CC BY
45
Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Медицина. - 2011. - Вип. 2, т. 1. - С. 18-23. Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology. Medicine. - 2011. - Vol. 2, N 1. - P. 18-23.
УДК 546.719:577.151.4
Ю. С. Воронкова, Н. І. Штеменко
Дніпропетровський національний університет ім. Олеся Гончара
ВПЛИВ КЛЛСТЕРНИХ СПОЛУК РЕНІЮ З ОPГAHIЧHИMИ ЛIГAHДAMИ HA AKTИВHICTЬ ГЛЮKОЗООKCПДAЗИ
Досліджено вплив кластерних сполук ренію на активність глюкозооксидази in vitro. Показано залежність інтенсивності взаємодії кластерних сполук ренію з білками від концентрації та структури сполуки. Кластерні сполуки ренію з органічними лігандами безпосередньо взаємодіють із білковими молекулами: активність глюкозооксидази достовірно змінюється на 4-24 %. Кластерна сполука ренію з ГAMK як ліганду знижує активність глюкозооксидази, а сполуки ренію з гідрофобними радикалами як лігандами здатні підвищувати активність ферментів, що свідчить про різні механізми взаємодії кластерних сполук ренію з ферментами.
Ю. С. Воронкова, Н. И. Штеменко
Днепропетровский национальный университет им. Олеся Гончара
ВЛИЯНИЕ KЛACTEPHЫX СОЕДИНЕНИЙ РЕНИЯ С ОPГAHИЧECKИMИ ЛИГAHДAMИ HA AKT^^C^ ГЛЮKОЗООKCИДAЗЫ
Исследовано влияние кластерных соединений рения на активность глюкозооксидазы in vitro. Установлена способность исследуемых соединений рения оказывать влияние на активность оксида-зы в зависимости от структуры соединения и времени инкубации: активность глюкозооксидазы изменяется на 4-24 %. Кластерное соединение рения с TAMK в качестве лиганда снижает активность глюкозооксидазы, а соединения рения с гидрофобными радикалами в качестве лигандов способны повышать активность, что свидетельствует о разных механизмах взаимодействия кластерных соединений рения с ферментами.
Y. S. Voronkova, N. I. Shtemenko
Oles’ Нonchar Dnipropetrovsk National University
INFLUENCE OF CLUCTER RHENIUM COMPOUNDS WITH ORGANIC LIGANDS ON ACTIVITY OF GLUCOSE OXIDASE
Influence of cluster rhenium compounds with different ligands on the activity of glucose oxidase was studied. Ability of the rhenium compounds to influence on the enzyme’s activity was ascertained. It is depended on the compound structure and the time of incubation: activity of the glucose oxidase changed by 4-24 %. The cluster compound with GABA ligand reduced the enzymatic activity, but compounds with hydrophobic ligands increased the activity of glucose oxidase. Different mechanisms of the cluster rhenium compound-enzyme interactions are suspected.
Вступ
Дослідження взаємодії металоорганічних сполук із ферментами має значний практичний і теоретичний інтерес, оскільки торкається таких важливих аспектів протео-
© Ю. С. Воронкова, Н. І. Штеменко, 2011 18
міки як транспорт, токсичність, механізм дії, індукція або гальмування активності та інші питання, пов’язані з упровадженням лікарських препаратів, розроблених на основі сполук металів [2; 15-17; 19; 20; 22-23].
У наших попередніх працях в експериментах in vivo та in vitro показано, що кла-стерні сполуки ренію з органічними лігандами виявляють протипухлинну, антигемолі-тичну та антирадикальну дію та є біохімічними модуляторами цисплатину, тобто посилюють його дію з одночасним зниженням токсичності [1; 10; 24-27]. Показано здатність кластерних сполук ренію впливати на взаємодію антиген - антитіло [8; 9; 24] та на активність фосфатаз [3]. Проте механізм взаємодії сполук ренію з найважливішими біополімерами живої клітини - білками вивчено недостатньо. Особливо цікавим питанням є можливий безпосередній вплив кластерів ренію на систему окси-даз. Отже, мета цієї роботи - з’ясувати вплив кластерних сполук ренію різної структури на активність глюкозооксидази.
Mатеріал і методи досліджень
Досліджували такі сполуки ренію: Re2(CH3COO)2Cl42H2O - Rei - бісакватетрах-лороди-ц-ацетатодиреній (III); Re2(i-C3H7COO)4Cl2 - Re2 - дихлоротетра-ц-і-бутиратодиреній (ТТТ); иис-Re/GABAJCldClHO - Re3 - цис-тетрахлороди-ц-у-амінобутирато-диреній (III) хлорид, які готували в Українському державному хіміко-технологічному університеті на кафедрі неорганічної хімії [8; 11; 25; 26].
Об’ єкт для проведення досліду - двокомпонентна ферментна система - глюко-зооксидаза-пероксидаза [6; 14], яка складається з розчинів ензимів: пероксидази та Р-глюкозооксидази. Зміни активності оксидази від часу інкубування досліджували, використовуючи метод визначення глюкози у біологічних рідинах глюкозооксидазним методом, який базується на тому, що глюкоза за присутності глюкозооксидази окис-нюється киснем повітря до глюконової кислоти та перекису водню, який за присутності пероксидази реагує з фенолом та 4-амінофеназином з утворенням хіноніміну червоно-фіолетового забарвлення; останній визначається фотометрично при довжині хвилі 540 нм [5]. Для проведення досліду готували водні розчини сполук ренію Rei, Re2 та Re3 у діапазоні концентрацій від 10-6 до 10-10. Досліди проводили після попередньої інкубації сполук ренію з оксидазою (+37 °С). Для кожної концентрації проводили чотири серії вимірювань, які розрізнялися за часом інкубації оксидази з кожним комплексом ренію: у пробірки першої серії глюкозу додавали через 10 хвилин, другої -через годину, третьої - через 2 години, четвертої - через 3 години після додавання досліджуваних комплексів. Активність ферментативних реакцій вимірювали протягом хвилини. Через хвилину додавали до робочого розчину 0,02 мл 10 мМ глюкози.
Як контроль використовували розчин глюкози, який не містив кластерних сполук ренію з органічними лігандами. Статистичну обробку результатів проводили, використовуючи t-критерій Стьюдента. Вірогідним вважали результат, якщо р < 0,05 [13].
Результати та їх обговорення
Кластерні сполуки ренію з органічними лігандами впливають на активність глюкозооксидази (табл. 1). Існує залежність активації ферментної системи від часу інкубації зі сполуками ренію. У цьому відношенні між реній-ацетатними (Rei) та реній-ізобутиратними (Re2) сполуками можна відмітити значну подібність у активації досліджуваної оксидази: відбувається зростання показника, що вивчається, до часу інкубації 2 години, а після 3 годин інкубації відмічали зниження активності при застосуванні комплексу Rei в концентрації 10-6 до значень, менших за контрольний показник.
Для системи Яе2 також виявлено подібну залежність, однак навіть після 3 годин інкубації активність системи залишається вищою за показник контролю на 4-9 %.
Таблиця 1
Активність глюкозооксидази при інкубації з досліджуваними комплексами ренію (моль/л)
Час інкубації, години Контроль Яеі Яе2 Яе3
Ю-6 Ю-8 і0-ш Ю-6 Ю"8 і0-і° Ю-6 Ю-8 і0-ш
0,і5 0,085 ± 0,004 0,082 ± 0,004 0,і02 ± 0,005 0,088 ± 0,004 0,092 ± 0,005 0,096* ± 0,005 0,09і ± 0,005 0,056 ± 0,003 0,04і ± 0,002 0,064 ± 0,003
і 0,085 ± 0,004 0,09і ± 0,005 0,і06* ± 0,005 0,098* ± 0,005 0,09і ± 0,005 0,094 ± 0,005 0,092 ± 0,005 0,067* ± 0,003 0,045* ± 0,003 0,068* ± 0,003
2 0,085 ± 0,004 0,089 ± 0,003 0,і02* ± 0,005 0,09і ± 0,005 0,088 ± 0,004 0,094 ± 0,005 0,090 ± 0,005 0,050 ± 0,002 0,052* ± 0,003 0,053* ± 0,003
3 0,085 ± 0,004 0,082 ± 0,004 0,088 ± 0,004 0,086 ± 0,004 0,090 ± 0,005 0,093 ± 0,005 0,089 ± 0,003 0,044* ± 0,002 0,05і* ± 0,003 0,06і ± 0,003
Примітка: * - порівняно з контролем р < 0,05 (п = 8).
Отримані дані свідчать про зворотний механізм зв’язування кластерних сполук ренію з білками системи: спочатку утворюється щільніший комплекс білок - Яеі та білок - Яе2. Але реакція має зворотній механізм, тобто реакція між білками (Ргої) та сполуками ренію є рівноважною:
Ргоґ + Яві Ргоґ - Яві,
Ргоґ + Яв2 Ргоґ - Яв2.
Із часом відбувається гідроліз сполук ренію Яеі та Яе2 [іі], отже рівновага зсувається у бік вільного ферменту. При концентрації сполук ренію 10^ сполуки ренію Яеі та Яе2 майже не впливають на активність глюкозооксидази порівняно з контролем (рис. і); активність зростає на 4-7 % для Яеі після одно- та двогодинної інкубації та на 3-8 % для Яе2, а Яе3 знижує активність оксидази удвічі порівняно з контролем.
0,і
&
« 0,09
іо
I 0,08
I 0,07
О
£ 0,06
к
ІЗ 0,05
о
0,04
0,і5 і 2 3
Час інкубування, години Рис. 1. Активність глюкозооксидази при інкубації зі сполуками ренію в 10-6 М розчинах
При дослідженні сполук ренію при концентрації і0-8 відмічено (рис. 2), що акти-вувальний вплив належить комплексу ренію Яеі: після однієї години інкубації його активність зростає на 24 %, а вже після трьох годин відбувається зниження показників до рівня контролю, що може бути пояснено зворотним зв’язуванням комплексу з ак-20
тивним центром глюкозооксидази, в якому розташовані залишки гістидину [12; 21]. Для Яе2 показано незначне збільшення активності (на 12 %) після 15 хвилин інкубації та поступове зниження активності (на 9 %) порівняно з контролем. При дослідженні Яе3 показано, що з часом інкубації активність зростає, що може бути доказом незво-ротного зв’язування комплексу ренію з молекулою білка.
0,11
& 0,1
^ 0,09
Ч 0,08
§ 0,07
О
Е? 0,06 <й К
Ё 0,05 о 0,04
0,03
0,15 1 2 3
Час інкубування, години Рис. 2. Активність глюкозооксидази при інкубації зі сполуками ренію в 10-8 М розчинах
Активність глюкозооксидази залежно від часу інкубації та концентрації 10-10 М комплексів Яе1 та Яе2 також практично не змінюється порівняно з контролем (рис. 3). Відмічене збільшення активності для Яе1 після одно- та двогодинної інкубації на 715 % порівняно з контролем, але вже після трьох годин показник сягає значень контролю. Ідентичну картину відмічено і для Яе2: після однієї години інкубації зареєстроване збільшення на 8 % порівняно з контролем, а після трьох годин показник досяг значень контролю. Все це підтверджує припущення щодо механізму взаємодії кластерних сполук ренію з органічними лігандами білками.
і?
ч
і5
и
2
X
К
н
о
&
Й
X
ґ
к
н
0,15 1 2 3
Час інкубування, години Рис. 3. Активність глюкозооксидази при інкубації зі сполуками ренію в 10-10 М розчинах
-Яе1
-Яе2
-Яе3
-контроль
Активувальна дія пригнічується разом із ліпофільністю радикала. В усіх випробуваних концентраціях комплексів (окрім Re3) максимальну активність спостерігали після одногодинної інкубації (7-24 %). Після дво- та тригодинної інкубації активація ферментів зменшувалася: для Re1 зменшення зареєстоване для всіх концентрацій, для Re2 - для концентрацій 10-8 та 10-10 моль/л, для Re3 - в усіх досліджуваних концентраціях відмічене зниження активності майже удвічі порівняно з контролем.
Проаналізувавши залежність впливу Re3 на активність системи досліджуваних ферментів, можна сказати, що ця реакція практично незворотна. Оскільки в Re1 та Re2 лігандів, що оточують кластерний фрагмент, є гідрофобні радикали, можна припустити, що ці сполуки реагують із гідрофобними залишками амінокислот, що значно не впливає на конформацію активного центру оксидоредуктаз та їх активність. На відміну від Re1 та Re2, Re3 має позитивно заряджений радикал ГАМК. Ця кластерна сполука може реагувати з іоногенними амінокислотами, розташованими в активному центрі глюкозооксидази (залишки гістидину) [12; 21] та амінокислотами, розташованими в активному центрі пероксидази (гістидин і аргінін) [4; 13; 18]; або зв’язується з іоноген-ними амінокислотами глобули ферментів шляхом утворення іонних зв’язків, що, на відміну від гідрофобних взаємодій, значно змінює конформацію білків і негативно впливає на активні центри ферментів.
Висновки
Кластерні сполуки ренію з органічними лігандами безпосередньо взаємодіють із білковими молекулами системи глюкозооксидази. Активність глюкозооксидази достовірно змінюється на 4-24 %. Кластерна сполука ренію Re3 знижує активність глюкозооксидази, а сполуки ренію Re1 та Re2 з гідрофобними радикалами здатні підвищувати активність ферментів, що свідчить про різні механізми взаємодії кластер-них сполук ренію з ферментами.
Бібліографічні посилання
1. Антиокислювальна активність біядерних комплексів ренію в експерименті in vitro /
І. В. Пирожкова-Паталах, H. І. Штеменко, О. А. Лихолат, І. І. Паталах // Питання біоіндикації та екології. - 2001. - Вип. 6, № 1. - С. 61-67.
2. Взаимодействие белков с соединениями платины и палладия, обладающими различной биологической активностью / Е. Н. Жмарева, Г. Д Зегжда, Г. Б. Касьян, О. А. Ливенская // Укр. биохим. журн. - 1996. - Т. 68, № 3. - С. 74-79.
3. Вплив комплексних сполук диренію (III) на каталітичну активність фосфатаз / О. В. Берзе-ніна, Н. І. Штеменко, Ю. С. Воронкова та ін. // Вопросы химии и химической технологии. -
2007. - № 6. - С. 40-44.
4. Газарян И. Г. Особенности стуктуры и механизма действия пероксидаз растений / И. Г. Газарян, Д. М. Хушпульян, В. И. Тишков // Успехи биологической химии. - 2006. - Т. 46. - С. 303-322.
5. Горячковский А. М. Пособие по клинической биохимии. - Одесса : ОКФА, 1994. - С. 255-258.
6. Гулый М. Ф. Фермент глюкозооксидаза и его применение. - К. : Наука, 1964. - 278 с.
7. Дослідження впливу кластерних сполук ренію на взаємодію антиген - антитіло методом іму-нодифузії за Ухтерлоні / Н. І. Штеменко, А. В. Штеменко, М. В. Горіла, Л. М. Александрова // Вісник Дніпропетр. ун-ту. Біологія. Екологія. - 2002. - Вип. 10, т. 2. - С. 100-104.
8. Єгорова Д. Є. Взаємодія біядерних кластерів ренію (ІІІ) з фосфоліпідами та вищими карбоновими кислотами за формування мікрокапсул: Автореф. дис. ... канд. хім. наук; Держ. хім.-тех. ун-т. - Д., 2010. - 18 с.
9. Закономірності взаємодії антиген - антитіло у розчинах кластерних сполук ренію та циспла-тину / М. В. Горіла, Т. М. Полішко, А. М. Аношко та ін. // Вісник Дніпропетр. ун-ту. Біологія. Екологія. - 2009. - Вип. 17, т. 2. - С. 37-40.
10. Изучение влияния комплексов рения с органическими лигандами на кислотную резистентность эритроцитов человека / Н. И. Штеменко, И. В. Пирожкова-Паталах, А. В. Штеменко,
A. А. Голиченко // Укр. биохим. журн. - 2000. - Т. 72, № 3. - С. 77-81.
11. Изучение процессов гидролиза биядерных кластерных соединений рения (III) различных структурных типов / Д. Е. Егорова, О. В. Берзенина, В. Г. Столяренко, А. В. Штеменко // Вопросы химии и химической технологии. - 2008. - № 1. - С. 27-31.
12. Минаев Б. Ф. Модели электронного строения флавопротеидов и механизм действия оксидаз / Б. Ф. Минаев, В. А. Минаева, В. Н. Лещенко // Біополімери і клітина. - 2004. - Т. 20, № 3. -С. 224-232.
13. Лакин Г. Ф. Биометрия. - М. : Высшая школа, 1990. - 352 с.
14. Рогожин В. В. Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов. -СПб : ГИОРД, 2004. - 240 с.
15. A thermodynamic study on the binding of human serum albumin with new synthesized anticancer Pd (II) complex / G. R. Behbehani, A. Divsalar, A. A. Saboury et al. // Journal of Solution Chemistry. -
2008. - Vol. 37, N 12. - P. 1785-1794.
16. Clarke M. J. Ruthenium metallopharmaceuticals // Coordination ^emist^ Reviews. - 2003. -Vol. 236. - P. 209-233.
17. Effects of human serum albumin in some biological properties of Rhodium (II) complexes /
B. P. Espositoa, E. de Oliveira, S. B. Zyngier et al. // J. Braz. Chem. Soc. - 2000. - Vol. 11, N 5. -P. 447-452.
18. Howard R. A. The interaction of Rhodium (II) carboxylates with enzymes / R. A. Howard, T. G. Spring, J. L. Bear // Cancer Research. - 1976. - Vol. 36. - P. 4402-4405.
19. Jones C. J. Medicinal applications of coordination chemistry / C. J. Jones, J. R. Thornback. -Cambridge, UK : RSC Publishing, 2007. - 353 p.
20. Keppler B. K. Anti-tumor properties of metal complexes / B. K. Keppler, E. A. Vogel // Handbook of Metal-Ligand Interactions in Biological Fluids - Bioinorganic Medicine. - 1995. - Vol. 2, p. 3. -P. 1200-1229.
21. Prabhakar R. A theoretical study of the dioxygen activation by glucose oxidase / R. Prabhakar, P. Sie-gbahn, B. F. Minaev // Biochem. Biophys. Acta. Bioenergetics. - 2003. - Vol. 1647. - P. 173-178.
22. Reedijk J. Medicinal application of heavy metal compounds // Curr. Opin. Chem. Biol. - 1999. -Vol. 3. - P. 236-240.
23. Reversible precipitation of bovine serum albumin by metal ions and synthesis, structure and reactivity of new tetrathiometallate chelating agents / V. E. Lee, J. M. Schulman, E. I. Stiefel et al. // Journal of Inorganic Biochemistry. - 2007. - Vol. 101. - P. 1707-1718.
24. Shtemenko N. I. Interaction of Rhenium cluster compounds with human blood proteins / N. I. Shte-menko, M. V. Gorelaya, L. M. Alexandrova // Metal Ions in Biology and Medicine. - 2002. - Vol. 7. -P. 34-36.
25. Shtemenko A. V. Synthesis of novel tetracarboxylato dirhenium (III) compounds and crystal structure of them / A. V. Shtemenko, A. A. Golichenko, K. V. Domasevitch // Z. Naturforsch. - 2002. -Vol. 56b. - P. 381-385.
26. Shtemenko N. I. Dichlorotetra-rn-isobutiratodirhenium (III): Enhancement of cisplatin action and RBC-stabilizing properties / N. I. Shtemenko, P. ^Hery, A. V. Shtemenko // Anticancer Research. -2007. - Vol. 27, N 4. - P. 2487-2492.
27. Synthesis, characterization, in vivo antitumor properties of the cluster rhenium compound with GABA ligands and its synergism with cisplatin / A. V. Shtemenko, P. Collery, N. I. Shtemenko et al. // Dalton Trans. - 2009. - Vol. 26. - P. 5132-5136.
Надійшла до редколегії 21.03.2011
