CC BY
80
Оригинальные исследования
УДК : [616.98:578.828.6HTV]+616.36-002.2)-074
ЭКСПРЕССИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ И ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ В ТКАНИ ПЕЧЕНИ У ВИЧ/ВГС КО-ИНФИЦИРОВАННЫХ пациентов
Матиевская Н.В.1, Цыркунов В.М.1, Зубрицкий М.Г.2, Прокопчик Н.И.2 1- УО «Гродненский государственный медицинский университет», Беларусь, Гродно 2- УЗ «Гродненское областное патологоанатомическое бюро», Беларусь, Гродно
Методом иммуногистохимии в ткани печени 15 пациентов с ВИЧ-инфекцией и 18 пациентов с ко-инфекцией ВИЧ/ВГС установлена частота и степень экспрессии иммунологических маркеров (CD4, CD8, CD56, CD68, HLA-DP, DQ, DR, CCR5, CXCR4), маркеров ВИЧ, ВГС и оппортунистических инфекций (p24 ВИЧ, NS4 HCV антигенов ВПГ1 и 2 типов, ВПЧ) при разных вариантах поражения печени. Показано, что быстропрогрессирующий вариант поражения печени при ко-инфекции ВИЧ/ВГС характеризуется более высоким содержанием естественных киллеров, активацией клеток воспалительного инфильтрата печени, экспрессией маркеров ВПГ1 и 2 типов в клетках печени по сравнению с медленно прогрессирующим вариантом.
Ключевые слова: ко-инфекция ВИЧ/ВГС, печень, иммуногистохимия, гепатоциты, клетки Купфера, воспалительный инфильтрат, TNF-б, CD56, CCR5, CXCR4, p24 ВИЧ, NS4 HCV, ВПГ1 и 2 типов.
Введение
В настоящее время накоплено много доказательств неблагоприятного естественного течения ко-инфекции ВИЧ/ВГС у большинства пациентов, сокращения сроков формирования патологии печени, высокой частоты развития цирроза печени (ЦП) и «печеночных» причин смерти. В то же время у 1/3 пациентов с ко-инфекцией ВИЧ/ВГС отсутствуют патоморфологические признаки выраженного поражения печени даже при развитии
СПИД [1, 2].
К настоящему времени доказана восприимчивость к ВИЧ практически всех клеток печени: гепатоцитов (ГЦ), клеток Купфера (КК), эндотелиальных клеток печени (ЭКП), звездчатых клеток печени (клетки Ито), лимфоцитов печени (ЛП). ГЦ являются одним из резервуаров ВИЧ-инфекции в печени, что приводит к инфицированию Т-лимфоцитов, а также других клеток печени посредством межклеточных контактов [3].
Большое значение в патогенезе поражения печени при ВИЧ-инфекции придается хемокиновым рецепторам (ХР) CCR5 и CXCR4, экспрессированным на поверхности ГЦ и других клеток печени, являющихся основными ко-рецепторами ВИЧ для входа в клетки, активация которых оказывает модулирующее влияние на иммунный ответ в печени [4].
Инфекция гепатотропными вирусами приводит к формированию воспалительного инфильтрата в печени (ВИП), приводя к изменению соотношения субпопуляций Т-лимфоцитов и других клеток ВИП [5].
ЛП, несущие на себе рецептор ЕК - молекулу адгезии CD56+, представляют одну из основных популяций ЛП, составляющую 20% в здоровой печени, в то время как содержание ЕК в крови менее 10%. Основная функция этих клеток - ответ на вирусные инфекции и опухолевую трансформацию клеток. Считается, что в ВИП при вирусных гепатитах содержание ЕК может достигать 90%
[5].
СD68 - маркер макрофагов и моноцитов, экспрессирован на КК. Обнаружение маркера СD68 в клетках ВИП свидетельствует о миграции данных клеток из крови в ткань печени в ответ на патогенные стимулы [5, 6].
Маркер СD20 позволяет дифференцировать В-лим-фоциты в ткани печени, которые играют важную роль в адаптивном гуморальном иммунитете против вирусных гепатитов и ВИЧ. Известно, что у здоровых индивидуумов относительное содержание В-лимфоцитов в печени
приблизительно такое же или несколько меньше, чем в крови [5].
Экспрессия маркера HLA-DP, DQ, DR конститутивно присутствует на антиген презентирующих клетках (АПК) и активированных клетках, таких как гранулоциты, активированные тканевые фибробласты, эндотелиоциты, цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ), что свидетельствует об активации клеток и участии их в иммунном ответе [7].
TNF- а индуктор локального воспаления, активирует макрофаги и продукцию оксида азота. Избыточный синтез TNF-а активированными клетками печени вызывает повреждение гепатоцитов с образованием некрозов, индуцирует активацию ЗКП и фиброзооброзование в печени [4, 6].
Экспрессия в клетках печени маркеров ВИЧ (p24) и ВГС (протеин NS4) характеризует наличие продуктивной инфекции [8, 9].
Цель исследования: установить частоту и степень экспрессии иммунологических маркеров (CD4, CD8, CD56, CD68, HLA-DP, DQ, DR CCR5, CXCR4), маркеров ВИЧ (p24), ВГС (NS4 HCV) и оппортунистических инфекций (герпетических вирусов, вируса папилломы человека - ВПЧ) в ткани печени при разных вариантах поражения печени у пациентов с ко-инфекцией ВИЧ/ВГС.
Материалы и методы. Иммуногистохимические (ИГХ) исследования выполнены в 2 группах ВИЧ-инфицированных пациентов: 1 группа - 18 пациентов с коинфекцией ВИЧ/ВГС, 2 группа (контрольная) - 15 пациентов с ВИЧ-инфекцией без ВГС. В 31 случае использован аутопсийный материал, в 2-х - прижизненные био-птаты печени. Клиническая характеристика пациентов представлена в таблице 1.
Таблица 1 - Характеристика пациентов, включенных в исследование
Пациенты, патология печени 1-я группа, n=18 (%) 2-я группа, n=15
Возраст (годы): средний (годы), 36,1±5,1 39,7±10,1
Мужчины 7 (38,9) 8 (53,3)
Женщины 11 (61,1) 7 (46,7)
Стадия СПИД 15 (83,3) 14 (93,3)
Применение АРТ 12 (66,7) 1 (6,7)
Цирроз печени 6 (33,3) 1 (6,7)
Г епатит низкой активности 12 (66,7) * 2(13,3)*
Г епатит умеренной активности 1 (6,7)
Туберкулез печени 3 (20,0)
Стеатоз печени 4 (26,7)
ГЦК 1 (6,7)
Отсутствие поражения печени 3 (20,0%)
Примечание: * p<0,05, тест ч2, ГЦК - гепатоцеллюлярная карцинома печени, АРТ — антиретровирусная терапия
50 Журнал Гродненского государственного медицинского университета № 4 2013 г.
Оригинальные исследования
Как видно из представленной таблицы 1, большинство пациентов в группах были на стадии СПИД.
Медленно прогрессирующий вариант поражения печени характеризовался наличием гепатита низкой активности (ГНА) с отсутствием или наличием фиброза портальных трактов. ГНА был установлен у 66,7% пациентов в 1 группе, несмотря на наличие стадии СПИД у 11 из них. У остальных 33,3% пациентов 1 группы имел место быстропрогрессирующий вариант поражения печени с наличием морфологически установленного ЦП, ставшего ведущей причиной смерти в 2 случаях. Во 2 группе ГНА встречался значительно реже (p<0,05), в 3 случаях имел место туберкулез печени, кроме того, был выявлен изолированный диффузный стеатоз и ГЦК.
Для проведения ИГХ исследования использовались фиксированные в формалине и заключенные в парафин кусочки печени. Из парафиновых блоков готовились срезы толщиной 5 микрон и переносились на предметные стекла. Срезы высушивали при комнатной температуре, далее их помещали в термостат на 30 мин. при температуре 60°С. На 1 этапе осуществляли депарафинирование гистологических срезов в ксилоле (в батарее из 4 емкостей по 1 мин. в каждой) и дегидратацию в спиртах (в батарее из 4 емкостей в спиртах восходящей крепости по 1 мин. в каждой). Предметные стекла со срезами переносились в цитратный буфер рН 6.0, и помещались на водяную баню при температуре 98°С на 30 мин. На 2 этапе проводилась стандартная предобработка срезов с целью демаскировки антигенов, направленная на восстановление структуры белка, которая изменилась в ходе фиксации и заливки в парафин. Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы обрабатывались 3% перекисью водорода в течение 10 мин. На 3 этапе наносились первичные антитела. Использовались моноклональные мышиные антитела (anti-EBV, anti-HIV p24, anti- HPV antihuman CD4, anti-human CD8, anti-human CD20, anti-human CD56, anti-human HLA-DP, DQ, DR аи^еи, anti-human CD68) и поликлональные кроличьи антитела (Anti-Herpes Simplex Virus 1 и 2 типов), в стандартном разведении (DakoCytomation). Для определения NS4 HCV в цитоплазме клеток использованы мышиные антитела antihepatitis C (AbDserotec), для определения экспрессии ХР CCR5 и CXCR4 на клетках печени использовались козьи anti-human CD195 и anti-human CD184, соответственно (AbDserotec), для определения TNF-б в клетках печени использованы моноклональные мышиные anti-human TNF-б (AbDserotec). Оценка экспрессии маркеров производилось в 4 типах клеток печени: ГЦ, КК, ЭКП и клетках ВИП. В гепатоцитах, КК и ЭКП определялись маркеры ВИЧ, ВГС, оппортунистических инфекций, а также экспрессия ХР CCR5 и CXCR4, HLA-DP, DQ, DR, TNF-б. В вИп определялась экспрессия CD4, CD8, CD20, CD56, CD68, ХР CCR5 и CXCR4, HLA-DP, DQ, DR, TNF-б.
Срезы инкубировались в течение 30 минут при температуре 37°С. В качестве визуализирующей системы использовали комплекс вторичных антител EnVision фирмы «DAKO» с диаминбензидином. Срезы промывались проточной водой, докрашивались гематоксилином и заключались в полистерол. Во всех случаях использован положительный и отрицательный контроль ИГХ реакции. Оценка результатов ИГХ проводилась на световом микроскопе (увеличение 100, 200, 400) в 6 случайных полях зрения. Оценивались локализация окрашивания в клетках, процент и интенсивность положительно окрашенных клеток. Исходя из этого, определялась степень экспрессии маркера, выраженная в баллах. Критерии балльной оценки: 0 баллов - негативное окрашивание, 1 балл -
слабая интенсивность, 2 балла - умеренная, 3 балла -резко выраженная интенсивность. При оценке экспрессии иммунологических маркеров в клетках ВИП подсчитывался процент клеток в инфильтрате, экспрессирующих конкретный маркер. Данные представлены в виде медианы (Q25 - Q75). Статистическая обработка данных проводилась с использованием критериев Mann-Whitney U Test и критерия ч2, корреляционного анализа (Spearman), с помощью статистического пакета и прикладных программ «Статистика», v.6.
Результаты
Маркеры оппортунистических инфекций (ОИ), p24 ВИЧ и NS4 HCV в гепатоцитах (ГЦ) представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Частота и степень экспрессии p24 ВИЧ, NS4 HCV и маркеров ОИ в ГЦ у ВИЧ-инфицированных пациентов
Маркеры 1-я группа, n=18 2-я группа, n=15
Степень экспрессии Степень экспрессии
1балл абс/% >1балла абс/% Медиана, ИКР 1балл абс/% >1 балла абс/% Медиана, ИКР
П24ВИЧ 12/66,7 3/16,7 1,0 (0,0-1,0) 8/53,3 1/6,7 1,0 (0,0-1,0)
NS4HCV 6/33,3 3/16,7 0,5(0,0-1,0) 0 0 0
ВПГ1 6/33,3 5/27,8 1,0 (0,0 - 2,0) 4/26,7 5/33,3 1,0 (0,0-2,0)
ВПГ2 4/22,2 5/27,8 0,5 (0,0 - 2,0) 4/26,7 3/20 0,0 (0,0-1,0)
ВПЧ 8/44,4 2/11,1 1,0 (0,0 - 1,0) 5/33,3 0 0,0 (0,0-1,0)
ВЭБ 7/38,9 1/5,6 0,0 (0,0 -1,0) 5/33,3 3/20 1,0 (0,0-1,0)
Примечание:ВПГ1 — вирус простого герпеса 1 типа; ВПГ2
- вирус простого герпеса 2 типа; ВПЧ — вирус папилломы человека; ВЭБ — вирус Эпштейна-Барр; р24 — нуклеокапсид-ный протеин ВИЧ; NS4 HCV — протеин ВГС.
Как видно из таблицы 2, в 1-й и 2-й группах отсутствовали различия в частоте и степени экспрессии маркеров ОИ и p24 ВИЧ.
При проведении корреляционного анализа с включением пациентов обеих групп установлен ряд достоверных связей. Отмечена позитивная корреляция между экспрессией p24 ВИЧ в ГЦ и ко-инфекцией ВГС - R=0,51 (p=0,002). Экспрессия p24 ВИЧ в ГЦ позитивно коррелировала с экспрессией p24 ВИЧ в КК: R=0,36 (p=0,04), с экспрессией NS4 HCV в ГЦ - R=0,37 (p=0,03), экспрессией ВПЧ в ГЦ - R=0,42 (p=0,02). Экспрессия ВПГ 1 типа в ГЦ позитивно коррелировала с экспрессией ВПГ 1 в КК
- R=0,72 (p<0,0001) и в ЭКП - R=0,72 (p<0,0001). Выявлены корреляции между экспрессией ВПГ 1 и 2 типов в ГЦ
- R=0,63 (p<0,0001) и ВПГ 1 типа с ВПЧ в ГЦ: R=0,54 (p<0,002). Установлена прямая корреляция экспрессии ВПГ 2 в Гц с возрастом пациентов - R=0,35 (p=0,04). Обнаружена корреляция ВЭБ в ГЦ с наличием СПИД - R=0,3 5 (p=0,04), степенью воспалительной инфильтрации в портальных трактах - R=0,38 (p=0,04).
Одновременная экспрессия 4 маркеров: p24 ВИЧ, ВПГ1, ВПГ2 и ВПЧ встречалась у 7 (21,1%) пациентов 1 группы и 2 (6,1%) - 2 группы (p>0,05).
Таблица 3 - Частота и степень экспрессии p24 ВИЧ, NS4 HCV и маркеров ОИ в КК ВИЧ-инфицированных пациентов
Маркеры 1-я группа, n=18 2-я группа, n=15
1 балл абс/% >1 балла абс/% Медиана, ИКР 1 балл абс/% >1 балла абс/% Медиана, ИКР
П24ВИЧ 5/27,7 3/16,7 0,0 (0,0-1,0) 0 0 0
NS4 HCV 1/5,6 0 0,0(0,0-0,0) 0 0 0
ВПГ1 6/33,3 0 0,0 (0,0 - 1,0) 3/20,0 0 0,0 (0,0-1,0)
ВПГ2 3/16,7 0 0,0 (0,0 - 0,0) 0 0 0
ВПЧ 2/11,1 0 0,0 (0,0 - 0,0) 0 0 0
ВЭБ 0 0 0 0 0 0
Примечание: * -p<0,05, Mann-WhitneyUTest
Журнал Гродненского государственного медицинского университета № 4 2013 г. 51
Оригинальные исследования
Частота и степень экспрессии маркеров p24 ВИЧ, ОИ и NS4 HCV в КК представлены в таблице 3.
Как видно из таблицы 3, достоверные различия в группах установлены по экспрессии p24 ВИЧ, который был наиболее частым маркером, определяемым в КК пациентов в 1 группе, и отсутствовал в этих же клетках у пациентов 2 группы.
Для изучения особенностей внутрипеченочного иммунного ответа у пациентов с ко-инфецией ВИЧ/ВГС были сравнены показатели экспрессии иммунологических маркеров на клетках ВИП (таблица 4).
Таблица 4 - Экспрессия иммунологических маркеров на клетках ВИП
Маркер 1-я группа, n=18 2-я группа, n=15
10-20% абс/% >20% абс/% Медиана, ИКР 10-20% абс/% >20% абс/% Медиана, ИКР
CD4 (%) 11/61,1 7/38,9 20,0 (20,0 - 30,0) 12/80,0 3/20 20,0(20,0-20,0)
CD8 (%) 13/72,2 5/27,8 20,0 (20,0 - 30,0) 15/100,0 0 20,0 (10,0-20,0)
CD20 (%) 7/38,9 11/61,1 25,0 (20,0 - 30,0) 6/40,0 9/60 .0 30,0 (20,0-30,0)
CD56 (%) 7/38,9 11/61,1 30,0 (20,0 - 30,0) 8/53,3 7/46,7 20,0 (20,0-40,0)
CD68 (%) 9/50 9/50 20,0 (10,0 -30,0) 9/60,0 6/40,0 20,0 (20,0-30,0)
HLA-DP, DQ, DR (%) 10/55,6 8/44,4 20,0 (10,0 -40,0) 5/33,3 10/66,7 40,0 (20,0-50,0)
CXCR4 15/83,3 3/18,8 10,0 (10,0 - 20,0)' 6/40,0 9/60,0 30,0 (10,0-30,0)
CCR5 15/83,3 3/18,8 20,0 (10,0 -20,0) 11/73,3 4/26,7 10,0 (10,0-30,0)
Как видно из таблицы 5, экспрессия ХР CCR5 и CXCR4 была слабо выражена на ГЦ в обеих группах. Как в 1-й группе (р=0,01), так и во 2-й (р=0,001), отмечено достоверное различие в экспрессии CXCR4 на ГЦ и КК. Кроме того, во 2-й группе установлено достоверное различие в экспрессии TNF-б в ГЦ и КК (p<0,01). Обнаружено достоверное различие (p<0,01) в экспрессии маркера активации HLA-DP, DQ, DR на КК в группах пациентах, поскольку во 2-й группе этот маркер отсутствовал, а в 1-й группе выявлялся у 6 пациентов (33,3%). Наличие активированных КК в синусоидах печени коррелировало с экспрессией TNF-б в КК (R=0,37, p<0,03) и экспрессией HLA-DP, DQ, DR на клетках ВИП (R=0,40, p<0,02).
Не вызывает сомнения роль продуктивной ВИЧ-инфекции в патогенезе поражения печени [4, 6]. В связи с этим изучены показатели экспрессии маркеров в ГЦ и КК у пациентов 1 группы с учетом одновременной экспрессии p24 ВИЧ в ГЦ и КК (таблица 6).
Таблица 6 - Экспрессия NS4 HCV, ВПГ1, HLA-DP, DQ, DR и TNF-б в ГЦ в зависимости от экспрессии p24 ВИЧ в ГЦ и КК при ко-инфекции ВИЧ/ВГС
Примечание: * p<0,05, Mann-Whitney U Test
Как видно из таблицы 4, при ко-инфекции ВИЧ/ВГС в составе ВИП отмечено больше клеток с фенотипом CD8+, что ассоциируется с более высоким содержанием ЦТЛ в ВИП и может свидетельствовать как о более активном клеточном иммунном ответе, так и о более выраженных воспалительных реакциях в печени. Медиана соотношения экспрессии CCR5 к CXCR4 на клетках ВИП в 1-й группе составила 1,0 (1,0 - 2,0) и была статистически выше во сравнению с медианой соотношения этих же показателей во 2-й группе - 1,0 (0,5 -1,0), р=0,02. Установлено, что экспрессия TNF-б в клетках ВИП не различалась достоверно в группах сравнения (p>0,05).
Выявлена прямая корреляционная связь между коинфекцией ВГС и экспрессией CD8 (R=0,39, p<0,02) на клетках ВИП при включении в анализ всех пациентов. Это подтверждают данные, представленные в таблице 4, указывая на более высокое содержание ЦТЛ в ВИП при коинфекции ВИЧ/ВГС по сравнению с пациентами без коинфекции ВГС. Обнаружена обратная корреляция между экспрессией CD68 на клетках ВИП (R=-0,43, p=0,01) и развитием СПИД, что указывает на снижение содержания макрофагов в ВИП при развитии СПИД.
Известно, что в условиях вирусной инфекции ГЦ приобретает свойства АПК и экспрессирует ряд маркеров, присущих данным клеткам [3, 4]. В связи с этим была определена экспрессия HLA-DP, DQ, DR, ХР CCR5 и CXCR4 на ГЦ и КК. Кроме того, была изучена экспрессия TNF-б - цитокина, участвующего в активации клеток печени (таблица 5).
Таблица 5 - Экспрессия HLA-DP, DQ, DR, CCR5, CXCR4 и TNF-б в ГЦ и КК
Маркер 1-я группа, n=18 2-я группа, n=15
10-20% абс/% >20% абс/% Медиана, ИКР 10-20% абс/% >20% абс/% Медиана, ИКР
CD4 (%) 11/61,1 7/38,9 20,0 (20,0 - 30,0) 12/80,0 3/20 20,0(20,0-20,0)
CD8 (%) 13/72,2 5/27,8 20,0 (20,0 - 30,0)' 15/100,0 0 20,0 (10,0-20,0)
CD20 (%) 7/38,9 11/61,1 25,0 (20,0 - 30,0) 6/40,0 9/60 .0 30,0 (20,0-30,0)
CD56 (%) 7/38,9 11/61,1 30,0 (20,0 - 30,0) 8/53,3 7/46,7 20,0 (20,0-40,0)
CD68 (%) 9/50 9/50 20,0 (10,0 -30,0) 9/60,0 6/40,0 20,0 (20,0-30,0)
HLA-DP, DQ, DR (%) 10/55,6 8/44,4 20,0 (10,0 -40,0) 5/33,3 10/66,7 40,0 (20,0-50,0)
CXCR4 15/83,3 3/18,8 10,0 (10,0 - 20,0) 6/40,0 9/60,0 30,0 (10,0-30,0)
CCR5 15/83,3 3/18,8 20,0 (10,0 -20,0) 11/73,3 4/26,7 10,0 (10,0-30,0)
Примечание: *p<0,05, Mann-Whitney U Test, ГЦ — гепатоци-ты, КК — клетки Купфера
Маркер ВИЧ/ВГС, n=8 ВИЧ/ВГС, n=10
Наличие экспрессии p24 ВИЧ Отсутствие экспрессии p24 ВИЧ
1 балл абс/% >1 балла абс/% Медиана, ИКР 1 балл абс/% >1 балла абс/% Медиана, ИКР
NS4 HCV в ГЦ 4/50,0 3/37,5 1,0 (1,0 -2,0) 2/20 0 (0,0 - 0,0)
ВПГ1 в ГЦ 5/62,0 2/25 1,0 (1,0 - 1,0) 3/30 1/10 0 (0,0 - 0,1)
HLA-DP, DQ, DR+ в КК 3/37,5 2/25 0,5 (0,0 -1,0) 1/10 0 (0,0 -0,0)
TNF-a в КК 6/75,0 0 1 (0,5 -1,0) 1/10 0 (0,0 -0,0)
Примечание: *p<0,05, Mann-Whitney UTest
Как видно из таблицы 6, получены достоверные различия в экспрессии NS4 HCV в ГЦ в сравниваемых группах, что указывает на синергизм ВИЧ и ВГС при инфицировании ГЦ и КК. Отмечена более выраженная экспрессия маркера активации на КК и TNF-б в КК при продуктивной ВИЧ-инфекции клеток печени.
Отмечены корреляции между экспрессией ВПГ 1 типа и экспрессией на клетках ВИП маркера HLA-DP, DQ, DR - R=0,53 (p=0,001). Установлена корреляция между экспрессией p24 ВИЧ в ГЦ с экспрессией CCR5 на КК: R=0,36 (p=0,04). Экспрессия p24 ВИЧ в ГЦ имела прямые корреляционные связи с экспрессией на клетках ВИП маркера макрофагов CD68 - R=0,40 (p<0,02), CXCR4 - R=0,50 (p<0,01) и CCR5 - R=0,55 (p<0,001).
Экспрессия NS4 HCV в ГЦ была выявлена у 50% пациентов 1 группы, отмечены достоверные различия в экспрессии p24ВИЧ и маркера активации в КК в зависимости от данного показателя (таблица 7).
Таблица 7 - Экспрессия p24 ВИЧ, HLA-DP в клетках Купфе-ра в зависимости от экспрессии NS4 HCV в гепатоцитах при ко-инфекции ВИЧ/ВГС
Маркер ВИЧ/ВГС, n=9 ВИЧ/ВГС, n=9
Наличие экспрессии NS4 HCV Отсутствие экспрессии NS4 HCV
1 балл абс/% >1 балла абс/% Медиана, ИКР 1 балл абс/% >1 балла абс/% Медиана, ИКР
p24 ВИЧ в КК 4/44,4 3/33,3 1 (1 - 2)* 1/5,6 0 0 (0 - 0)
HLA-DP, DQ, DR в КК 4/44,4 2/11,1 1 (0 -1) 0 0 (0 - 0)
Примечание: *p<0,05, Mann-Whitney UTest
Как видно из таблицы 7, экспрессия NS4 HCV в ГЦ ассоциировалась со значительно более выраженной экспрессий p24ВИЧ и наличием экспрессии HLA-DP, DQ, DR в КК. Отмечена корреляция NS4 HCV в ГЦ с наличием ЦП R=0,37 (p=0,03).
При сравнении экспрессии иммунологических маркеров на клетках ВИП при различных морфологических
52 Журнал Гродненского государственного медицинского университета № 4 2013 г.
Оригинальные исследования
вариантах поражения печени установлены достоверные различия по двум показателям (таблица 8).
Таблица 8 - Экспрессия иммунологических и вирусных маркеров на клетках ВИП, в ГЦ и КК пациентов с ко-инфекцией ВИЧ/ВГС при разных морфологических вариантах поражения печени
Маркеры Медленно прогрессирующий вариант (ГНА), n=12 Быстропрогрессирующий вариант (ЦП), n=6
10-20% абс/% >20% абс/% Медиана, ИКР 10-20% абс/% >20% абс/% Медиана, ИКР
HLA-DP, DQ, DR в ВИП 9/75,0 4/33,3 15 (10-30) 1/16,7 5/83,3 45 (30-50)*
CD56 в ВИП 7/58,3 5/41,7 20 (20-30) 0 6/100 35 (30-50)*
Маркеры 1 балл >1 балла Медиана, 1 балл >1 балла Медиана,
абс/% абс/% ИКР абс/% абс/% ИКР
ВПГ1 в ГЦ 6/50,0 0 0,5 (0,0 - 1,0) 0 5/83,3 2,0 (2,0-2,0)
ВПГ1 в КК 1/8,3 0 0,0 (0,0-0,0) 5/83,3 0 1,0(1,0-1,0)
ВПГ2вКК 0 0 0,0 (0,0-0,0) 3/50,0 0 0,5(0,0-1,0)*
Примечание: ГНА — гепатит низкой активности, ЦП — цирроз печени; КК — клетки Купфера, ВИП — воспалительный инфильтрат печени; *p<0,05,Mann-WhitneyUTest
Как видно из таблицы 8, при быстропрогрессирующем варианте поражения печени отмечена более выраженная активация клеток ВИП и большее содержание ЕК в ВИП, а также более выраженная экспрессия АГ ВПГ 1 и 2 типов в ГЦ и КК. Экспрессия остальных клеточных и вирусных маркеров в клетках печени не различалась в сравниваемых группах.
Обнаружены обратные корреляционные связи ГНА у ВИЧ-инфицированных пациентов с экспрессией ВПГ 1 в различных клетках печени: в ГЦ - R= - 0,48 (p=0,004); в КК - R= - 0,39 (p=0,03); в ЭКП - R= -0,44 (p<0,001).
Обсуждение
До недавнего времени считалось, что ЛП являются компонентом ВИП, мигрируя из крови в ответ на различные патологические стимулы (токсины, вирусы, лекарства и т.д.). Однако во многих исследованиях было показано, что печень взрослого человека содержит популяцию собственных ЛП, не относящихся к циркулирующим лимфоцитам крови. В здоровой печени взрослого человека имеются выраженные различия в составе ЛП и лимфоцитов крови. Печень содержит как обычные циркулирующие в крови Т- и В-лимфоциты, естественные киллеры (ЕК), так и минорные субпопуляции лимфоцитов, содержащиеся в незначительном количестве в крови: гд Т-лимфоциты, 19% Т-лимфоцитов, негативных по экспрессии CD4 и CD8, 5% Т-лимфоцитов, одновременно экспрессирующих оба маркера. В печени содержится обширная популяция ЕК (до 20%), ЕК Т-лимфоци-тов, В-1 лимфоцитов, лимфоидных дендритных клеток. При патологии печени отмечается изменение состава ЛП за счет привлечения в печень различных клеток и формирования ВИП. Соотношение CD4/CD8 Т-лимфоцитов в печени здорового человека составляет 1:3,5, в то время как соотношение этих клеток в крови - 2:1, что указывает на относительно более высокий уровень ЦТЛ в печени по сравнению с кровью. Это связывают со «специализированным» ответом печени преимущественно на внутриклеточные патогены и опухолевую трансформацию клеток более, чем на внеклеточные антигены [5]. Наши результаты продемонстрировали приблизительно равное содержание CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в ВИП как в 1-й, так и во 2-й группах пациентов, что указывает на снижение содержания CD8+ клеток в ткани печени и согласуется с данными, полученными в других исследованиях [11]. В то же время в группе ко-инфицированных пациентов отмечено более высокое содержание ЦТЛ по сравнению с пациентами без ко-инфекции ВГС.
Клетки ВИП, экспрессирующие CD56, относятся к естественным киллерам [7]. ЕК принимают участие в адаптивном и врожденном иммунном ответе в печени. Содержание этих клеток в группах пациентов несколько превышало содержание их в здоровой печени (20%), значительное увеличение содержания данных клеток отмечено при ЦП.
Установлено, что взаимодействие поверхностного рецептора ВИЧ gp120 с CXCR4 индуцирует Fas-L-зави-симый механизм апоптоза неинфицированных гепато-цитов, приводя к быстрой прогрессии поражения печени. Было также показано, что при ко-инфекции ВИЧ/ВГС совместное взаимодействие gp120 Т- или М-тропного вариантов ВИЧ и оболочечного протеина Е2 HCV с ХР CXCR4 также активирует механизмы Fas-L-зависимого механизма апоптоза [4, 12]. В 1 группе отмечена менее выраженная экспрессия ХР CXCR4, который используется как ко-рецептор Х4-тропными вариантами ВИЧ. Известно, что ХР CXCR4 модулирует иммунный ответ и проявляет себя как маркер торможения иммунного ответа, в отличие от ХР CCR5, который ассоциируется с активацией клеточного иммунного ответа [13]. Обращает на себя внимание разное соотношение экспрессии 2 ХР (медиана) в 1 и 2 группах: в 1 группе экспрессия CCR5 превышала экспрессию CXCR4 на клетках ВИП, в то время как во 2 группе отмечена обратная закономерность -экспрессия CXCR4 превышала экспрессию CCR5, что подтверждается статистически более высоким показателем соотношения CCR5 и CXCR4 и указывает на превалирование процессов активации клеточного иммунитета в 1 группе пациентов по сравнению со 2 группой. Обнаружена обратная корреляционная связь экспрессии cXCr4 на клетках ВИП со стадией СПИД (R=-0,3 8, p=0,03) и ко-инфекцией ВГС (R=-0,44, p<0,01).
HLA-DP, DQ, DR отсутствует на покоящихся Т-клет-ках. В связи с чем данный маркер рассматривается как маркер активации иммунных клеток [14]. Установлена повышенная экспрессия HLA-DP, DQ, DR на КК при коинфекции ВИЧ/ВГС. Данный факт указывает на более выраженную активацию КК у пациентов с ко-инфекцией ВИЧ/ВГС по сравнению с пациентами без ко-инфекции ВГС. Наиболее высокое содержание данного маркера на клетках ВИП отмечено при ЦП, что указывает на неблагоприятный исход выраженной активации клеток печени.
Неструктурный NS4B протеин ВГС играет ключевую роль в репликации вируса ВГС, так как индуцирует формирование мембранной сети на эндоплазматической сети в процессе репликации РНК ВГС. В связи с этим экспрессия маркера свидетельствует о продуктивной ВГС-инфекции клеток [8]. Установлено, что 50% пациентов в группе ко-инфекции ВИЧ/ВГС имели продуктивную инфекцию ВГС, которая ассоциировалась с более высокой экспрессией ВИЧ в КК и более выраженной активацией КК, что подтверждает синергизм действия ВИЧ и ВГС при ко-инфекции и является одной из причин индукции ускоренного фиброзообразования. Подтверждением данного заключения является наличие достоверной корреляционной связи между продуктивной ВГС-инфекцией в ГЦ и ЦП.
Протеин p24 ВИЧ является капсидным протеи-
ном ВИЧ, участвует в пространственной укладке молекул всех прочих белков ВИЧ, в связи с чем обнаружение его в клетках печени указывает на продуктивную ВИЧ-инфекцию [9, 15]. Одновременное инфицирование ВИЧ ГЦ и КК обнаружено у 44,4% пациентов с ко-инфекцией ВИЧ/ВГС. У пациентов без ко-инфекции ВГС экспрес-
Журнал Гродненского государственного медицинского университета № 4 2013 г. 53
Оригинальные исследования
сия ВИЧ в КК отсутствовала. У пациентов с ко-инфекци-ей продуктивная ВИЧ-инфекция клеток печени ассоциировалась с более выраженной экспрессией NS4 протеина в ГЦ, увеличением частоты активированных КК, увеличением в них экспрессии TNF-б, повышенной экспрессии ВПГ 1 типа, что также подтверждает синергизм воздействия ВИЧ и ВГС на течение патологии печени, связь активации иммунных реакций в печени с репликацией ВИЧ и ВГ С в клетках печени.
TNF-б - цитокин, синтезируемый ЕК, ЕК-Т-лимфоци-тами Thl-типа. Наряду с IFN-г, TNF-б участвует в нецитолитическом иммунном ответе (ИО), который приводит к нарушению репликации ВГС, не вызывая деструкцию клеток печени. TNF-б является активным участником защиты против ВГС-инфекции как на стадии неспецифического ИО, так и при адаптивном иммунном ответе. TNF-б является доказанным профиброгенным цитокином [16, 17, 18]. У пациентов с ко-инфекцией ВИЧ/ВГС обнаружена значительно более высокая экспрессия данного цитокина в КК при продуктивной ВИЧ-инфекции печени, а также корреляция между экспрессией данного цитокина и активированными клетками КК в синусоидах, что указывает на более высокий фиброгенный потенциал ко-инфекции по сравнению с ВИЧ-инфекцией без ВГС.
Литература
1. Патоморфология печени у ВИЧ-инфицированных пациентов / Н.В. Матиевская [и др.] // 1нфекцшш хвороби. - 2012. - № 3 (69). - С. 15-23.
2. «Печеночная» летальность ВИЧ-инфицированных пациентов / Н.В. Матиевская [и др.] // Медицинская панорама. - 2011.
- № 1 (118). - С. 3-6.
3. Price, J.C. Liver Disease in the HIV-Infected Individual / J.C. Price, C. Thio // Clin. Gastroenterol. Hepatol. - 2010. - Vol. 8, №
12. - P. 1002-1012.
4. Hepatitis C and Human Immunodeficiency Virus Envelope Proteins Cooperatively Induce Hepatocytic Apoptosis via an Innocent Bystander Mechanism / N. Munshi et al. // The Journal of Infectious Diseases. - 2003. - Vol. 188. - P.1192-1204
5. Gershwin, M.E. Immunopathogenesis and therapy of hepatitis C / M.E. Gershwin, J.M. Vierling, M.P Manns // Liver Immunology / Hanley&Belfus, Ink. - Philadelphia, 2003. - 498 p.
6 . Crane, M. Human immunodeficiency virus infection and the liver / M. Crane, D. Iser, S. Lewin // World J. Hepatol. - 2012. - № 4 (3). - P. 9-98.
7. Хаитов, Р.М. Иммунология : учеб.для студентов мед. вузов / Р.М. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидорович. - Москва : Медицина, 2000. - 432 с.
8. Joyce, M.A. The cell biology of hepatitis C virus / M.A. Joyce, D. Lorne, J. Tyrrell // Microbes and Infect. xx. - 2010. - P. 1-
9.
9. A monoclonal antibody that recognizes a formalin-resistant epitope on the p24 core protein of HIV-1 / G. Kaluza [et al] // Path., Res. and Pract. - 1992. - Vol. 188. - P. 91-96.
10. Беляков, Н.А. Вирус иммунодефицита человека - медицина / Н.А. Беляков; под ред. Н.А. Белякова, А.Г. Рахмановой. - 2-е изд. - Санкт-Петербург :Балт. мед.образоват. центр, 2011. - Гл. 2 : Патофизиология ВИЧ-инфекции / М.Р Бобкова. - С. 39-62.
11. Preservation of intrahepatic hepatitis C virus (HCV)-specific CD4+ T cell responses despite global loss of CD4+T cells in HCV/HIV coinfection / С. Morishima et al. // The Journal of Infectious Diseases.
- 2007. -Vol. 196. - P. 577-586.
1 2 . Human Immunodeficiency Virus-Induced Apoptosis of Human Hepatocytes via CXCR4 / S. R. Vlahakis et al.] // The Journal of Infectious Diseases. - 2003. - Vol. 188. - P1455-1460.
13. Матиевская, Н.В. Особенности клеточного иммунитета у пациентов с коинфекцией ВИЧ/ВГС / Н.В. Матиевская, В.М. Цыр-кунов, А.Е. Гончаров // Инфекционные болезни. - 2012. - Т. 10,
Заключение
Установлены иммунологические признаки, доказывающие более выраженную активацию внутрипеченочного иммунитета у пациентов с ко-инфекцией ВИЧ/ВГС по сравнению с пациентами без ко-инфекции ВГС: большее содержание ЦТЛ в ВИП, активированных КК в синусоидах печени и более высокая частота продуктивной ВИЧ-инфекции КК. Продуктивная ВИЧ- и ВГС-инфекция гепатоцитов и КК приводила к более выраженной активации КК и повышенной экспрессии в них TNF-б. Быстропрогрессирующий вариант поражения печени при коинфекции ВИЧ/ВГС характеризуется более выраженной активацией клеток ВИП, повышением содержания ЕК в ВИП и ассоциируется с более выраженной экспрессией маркеров герпетических инфекций ВПГ1 и 2 типов в клетках печени по сравнению с медленно прогрессирующим вариантом. Полученные результаты обосновывают необходимость применения терапевтических подходов, направленных на редукцию продуктивной ВИЧ- и ВГС-инфекции в печени, позволяющей снизить избыточную активацию воспалительных иммунных реакций и экспрессию маркеров оппортунистических инфекций.
Literature
1 . Patomorfologiya pecheni u VICh-inficirovannyh pacientov / N.V. Matievskaya [i dr.] // Infekciinihvorobi. - 2012. - № 3 (69). -S. 15-23.
2. «Pechenochnaya» letal’nost’ VICh-inficirovannyh pacientov / N.V. Matievskaya [i dr.] // Medicinskaya panorama. - 2011. - № 1 (118). - S. 3-6.
3. Price, J.C. Liver Disease in the HIV-Infected Individual / J.C. Price, C. Thio // Clin. Gastroenterol. Hepatol. - 2010. - Vol. 8, №
12. - P. 1002-1012.
4. Hepatitis C and Human Immunodeficiency Virus Envelope Proteins Cooperatively Induce Hepatocytic Apoptosis via an Innocent Bystander Mechanism / N. Munshi et al. // The Journal of Infectious Diseases. - 2003. - Vol. 188. - P.1192-1204.
5. Gershwin, M.E. Immunopathogenesis and therapy of hepatitis C / M.E. Gershwin, J.M. Vierling, M.P. Manns // Liver Immunology / Hanley&Belfus, Ink. - Philadelphia, 2003. - 498 p.
6 . Crane, M. Human immunodeficiency virus infection and the liver / M. Crane, D. Iser, S. Lewin // World J. Hepatol. - 2012. - № 4 (3). - P. 9-98.
7. Haitov, R.M. Immunologiya : ucheb.dlya studentov med. vuzov / R.M. Haitov, G.A. Ignat’eva, I.G. Sidorovich. - Moskva : Medicina, 2000. - 432 s.
8. Joyce, M.A. The cell biology of hepatitis C virus / M.A. Joyce, D. Lorne, J. Tyrrell // Microbes and Infect. xx. - 2010. - P. 1-9.
9. A monoclonal antibody that recognizes a formalin-resistant epitope on the p24 core protein of HIV-1 / G. Kaluza [et al] // Path., Res. and Pract. - 1992. - Vol. 188. - P. 91-96.
10. Belyakov, N.A. Virus immunodeficita cheloveka - medicina / N.A. Belyakov; pod red. N.A. Belyakova, A.G. Rahmanovoi. - 2-e izd. - Sankt-Peterburg :Balt. med.obrazovat. centr, 2011. - Gl. 2 : Patofiziologiya VICh-infekcii / M.R. Bobkova. - S. 39-62.
1 1 . Preservation of intrahepatic hepatitis C virus (HCV)-specific CD4+ T cell responses despite global loss of CD4+T cells in HCV/HIV coinfection / S. Morishima et al. // The Journal of Infectious Diseases. - 2007. -Vol. 196. - P. 577-586.
12. Human Immunodeficiency Virus-Induced Apoptosis of Human Hepatocytes via CXCR4 / S. R. Vlahakis et al.] // The Journal of Infectious Diseases. - 2003. - Vol. 188. - P1455-1460.
13. Matievskaya, N.V. Osobennosti kletochnogo immuniteta u pacientov s koinfekciei VICh/VGS / N.V. Matievskaya, V.M. Cyrkunov, A.E. Goncharov // Infekcionnye bolezni. - 2012. - T. 10, № 4. - S. 6-1 1 .
54 Журнал Гродненского государственного медицинского университета № 4 2013 г.
Оригинальные исследования
№ 4. - С. 6-11.
14. Activation and Cell Cycle Antigens in CD4+ and CD8+ T Cells Correlate with Plasma Human Immunodeficiency Virus (HIV-1) RNA Level in HIV-1 Infection / J.M. Orendi [et al.] // The J. of Infect. Dis. - 1998. - № 178. - P. 1279-1287.
15. Engelman, A. The structural biology of HIV1: mechanistic and therapeutic insights / A. Engelman, P. Cherepanov // Nat. Rev. Microbiol. - 2012. - Vol. 10. - P. 279-290.
16. Human Immunodeficiency Gp120 modulates the biology of human hepatic stellate cells: a link between HIV infection and liver brogenesis / R. Bruno [et al.] // Gut. - 2010. - № 59. - P 513-520.
17. Balasubramanian, A. Underlying pathophysiology of HCV infection in HIV positive drug users / A. Balasubramanian, J.E. Groopman, R. K. Ganju // J. Addict. Dis. - 2008. - Vol. 27 (2). - P 7582.
18. Virus (HIV)-1 Infects Human Hepatic Stellate Cells and Promotes Collagen I and Monocyte Chemoattractant Protein-1 Expression: Implications for the Pathogenesis of HIV/Hepatitis C Virus - Induced Liver Fibrosis / A.C. Tuyama [et al.] // Hepatology. -2010. - № 52 (2). - P. 612-622.
14. Activation and Cell Cycle Antigens in CD4+ and CD8+ T Cells Correlate with Plasma Human Immunodeficiency Virus (HIV-1 ) RNA Level in HIV-1 Infection / J.M. Orendi [et al.] // The J. of Infect. Dis. - 1998. - № 178. - P. 1279-1287.
15. Engelman, A. The structural biology of HIV?1: mechanistic and therapeutic insights / A. Engelman, P. Cherepanov // Nat. Rev. Microbiol. - 2012. - Vol. 10. - P. 279-290.
1 6. Human Immunodeficiency Gp1 20 modulates the biology of human hepatic stellate cells: a link between HIV infection and liver fibrogenesis / R. Bruno [et al.] // Gut. - 2010. - № 59. - P. 513-520.
17. Balasubramanian, A. Underlying pathophysiology of HCV infection in HIV positive drug users / A. Balasubramanian, J.E. Groopman, R. K. Ganju // J. Addict. Dis. - 2008. - Vol. 27 (2). - P. 7582.
18. Virus (HIV)-1 Infects Human Hepatic Stellate Cells and Promotes Collagen I and Monocyte Chemoattractant Protein-1 Expression: Implications for the Pathogenesis of HIV/Hepatitis C Virus - Induced Liver Fibrosis / A.C. Tuyama [et al.] // Hepatology. -2010. - № 52 (2). - P. 612-622.
EXPRESSION OF IMMUNOLOGICAL AND VIRAL ANTIGENS IN LIVER TISSUE OF
HIV/HCV CO-INFECTED PATIENTS
Matiyevskaya N.V.’ Tsyrkunov V.MJ, Zubritskiy M.G.2, Prokopchik N.I.2 1-Educational Establishment «Grodno State Medical University», Grodno, Belarus 2- Health Care Institution "Grodno Regional Pathoanatomical Bureau", Grodno, Belarus
The frequency and degree of expression of CD4, CD8, CD56, CD68, HLA-DP, DQ, DR, CCR5, CXCR4, p24 HIV, NS4 HCV, HSV1 and 2 types, HPVantigens in liver tissue has been detected by immunohistochemical methods in 18 patients with HIV/HCV co-infection and in 15 patients with HIV infection. Among HIV/HCV co-infected patients rapid progression of the liver disease was associated with higher content ofnatural killers, higher activation of inflammatory infiltrate cells of liver tissue and also higher expression of HSV 1 and 2 antigens in liver cells in comparison with patients with slow progression of the liver disease.
Key words: HIV/HCV co-infection, liver, immunohistochemistry, hepatocytes, Kupffer cells, inflammatory infiltrate, TNF-б, CD56, CCR5, CXCR4, p24 HIV, NS4 HCV, HSV types 1 and 2.
Адрес для корреспонденции: е-mail: keth1@rambler.ru
Поступила 20.11.2013
Журнал Гродненского государственного медицинского университета № 4 2013 г. 55
