активация иммунной системы, апоптоз, отсутствие иммунологического ответа
V.A. Chereshnev1, K.V Shmagel2, L.B. Korolevskaya2, E.V Saidakova2, N.G. Shmagel3, S.V Slobodchikova2, S. Ya. Zverev3, A.V Taranin4
THE IMPACT OF CO-INFECTION WITH HEPATITIS C VIRUS ACTIVATION AND APOPTOSIS OF T LYMPHOCYTES IN HIV-INFECTED PATIENTS RECEIVING ANTIRETROVIRAL THERAPY
institute of Immunology and Physiology Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 620049, Yekaterinburg, Russian Federation; 2Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 614081, Perm, Russian Federation; 3Perm Regional center for Prevention and Management of AIDS and Infectious Diseases, 614088, Perm, Russian Federation; 4Institute of Molecular and cell Biology Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, 630090, Novosibirsk, Russian Federation
The role of activation and apoptosis of T lymphocytes in the development of immunological non-response to antiretroviral therapy (ART) in HIV+ patients co-infected with hepatitis C virus (HCV) was investigated. Patients were divided into two groups: 1) HIV+/HCV+ with CD4+ T-cell counts >350/ml (immunological response to ART), 2) HIV+/HCV+ with the number of CD4+ T cells <350/ml (immunological non-response). Control consisted of three groups: two of which were HIV-infected patients with analogues CD4+ T-lymphocyte numbers, but without HCV co-infection; and one was a group of relatively healthy volunteers without HIV and HCV infections. It was found that HIV/HCV infection is characterized by: 1) lower CD4+ T-cell numbers compared with HIV-monoinfection, 2) high activation of CD8+ T cells, and 3) increased apoptosis of CD8+ T lymphocytes. These data suggest that co-infection with HCV, apparently, can make an additional contribution to violation of immune reconstitution during antiretroviral therapy in HIV-infected patients. It should be noted that the increase in the activation and apoptosis of CD8+ T cells in HIV/HCV co-infected patients does not explain the development of immunological non-response to the treatment. The underlying mechanisms require further studies.
Keywords: HIV, hepatitis C, ART, activation of the immune system, apoptosis, immunological non-response
Применение антиретровирусной терапии (АРТ) в лечении ВИЧ-инфекции способствует увеличению продолжительности жизни пациентов [1, 2]. На фоне терапии у больных отмечается снижение вирусной нагрузки и увеличение в крови количества CD4+ T-лимфоцитов, уровень которых и является определяющим для прогрессирования заболевания [3, 4]. Вместе с тем не у всех пациентов, получающих
АРТ, наблюдается восстановление численности CD4+-T-лим-фоцитов. Таких больных выделяют в группу «иммунологических неответчиков» [5-7]. Причины невосстановления CD4+-T-клеток при подавлении репликации вируса до сих пор остаются неизвестными.
Одним из факторов, влияющих на развитие иммунологического неответа, называют наличие коинфекции вирусом
- 236 -
ИММУНОЛОГИЯ СПИДА
гепатита С (ВГС) [8, 9]. В России ВГС-коинфицирование наблюдается более чем у 60% ВИЧ-инфицированных пациентов и связано с преобладанием инъекционного пути заражения ВИЧ [10, 11]. Ранее нами было показано, что наличие сопутствующей ВГС-коинфекции повышает вероятность развития CD4-лимфопении у ВИЧ-инфицированных больных в 1,9 раза [11].
Среди различных причин снижения уровня CD4+^-лимфоцитов при ВИЧ-инфекции ведущей является хроническая активация иммунной системы [12, 13]. В крови ВИЧ-инфицированных пациентов выявлено усиление экспрессии маркеров активации и пролиферации на cD4+ и CD8+-Т-клетках [7, 14-16]. Относительно недавно было показано, что присутствие ВГС у ВИЧ-инфицированных больных может приводить к еще большему повышению уровня их экспрессии [17, 18]. Известно, что активация лимфоцитов обычно завершается их апоптозом [19-21]. В настоящее время этот механизм рассматривается как основная причина снижения числа CD4+-Т-лимфоцитов при ВИЧ-инфекции.
Цель данной работы - исследовать роль активации и апоптоза Т-лимфоцитов в развитии иммунологической не-отвечаемости на АРТ у ВИЧ-инфицированных пациентов с ВГС-коинфекцией.
Материал и методы. В исследование были включены 78 ВИЧ-инфицированных пациентов, наблюдающихся в Пермском краевом центре по борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями. Все ВИЧ-инфицированные пациенты имели до начала АРТ уровень CD4+-T-клеток в крови < 200 в 1 мкл и находились на терапии не менее двух лет. К моменту обследования репликация ВИЧ у них была полностью подавлена (< 50 копий/мл). Исходя из наличия коинфекции ВГС и иммунологического ответа на АРТ (восстановление численности CD4+ T-лимфоцитов) все пациенты были разделены на 4 группы: 1-я группа - ВИЧ+ВГС+, число CD4+ T-клеток > 350 в 1 мкл; 2-я группа - ВИЧ+ВГС-, число CD4+ T-клеток > 350 в 1 мкл; 3-я группа - ВИЧ+ВГС+, число CD4+ T-клеток < 350 в 1 мкл; 4-я группа - ВИЧ+ВГС-, число CD4+ T-клеток < 350 в 1 мкл.
В контрольной группе был 21 условно здоровый доброволец без ВИЧ и ВГС-инфекций. Проведение исследования одобрено этическим комитетом Пермского краевого центра по борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями. От всех обследуемых получено письменное информированное согласие на участие в исследовании.
Кровь забирали из локтевой вены в пробирки типа Vacutainer, содержащие ЭДТА или гепарин. Уровни вирусной нагрузки ВИЧ и ВГС определяли методом разветвленной ДНК-гибридизации наборами Versant HIV-1 RNA 3.0 assay b на анализаторе Versant 440 (Siemens) и методом ПЦР в реальном времени наборами ОТ Гепатоген С количественно на термоциклере iCycler IQ5 (BioRad) согласно прилагаемым инструкциям. Мононуклеары крови получали путем центрифугирования (400g, 40 мин) в градиенте плотности диаколла р=1,077 (Диа-М). Выделенные клетки собирали, дважды отмывали средой RPMI-1640 (Биолот), подсчитывали в камере Горяева. Идентификацию cD4+ и CD8+ T-лимфоцитов проводили на проточном цитофлюо-риметре FACSCalibur (Becton Dickinson) с использованием набора моноклональных антител Becton Dickinson
Черешнев Валерий Александрович (Chereshnev Valeriy Alexandrovich); Шмагель Константин Владимирович (Shmagel Konstantin Vladimirovich), e-mail: [email protected]; Королевская Лариса Борисовна (Korolevskaya Larisa Borisovna); сайдако-ва Евгения владимировна (Saidakova Evgeniia Vladimirovna); Шмагель надежда Геннадьевна (Shmagel Nadezhda Gennadyev-na); слободчикова светлана вадимовна (Slobodchikova Svetlana Vadimovna); Зверев сергей яковлевич (Zverev Sergey Yakovlevich); Таранин александр владимирович (Taranin Alexander Vladimirovich)
Логика гейтирования данных на проточном цитофлюориметре при исследовании спонтанного апоптоза СЭ4+-Т-лимфоцитов. а - выделение гейта лимфоцитов по светорассеянию (R1), б - выделение гейта живых клеток из "R1" (R2), в - выделение гейта CD4+ клеток из гейта живых лимфоцитов "R1 + R2" (R3), г - оценка количества живых CD4+-Т-лимфоцитов на ранней стадии апоптоза в гейте "R1 + R2 + R3": верхний левый квадрант - CD4+-Т-лимфоциты без признаков апоптоза, верхний правый квадрант - CD4+-Т-лимфоциты на ранней стадии апоптоза.
Immunocytometry System (BDIS) Simultest™. Рассчитывали относительное и абсолютное количество CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов в цельной крови.
Исследование спонтанного апоптоза лимфоцитов проводили с использованием набора Annexin V-FITC/7-AAD (IM3614, Beckman Coulter Company) согласно прилагаемой инструкции. Субпопуляционное разделение апопто-тических клеток выполняли с помощью коммерческих антител к поверхностным антигенам CD4 и CD8, конъюгированных с фикоэритрином (Beckman Coulter Company). Проточно-цитофлюориметрический анализ проводили на приборе FACSCalibur (Becton Dickinson) с использованием коммерческого пакета программ сбора и анализа данных CellQuestPro. При сборе каждого файла данных накапливали до 10 000 событий (см. рисунок). Из общего количества клеток в гейте лимфоцитов вычитали 7-AAD+- и CD4-(CD8-)-клетки. Оставшиеся события принимали за 100%. Уровень спонтанного апоптоза рассчитывали путем вычитания из полученного пула клеток AnnexinV-CD4+(CD8+) Т-лимфоцитов.
Оценку экспрессии маркеров активации лимфоцитов CD38, СD69, HLA-DR проводили методом проточной цитометрии после предварительной инкубации клеток. Цельную венозную кровь смешивали со средой RPMI-1640 (Биолот), содержащей 80 мкг/мл гентамицина (конечное разведение крови 1/10), и инкубировали при 37°С в течение 24 ч (для оценки экспрессии CD38 и СD69) и 48 ч (для оценки экспрессии HLA-DR). В исследовании использовали моноклональные АТ anti-human CD38 PE/ Cy5, anti-human HLA-DR PE/Cy5, anti-human CD3 FITC, anti-human CD4-PE, anti-human CD8-PE (BioLegend), antihuman CD69-PC5 (Beckman Coulter). Для оценки экспрессии маркеров активации лимфоциты гейтировали по параметрам прямого и бокового светорассеяния. Среди клеток лимфоцитарного гейта определяли популяции CD3+/CD4+ или CD3+/CD8+. Лимфоциты, принадлежащие какой-либо
- 237 -
ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2013
Таблица 1
Характеристика вИЧ-инфицированных пациентов, разделенных на группы на основе наличия коинфекции вирусного гепатита c и иммунологического ответа на антиретровирусную терапию
ВИЧ-инфицированные пациенты
Показатель отвечают на АРТ не отвечают на АРТ
ВГС+ (п = 21) ВГС- (п = 20) ВГС+ (п = 21) ВГС- (п = 16)
Пол:
мужской 9 (42,9%) 4 (20,0%) 16 (76,2%) 4 (25,0%)
женский 12 (57,1%) 16 (80,0%) 5 (23,8%) 12 (75,0%)
Средний возраст, годы 35,4 ± 1,6 36,2 ± 1,9 34,5 ± 0,8 35,8 ± 1,4
Уровень CD4+-T-лимфоцитов перед АРТ, кл/мм3 141,0 ± 7,7 158,2 ± 9,5 114,3 ± 9,5 115,1 ± 14,9
Вирусная нагрузка ВИЧ перед АРТ, копии/мл 83 700 (33 000-630 000) 37 650 (500-171 000) 48 000 (500-403 000) 13 7300 (37 480-623 000)
Длительность АРТ, мес Вирусная нагрузка при обследовании: 47,3 ± 3,3 48,3 ± 3,5 44,0 ± 3,2 44,0 ± 4,0
ВИЧ, копии/мл < 50* < 50 < 50 < 50
ВГС, копии/мл 49 000 (16 600-144 750) < 750* 291 700 (128 870-660 270) < 750
Примечание. Звездочка - предел чувствительности тест-систем.
из двух популяций, отображали на гистограмме, и среди клеток этой популяции оценивали долю cD38, cD69 или HLA-DR.
Статистическую обработку результатов выполняли методами параметрического анализа, в выборке определяли среднюю арифметическую (M) и ее ошибку (m). Сравнение средних величин проводили по /-критерию Стьюдента. Для
оценки влияния факторов применяли дисперсионный анализ. Вычисления осуществляли с использованием пакета компьютерных программ Statistica 6.
Результаты и обсуждение. Всего были обследованы 99 человек: 78 ВИЧ-инфицированных пациентов, разделенных на 4 группы (табл. 1), и 21 здоровый доброволец. В контрольную группу вошли 8 мужчин и 13 женщин (средний возраст 32,2±1,9 года). Статистически достоверных различий по возрасту между всеми группами не выявлено.
Количество лейкоцитов и лимфоцитов в группах ВИЧ-инфицированных было ниже по сравнению с соответствующим показателем здоровых людей (табл. 2). Наименьшее число отмечено в группе иммунологических неответчиков (ИН). Различия в содержании лейкоцитов и лимфоцитов у этих больных по сравнению с контрольной группой оказались статистически достоверными и не зависели от наличия или отсутствия ВГС-коинфекции (р>0,05). Во всех группах ВИЧ-инфицированных пациентов по сравнению со здоровыми добровольцами установлено снижение как относительного, так и абсолютного количества CD4+-T-лимфоцитов (Р<0,001). Кроме того у ИН проявлялся более глубокий дефицит CD4+ T-клеток по сравнению с группой иммунологических ответчиков (ИО); p<0,001. Относительное содержание CD8+ T-клеток у всех ВИЧ-инфицированных пациентов статистически значимо превышало соответствующий показатель здоровых людей (p<0,001). Абсолютное количество CD8+-T-лимфоцитов только у ИО было достоверно выше, чем у здоровых добровольцев. При этом обе группы ВИЧ-инфицированных пациентов (ИО и ИН) не различались между собой как по относительному, так и по абсолютному содержанию CD8+-T-клеток в крови. Вместе с тем именно на субпопуляциях Т-лимфоцитов проявилось
Таблица 2
Содержание лейкоцитов и CD4+- и С08+-Т-лимфоцитов крови ВИЧ-инфицированных пациентов, коинфицированных вирусом гепатита c, отвечающих и не отвечающих ростом числа CD4+-Т-клеток на антиретровирусную терапию
Показатель Здоровые (контроль) ВИЧ-инфицированные пациенты
отвечают на АРТ не отвечают на АРТ
ВГС+ ВГС- ВГС+ ВГС-
к 1 2 3 4
Лейкоциты ■ 106/л 7514 ± 543 6645 ± 705 6613 ± 394 5788±338 5284±441
Рк-1 > 0,05 Рк-2 > 0,05 Рк-3 = 0,01 Рк-4 < 0,01
Р1-2 > 0,05 Р2-4 < 0,05 Р1-3 > 0,05 Р3-4 > 0,05
Лимфоциты 106/л 2325 ± 173 1978± 125 2187± 174 1493 ± 165 1398±148
Рк-1 > 0,05 Рк-2 > 0,05 Рк-3 < 0,002 Рк-4 < 0,001
Р1-2 > 0,05 Р2-4 < 0,002 Р1-3 < 0,05 Р3-4 > 0,05
СЭ4+-Т-клетки, % 37,8 ± 1,5 26,6 ± 1,6 29,0 ± 1,8 17,2 ± 1,3 21,8 ± 2,5
Рк-1 < 0,001 Рк-2 < 0,001 Р < 0,001 к-3 Рк-4 < 0,001
Р1-2 > 0,05 Р2-4 < 0,05 Р1-3 < 0,001 Р3-4 > 0,05
СЭ4+-Т-клетки 106/л 893 ± 85 515 ± 57 657 ± 73 243 ± 20 263 ± 28
Рк-1 < 0,001 Рк-2 < 0,05 Р < 0,001 к-3 Рк-4 > 0,05
Р1-2 > 0,05 Р2-4 < 0,001 Р1-3 < 0,001 Р3-4 > 0,05
СЭ8+-Т-клетки, % 22,3 ± 1,3 35,5 ± 1,7 33,3 ± 2,0 40,8 ± 1,7 36,1 ± 2,6
Рк-1 < 0,001 Рк-2 < 0,001 Рк-3 < 0,001 Рк-4 < 0,001
Р1-2 > 0,05 Р2-4 > 0,05 Р1-3 < 0,05 Р3-4 > 0,05
СЭ8+-Т-клетки 106/л 518 ± 55 703 ± 59 768 ± 85 652 ± 83 509± 103
Рк-1 < 0,05 Рк-2 < °,°2 Рк-3 > 0,05 Рк-4>0,05
Р1-2 > 0,05 Р2-4 > 0,05 Р1-3 > 0,05 Р3-4 > 0,05
- 238 -
ИММУНОЛОГИЯ СПИДА
Таблица 3
Апоптоз Т-лимфоцитов крови ВИЧ-инфицированных пациентов, коинфициро-ванных вирусом гепатита c, отвечающих и не отвечающих ростом числа cD4+-T-клеток на антиретровирусную терапию
T-лимфоциты Здоровые (контроль) ВИЧ-инфицированные пациенты
отвечают на АРТ не отвечают на АРТ
ВГС+ ВГС- ВГС+ ВГС-
к 1 2 3 4
CD4+PS+, % 10,3 ± 0,9 14,7 ± 1,4 13,2 ± 1,3 16,7 ± 1,8 18,7 ± 1,7
Рк-1 < 0,02 Рк-2 > 0,05 Рк-3 < 0,01 Рк-4 < 0,001
Р1-2 > 0,05 Р2-4 < 0,02 Р1-3 > 0,05 Р3-4 > 0,05
CD4+PS+ -106/л 108 ± 16 88 ± 11 92 ± 9 45 ± 8 63 ± 8
Р , > 0,05 *К-1 ’ Рк-2 > 0,05 Рк-3 < 0,002 Рк-4 < 0,02
Р1-2 > 0,05 Р2-4 < 0,02 Р1-3 < 0,01 Р3-4 > 0,05
CD8+PS+, % 24,8 ± 2,1 28,9 ± 2,7 26,9 ± 2,7 24,9 ± 1,9 31,2 ± 2,5
Рк-1 > 0,05 Рк-2 > 0,05 Рк-3 > 0,05 Рк-4 > 0,05
Р1-2 > 0,05 Р2-4 > 0,05 Р1-3 > 0,05 Р3-4 > 0,05
CD8+PS+ 106/л 168 ± 32 251 ± 36 247 ± 38 179 ± 27 185 ± 27
Рк-1 > 0,05 Рк-2 > 0,05 Рк-3 > 0,05 Рк-4 > 0,05
Р1-2 > 0,05 Р2-4 > 0,05 Р1-3 > 0,05 Р3-4 > 0,05
Примечание. PS - фосфатидил-серин.
Таблица 4
активация Т-лимфоцитов крови вИЧ-инфицированных пациентов, коинфици-рованных вирусом гепатита c, отвечающих и не отвечающих ростом числа cD+-Т-клеток на антиретровирусную терапию
Здоровые люди (кон- ВИЧ-инфицированные пациенты
T-лимфоциты отвечают на АРТ Не отвечают на АРТ
троль) ВГС+ ВГС- ВГС+ ВГС-
к 1 2 3 4
CD4+ CD38+, % 17,9 ± 1,2 14,4 ± 0,8 15,0 ± 1,4 10,5 ± 0,7 15,3 ± 1,5
Рк-1 < 0,05 Рк-2 > 0,05 Р q < 0,001 к-3 Рк-4 > 0,05
Р1-2 > 0,05 Р2-4 > 0,05 Р1-3 < 0,002 Р3-4 < 0,01
CD4+ CD69+, % 2,3 ± 0,2 2,7 ± 0,2 2,4 ± 0,3 2,7 ± 0,3 4,0 ± 0,4
Рк-1 > 0,05 Рк-2 > 0,05 Рк-3 > 0,05 Рк-4 < 0,001
Р1-2 > 0,05 Р2-4 > 0,05 Р1-3 > 0,05 Р3-4 < 0,01
CD4+ HLA-DR+, % 2,3 ± 0,4 2,2 ± 0,3 2,2 ± 0,3 1,8 ± 0,2 2,3 ± 0,3
Рк-1 > 0,05 Рк-2 > 0,05 Рк-3 > 0,05 Рк-4 > 0,05
Р1-2 > 0,05 Р2-4 > 0,05 Р1-3 > 0,05 Р3-4 > 0,05
CD8+ CD38+, % 5,7 ± 0,6 13,7 ± 0,7 11,1 ± 1,3 18,3 ± 1,4 14,0 ± 1,3
Рк-1 < 0,001 Рк-2 < 0,001 Рк-3 < 0,001 Рк-4 < 0,001
Р1-2 > 0,05 Р2-4 > 0,05 Р1-3 < 0,01 Р3-4 < 0,05
CD8+ CD69+, % 2,6 ± 0,3 7,1 ± 0,7 4,0 ± 0,4 10,2 ± 0,8 6,7 ± 0,6
Р , < 0,001 к-1 Рк-2 < °,°2 Рк-3 < 0,001 Рк-4 < 0,001
Р1-2 < 0.001 Р2-4 < 0,001 Р1-3 < 0,01 Р3-4 < 0,01
CD8+ HLA-DR+, % 3,4 ± 0,4 5,7 ± 0,5 5,6 ± 0,4 8,7 ± 0,7 7,5 ± 0,7
Рк-1 < 0,001 Рк-2 < 0,001 Р q < 0,001 к-3 Рк-4 < 0,001
Р1-2 > 0,05 Р2-4 < 0,05 Р1-3 < 0,002 Р3-4 > 0,05
влияние ВГС-коинфекции. Результаты факторного анализа показали, что ее наличие у больных приводило к более существенному снижению относительного и абсолютного количества CD4+-T-клеток по сравнению с ВИЧ-инфицированными
пациентами без коинфекции (pF<0,05). Относительное число этих клеток при наличии ВГС-коинфекции составило 21,2±1,3%, при отсутствии - 25,4±1,4% (p<0,05); абсолютное количество (в 1 мкл крови) - 355±42 и 477±45 соответственно (p=0,05). Присутствие в организме ВГС вызывало достоверное увеличение только относительного числа CD8+-T-лимфоцитов: 38,4±1,3% против 34,4±1,4% при отсутствии ВГС (p<0,05).
Одной из причин, ведущих к снижению численности Т-клеток, может быть повышение уровня их спонтанной программированной гибели. Уровни спонтанной смерти CD4+- и CD8+-Т-лимфоцитов здоровых людей существенно отличались: темпы апоптоза CD8+-Т-клеток были в 2,5 раза выше по сравнению с аналогичным показателем CD4+-Т-лимфоцитов (табл. 3). Наименьшая (10,3±0,9%) доля умирающих CD4+ Т-клеток была отмечена у здоровых добровольцев. Показатель апоптоза этих клеток у ИО был на 30-40%, а у ИН на 60-80% выше, чем у здоровых людей. При этом абсолютное количество погибающих CD4+-Т-клеток было существенно ниже у ИН по сравнению с соответствующими показателями здоровых людей и ИО. Следует отметить, что статистически достоверных отличий уровня апоптоза cD8+-Т-клеток между всеми обследованными группами не установлено. Дисперсионный анализ, направленный на исследование роли фактора ВГС-коинфекции в апоптозе лимфоцитов, показал, что он не влияет на программную гибель CD4+-Т-клеток (p>0,05). При этом присутствие в организме ВГС повышает темпы умирания CD8+-Т-клеток по сравнению с ВИЧ-моноинфекцией: 38,4±1,3 и 34,4±1,4% соответственно (p<0,05). В то же время действие фактора иммунологической неотве-чаемости на терапию проявлялось именно на апоптозе CD4+-Т-клеток. Их доля у ИН оказалась большей по сравнению с ИО: 17,5±1,1 и 13,9±1,2% (p<0,05) соответственно. При этом уровни программной гибели CD8+-Т-клеток в группах пациентов, отвечающих и неотвечающих на терапию, были одинаковыми: 27,9±1,8% и 27,6±1,7% соответственно.
Таким образом, установлено, что у ВИЧ-инфицированных пациентов, не отвечающих на АРТ восстановлением численности CD4+ Т-лимфоцитов, наблюдается более высокий уровень спонтанной гибели cD4+ (но не CD8+)-Т-клеток по сравнению с больными, стандартно реагирующими на терапию. Оценивая роль ВГС-коинфекции, можно заключить, что снижение численности cD4+ Т-лимфоцитов у коинфицированных больных не связано с увеличением темпов гибели этой субпопуляции Т-клеток. Вместе с тем установлен факт повышения уровня апоптоза CD8+-Т-лимфоцитов у больных, одновременно инфицированных ВИЧ и ВГС по сравнению с ВИЧ-моноинфекцией.
Усиление процессов апоптоза у ВИЧ-инфицированных пациентов может быть следствием активации клеток иммунной системы. При исследовании экспрессии маркеров CD38, CD69 и HLA-DR на Т-лимфоцитах крови были получены следующие данные (табл. 4). Доля CD4+CD38+ Т-клеток у пациентов с ВГС-коинфекцией статистически достоверно была ниже по сравнению с группой здоровых лю-
- 239 -
ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2013
дей. У больных с моноинфекцией их уровень не отличался от показателя контрольной группы (p>0,05). Относительное количество cD4+cD69+ Т-лимфоцитов было достоверно увеличено по сравнению с аналогичным показателем здоровых людей только в группе ВГС-негативных ИН (p<0,001). Доля CD4+HLA-DR+-Т-клеток была одинаковой во всех группах обследованных (p>0,05). Более выраженные отклонения были зафиксированы при оценке активации CD8+-Т-клеток. Относительное количество CD8+CD38+-Т-лимфоцитов у всех ВИЧ-инфицированных пациентов было увеличено в несколько раз по сравнению со здоровыми добровольцами (p<0,001). Наиболее высокий показатель установлен у ВГС-позитивных ИН: 18,3±1,4% (p<0,001 по отношению к контрольной группе; p<0,01 по отношению к группе ИО). Уровень cD8+cD69+ Т-лимфоцитов также был достоверно повышен у всех больных по сравнению со здоровыми людьми. Следует отметить, что среди ВИЧ-инфицированных пациентов наиболее высокие значения данного показателя были установлены в группах с ВГС-коинфекцией как у ответивших на терапию (p<0,001), так и у ИН (p<0,01). Число CD8+HLA-DR+-Т-лимфоцитов также оказалось увеличено у всех больных. При этом ВГС-коинфицирование не влияло на экспрессию данного маркера активации (p>0,05), а наиболее высокие уровни содержания CD8+HLA-DR+-Т-лимфоцитов были установлены у пациентов с нарушенным восстановлением CD4+-Т-клеток (p<0,001 по отношению к контрольной группе).
Обсуждение результатов. В настоящей работе исследована роль активации и апоптоза Т-лимфоцитов в развитии иммунологической неотвечаемости на АРТ у ВИЧ-инфицированных пациентов с ВГС-коинфекцией. Установлено, что во всех группах ВИЧ-инфицированных пациентов, несмотря на полное подавление репликации вируса, наблюдается существенное уменьшение содержания cD4+ Т-лимфоцитов по сравнению со здоровыми людьми. Самый глубокий дефицит этих клеток отмечен у больных с нарушением восстановления численности CD4+-Т-клеток на фоне АРТ, что согласуется с данными, представленными другими авторами [4, 7]. Наличие ВГС-коинфекции у ВИЧ-инфицированных больных приводило к более существенному снижению численности CD4+-Т-клеток и увеличению доли CD8+-Т-лимфоцитов по сравнению с пациентами без коинфекции. В предыдущих исследованиях нами было показано, что наличие сопутствующего ВИЧ-инфекции ВГС является важным фактором, препятствующим успеху АРТ [11]. Хотя АРТ частично корректирует иммунную дисфункцию, уровни активации Т-клеток у ВИЧ-инфицированных пациентов сохраняются повышенными [16, 22-25]. В нашем исследовании существенной активации CD4+-Т-клеток у больных, получающих АРТ, не обнаружено. Вместе с тем установлено значительное увеличение уровней активации CD8+-Т-лимфоцитов у всех ВИЧ-инфицированных пациентов по сравнению со здоровыми людьми. При этом наиболее высокие значения показателей активации были в группах ВГС-коинфицированных пациентов, неотвечающих на АРТ ростом численности CD4+-Т-клеток. Ранее было показано, что иммунный неответ при АРТ ассоциирован с повышением уровней CD4+ и CD8+-Т-клеточной активации [4, 7, 24, 25], а пациенты с ВГС-коинфекцией имеют чрезвычайно высокие уровни экспрессии CD38+- на CD8+-Т-лимфоцитах по сравнению с ВИЧ-моноинфицированной группой [17, 18]. Эти и полученные нами данные свидетельствуют о том, что у ВИЧ-инфицированных пациентов с ВГС-коинфекцией сохраняется достаточно высокий уровень активации, несмотря на подавление репликации ВИЧ на фоне АРТ.
В настоящее время считается, что состояние хронической иммунной активации при ВИЧ-инфекции может приводить к истощению CD4+-Т-лимфоцитов [7, 15, 23, 24, 26]. Установлено, что у ВИЧ-инфицированных больных повышены уровни экспрессии CD38, HLA-DR, Ki-67 на CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах [4, 7, 24, 25]. Обширная иммунная активация при ВИЧ-инфекции может приводить к апоптозу Т-клеток, который рассматривается как один из механизмов истоще-
ния CD4+-Т-лимфоцитов [19-21]. Основная часть публикаций, посвященных изучению апоптоза CD4+-Т-клеток, подтверждает усиление данного процесса при ВИЧ-инфекции [19, 27] и его ослабление при назначении АРТ [19, 28]. Проведенное нами исследование уровня апоптоза показало, что наличие ВГС-коинфекции не влияет на темпы гибели CD4+ Т-клеток. Вместе с тем у пациентов, не отвечающих ростом числа CD4+-Т-клеток на АРТ, уровень программной смерти этой субпопуляции Т-лимфоцитов значительно повышен. При этом не должны дезориентировать низкие значения абсолютных показателей апоптоза CD4+-Т-лимфоцитов в этой группе ВИЧ-инфицированных (см. табл. 3), что в первую очередь обусловлено глубоким дефицитом количества CD4+ Т-клеток (см. табл. 2). В этом и состоит особенность иммунного неответа: даже при низкой численности CD4+ Т-клеток темпы их гибели существенно превышают таковые не только у здоровых людей, но и у больных с ВИЧ-инфекцией, дающих прирост Т-лимфоцитов на фоне АРТ. Нами установлено, что наличие ВГС-коинфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов приводит к увеличению уровня программной гибели CD8+-Т-клеток. Хотя повышенное количество CD8+-Т-клеток, находящихся в состоянии апоптоза у ВИЧ-инфицированных больных, принимающих АРТ, отмечалось ранее [21, 27], до сих пор нет единого взгляда на причины усиления программной гибели этих клеток (за исключением активации).
Таким образом, нами установлено, что для ВГС-коинфекции характерны: 1) более низкое, чем при ВИЧ-моноинфекции, содержание CD4+ Т-лимфоцитов; 2) высокая активация CD8+-Т-клеток; 3) усиление апоптоза CD8+ Т-лимфоцитов. Полученные данные свидетельствуют о том, что коинфицирование ВГС, по-видимому, может вносить дополнительный вклад в нарушение восстановления иммунитета при проведении АРТ у ВИЧ-инфицированных пациентов. При этом следует отметить, что повышение активации и апоптоза CD8+-Т-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов с ВГС-коинфекцией не объясняет причину развития иммунологической неотвечаемости на лечение. Механизмы, лежащие в ее основе, требуют дальнейшего исследования.
Данное исследование было поддержано Национальным институтом аллергических и инфекционных заболеваний (NIAID) Национального института здоровья США (проект номер P01AI076174, соглашение Национального научного фонда N° OISE-9531011); Российским фондом фундаментальных исследований (проект № 12-04-91441-НИЗ_а); Уральским отделением РАН (проект № 12-С-4-1033). Содержание статьи находится исключительно под ответственностью авторов и не обязательно отражает официальное мнение Национального института здоровья, NIAID, Национального научного фонда или CRDF Global.
ЛИТЕРАТУРА
1. Хоффман К., Рокштро Ю. Лечение ВИЧ-инфекции. М.: Р. Валент; 2010.
3. Батрлет Д., Галлант Д., ФамП. Клинические аспекты ВИЧ-инфекции. 2009-2010. М.: Р. Валент; 2010.
10. Жердева А.И., Кузнецова А.В., Горовенко Н.А., Дуботол-кина Е.В., Ларина Н.Н., Лойфман Е.А. и др. Клиникоэпидемиологическая характеристика ВИЧ-инфекции в Хабаровском крае: хронические вирусные гепатиты, туберкулез и другие оппортунистические заболевания. Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2008; 12: 87-94.
11. Шмагель Н.Г., Шмагель К.В., Черешнев В.А. Клинические аспекты неэффективности высокоактивной антитретрови-русной терапии. Инфекционные болезни. 2011; 9(1): 5-10.
REFERENCES
1. Khoffman K., Rokshtro Yu. HIV-infection treatment. M.: R. Valent; 2010 (in Russian).
2. PalellaF.J. Jr, Baker R.K., MoormanA.C., Chmiel J.S., WoodK.C.,
- 240 -
ИММУНОЛОГИЯ СПИДА
Brooks J.T. et al. Mortality in the highly active antiretroviral therapy era: changing causes of death and disease in the HIV outpatient study. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 2006; 43(1): 27-34.
3. BatrletD., GallantD., Fam P. clinical aspects of HIV-infection. 2009-2010. М.: R. Valent; 2010 (in Russian).
4. Robbins G.K., Spritzler J.G., ChanE.S., AsmuthD.A., GandhiR.T., Rodriguez B.A. et al. Incomplete reconstitution of T cell subsets on combination antiretroviral therapy in the AIDS Clinical Trials Group Protocol 384. Clin. Infect. Dis. 2009; 48(3): 350-61.
5. Autran B. Effects of antiretroviral therapy on immune reconstitution. Antivir. Ther. 1999; 4(Suppl. 3): 3-6.
6. Gazzola L., Tincati C., Bellistri G.M., Monforte Ad., Marchetti G. The absence of CD4+ T cell count recovery despite receipt of virologically suppressive highly active antiretroviral therapy: clinical risk, immunological gaps, and therapeutic options. Clin. Infect. Dis. 2009; 48(3): 328-37.
7. LedermanM.M., CalabreseL., FunderburgN.T., ClagettB., Medvik K., Bonilla H. et al. Immunologic failure despite suppressive antiretroviral therapy is related to activation and turnover of memory CD4 cells. J. Infect. Dis. 2011; 204(8): 1217-26.
8. Miller M.F., Haley C., Koziel M.J., Rowley C.F. Impact of hepatitis C virus on immune restoration in HIV-infected patients who start highly active antiretroviral therapy: a meta-analysis. Clin. Infect. Dis. 2005; 41(5): 713-20.
9. Potter M., Odueyungbo A., Yang H., Saeed S., Klein M.B., Canadian Co-infection Cohort Study Investigators. Impact of hepatitis C viral replication on CD4 T-lymphocyte progression in HIV-HCV coinfection before and after antiretroviral therapy. AIDS. 2010; 24(12): 1857-65.
10. Zherdeva A.I., Kuznetsova A.V., Gorovenko N.A., Dubotolkina E.V., LarinaN.N., LoifmanE.A. et al. Clinical and epidemiological characteristics of HIV infection in the Khabarovsk Region: chronic viral hepatitis, tuberculosis, and other opportunistic infections. Dal’nevostochniy Zhurnal Infeksionnoy Patologii. 2008; 12: 87-94 (in Russian).
11. ShmagelN.G., ShmagelK.V., Chereshnev V.A. Clinical aspects of inefficiency of highly active antiretrovirus therapy. Infektsionnye bolezni. 2011; 9(1): 5-10 (in Russian).
12. Hazenberg M.D., Hamann D., Schuitemaker H., Miedema F. T cell depletion in HIV-1 infection: how CD4 T cells go out of stock . Nature Immunol. 2000; 1(4): 285-9.
13. McCune J.M. The dynamics of CD4 T-cell depletion in HIV disease. Nature. 2001; 410(6831): 974-9.
14. IsakovI.V., KurtasovaL.M. Evaluation of the expression of early activation marker CD69 by CD8+ lymphocytes in HIV-infected patients. Bull. Exp. Biol. Med. 2007; 144(6): 810-2.
15. Nakanjako D., Ssewanyana I., Mayanja-Kizza H., Kiragga A., Colebunders R., Manabe Y.C. et al. High T-cell immune activation and immune exhaustion among individuals with suboptimal CD4 recovery after 4 years of antiretroviral therapy in an African cohort. BMC Infect. Dis. 2011; 11: 43-52.
16. Hazenberg M.D., Stuart J.W., Otto S.A., Borleffs J.C.C., Boucher C.A.B., de Boer R.J. et al. T-cell division in human immunodefi-
ciency virus (HIV)-1 infection is mainly due to immune activation: a longitudinal analysis in patients before and during highly active antiretroviral therapy (HAART). Blood. 2000; 95(1): 249-55.
17. Gonzalez V.D., Falconer K., Blom K.G., Reichard O., Morn B., Laursen A.L. et al. High levels of chronic immune activation in the T-cell compartments of patients coinfected with hepatitis C virus and human immunodeficiency virus type 1 and on highly active antiretroviral therapy are reverted by alpha interferon and ribavirin treatment. J. Virol. 2009; 83(21): 11407-11.
18. Kovacs A., Al-Harthi L., Christensen S., Mack W., Cohen M., Landay A. CD8 T cell activation in women coinfected with human immunodeficiency virus type 1 and hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 2008; 197(10): 1402-7.
19. Badley A.D., Parato K., Cameron D.W., Kravcik S., Phenix B.N., Ashby D. et al. Dynamic correlation of apoptosis and immune activation during treatment of HIV infection. Cell Death Differ. 1999; 6(5): 420-32.
20. FevrierM., Dorgham K., Rebollo A. CD4+ T cell depletion in human immunodeficiency virus (HIV) infection: role of apoptosis. Viruses. 2011; 3(5): 586-612.
21. Lewis D.E., Gross K.L., Diez M.M., Martinez M.L., Lukefahr H.N., Kozinetz C.A. et al. CD8 apoptosis may be a predictor of T cell number normalization after immune reconstitution in HIV. J. Transl. Med. 2007; 5: 9-20.
22. Cohen Stuart J.W.T., Hazebergh M.D., Hamann D., Otto S.A., Borleffs J.C.C., Miedema F. et al. The dominant source of CD4+ and CD8+ T-cell activation in HIV infection is antigenic stimulation. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 2000; 25(3): 203-11.
23. Deeks S.G., Kitchen C.M., Liu L., Guo H., Gascon R., Narvaez A.B. et al. Immune activation set point during early HIV infection predicts subsequent CD4+ T-cell changes independent of viral load. Blood. 2004; 104(4): 942-7.
24. Hunt P.W., Martin J.N., Sinclair E., Bredt B., Hagos E., Lampiris H. et al. T cell activation is associated with lower CD4+ T cell gains in human immunodeficiency virus-infected patients with sustained viral suppression during antiretroviral therapy. J. Infect. Dis. 2003; 187(10): 1534-43.
25. Marchetti G., Gori A., Casabianca A., Magnani M., Franzetti F., ClericiM. et al. Comparative analysis of T-cell turnover and homeostatic parameters in HIV-infected patients with discordant immune-virological responses to HAART. AIDS. 2006; 20(13): 1727-36.
26. Boasso A., Shearer G.M. Chronic innate immune activation as a cause of HIV-1 immunopathogenesis. Clin. Immunol. 2008; 126(3): 235-42.
27. Niehues T., McCloskey T.W., Ndagijimana J., Horneff G., Wahn V., Pahwa S. Apoptosis in T-lymphocyte subsets in human immunodeficiency virus-infected children measured immediately ex vivo and following in vitro activation. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2001; 8(1): 74-8.
28. Szondy Z., Toth R., Szegezdi E., Ancian P., Fesus L. Cell death in HIV pathogenesis and its modulation by retinoids. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2001; 946: 95-107.
Поступила 22.08.13
- 241 -
