CC BY
46
Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Медицина. - 2011. - Вип. 2, т. 2. - С. 110-116. Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology. Medicine. - 2011. - Vol. 2, N 2. - P. 110-116.
УДК 577.151.643
С. С. Семенов1, К. Л. Шамелашвили1, О. О. Чугуз1, Т. О. Лоскутова2, Н. І. Штеменко1
1 Дніпропетровський національний університет ім. Олеся Гончара 2Дніпропетровська державна медична академія
СТАН КОАГУЛЯЦІЙНОГО ГЕМОСТАЗУ ПРИ КАНЦЕРОГЕНЕЗІ ТА ЗАСТОСУВАННІ СИСТЕМИ РЕНІЙ-ПЛАТИНА У НАНОФОРМАХ
Досліджено показники системи гемостазу у щурів-пухлиноносіїв у моделі пухлинного росту за умов уведення кластерних сполук ренію з різними органічними лігандами окремо та у системі реній-платина. При розвитку пухлини спостерігається підвищення активності коагуляційної ланки системи гемостазу порівняно з контролем. При застосуванні досліджуваних кластерних сполук ренію спостерігалася стабілізація показників системи гемостазу (протромбінового часу та концентрації фібриногену у крові дослідних груп тварин і зменшення гепатотоксичності цисплатину). Ефект стабілізації залежить від способу уведення кластерної сполуки: максимальний він для сполуки з адамантильними лігандами та гепатостабілізувальною активністю.
С. С. Семенов1, К. Л. Шамелашвили1, А. А. Чугуз1, Т. А. Лоскутова2, Н. И. Штеменко1
1Днепропетровский национальный университет им. Олеся Гончара 2Днепропетровская государственная медицинская академия
СОСТОЯНИЕ КОАГУЛЯЦИОННОГО ГЕМОСТАЗА ПРИ КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ И ПРИМЕНЕНИИ СИСТЕМЫ РЕНИЙ-ПЛАТИНА В НАНОФОРМАХ
Исследованы показатели гемостаза у крыс-опухоленосителей в модели опухолевого роста при условии введения кластерных соединений рения с различными органическими лигандами отдельно и в системе рений-платина. При развитии опухоли наблюдается повышение активности коагуляционного звена системы гемостаза сравнительно с контролем. При применении исследованных кластерных соединений рения наблюдалась стабилизация показателей системы гемостаза (частности протромбинового времени и концентрации фибриногена в крови исследуемых групп животных и уменьшения гепатотоксичности цисплатина). Эффект стабилизации зависит от способа введения кластерных соединений: максимален он для соединения с адамантильным лигандом и гепатостабилизирующей активностью.
S. S. Semenov1, K. L. Shamelashvili1, O. O. Chuguz1, T. O. Loskutova2, N. I. Shtemenko1
1 Oles ^nchar Dnipropetrovs’k National University 2Dnipropetrovsk State Medical Academy
COAGULATION HAEMOSTASIS UNDER CARCINOGENESIS AND APPLICATION OF RHENIUM-PLATINUM NANOFORMS
The model of tumour growth was used for the haemostasis study. The introduction of cluster rhenium compounds with different organic ligands separately and in the rhenium-platinum system was carried out. It was shown that the development of tumours increases the coagulation processes as compared with the control. The treatment with the studied cluster rhenium compounds stabilizes the haemostasis
© С. С. Семенов, К. Л. Шамелашвили, О. О. Чугуз, Т. О. Лоскутова, Н. І. Штеменко, 2011
110
system parameters. It includes the prothrombin time and the blood fibrinogen concentration and the decrease of cisplatin hepatotoxicity. Stabilization effect depended on the method of introduction of the cluster compounds and it was maximal for compounds with the adamantyl ligand and hepatostabilizing activity.
Вступ
Система згортання крові - сукупність реакцій, що відбувається у судинній стінці та здійснюють захист організму при травмах і крововиливах від втрати крові завдяки утворенню фібринових ниток при взаємодії плазменних факторів. Саме завдяки коагуляційному гемостазу забезпечується повна зупинка кровотеч [5]. Патології згортальної системи крові можуть бути причиною багатьох тяжких ускладнень (тромбоемболічні стани, геморагії тощо) [б]. Ці порушення ускладнюються при патологічних станах організму: при злоякісних новоутвореннях спостерігається підвищення активності показників коагуляційного гемостазу, що досить часто є причиною названих ускладнень (тромбозів тощо) і може призвести до ускладнень основного захворювання, навіть до летальних випадків [3]. Систему гемостазу можна умовно поділити на три ланки: згортання, протизгортання та фібринолітичну [8]. Згортальна ланка гемостазу умовно складається із клітинного (судинно-тромбоцитарний) і плазменного (коагуляційний) гемостазу. Пухлинні клітини секретують високоактивний тканинний фактор і специфічний раковий прокоагулянт, які ініціюють процеси внутрішньоклітинного згортання крові [1].
У працях нашої групи [14; 15] показано ефективність протипухлинної системи реній-платина (Re-Pt), яка полягає в уведенні щурам-пухлиноносіям одноразово цис-платину та кластерної сполуки ренію десятиразово за схемою антиоксидантної терапії. У цих працях показано також доцільність використання ліпосомних форм, навантажених Re-Pt системою та її компонентами. Подальше впровадження перспективної системи Re-Pt пов’язане з удосконаленням способів уведення (використання наноліпосом і твердих наночасток), всебічним вивченням біохімічних особливостей організму при застосуванні системи.
Мета даної роботи - з’ясувати вплив системи Re-Pt на показники коагуляційного гемостазу щурів-пухлиноносіїв.
Матеріал і методи досліджень
Вивчали наступні кластерні сполуки ренію: Rel - Re2(i-C3H7COO)4Cl2 - дихлоро-тетра-ц-ізобутиратодиреній (III), Re2 - Re2(CH3COO)4(H2PO4)22H2O - біс(дигідрофос-фато)тетра-ц-ацетатодиреній (III), Re3 - цис-Re2(AdCOO)2Cl4■2CH3CN - цис-діацето-нітрилотетрахлороди-ц-адамантилкарбоксилатодиреній, синтезовані в Українському державному хіміко-технологічному університеті (УДХТУ) [11; 14]. Наноліпосомні (nl) форми та тверді наночастки (np), навантажені компонентами системи Re-Pt із різним співвідношенням, виготовляли також в УДХТУ [4].
Сполуки ренію та платини уводили різними способами: одноразове
внутрішньочеревинне уведення розчину цисплатину у дозі 8 мг/кг на 9-ту добу після трансплантації пухлини та внутрішньочеревинне уведення кластерних сполук ренію у розчині (sln) за схемою антиоксидантної терапії у дозі 7 мкмоль/кг із кінцевим молярним співвідношенням уведених сполук ренію та платини 4 : 1 та 4 : 2 починали на третю добу після трансплантації ракових клітин з інтервалом в 1 добу протягом 21 доби; уведення наноліпосом і твердих наночасток розміром 10-100 нм навантажених сполуками ренію та цисплатином у молярному співвідношенні 4 : 1 та 4 : 2 проводили починаючи з третьої доби після трансплантації пухлини із розрахунку 7 мкмоль/кг ренієвої сполуки. Наноліпосомні форми уводили внутрішньочеревинно, а тверді наночастки - per os.
111
Змішану венозно-артеріальну кров отримували шляхом декапітації тварин згідно з Європейською конвенцією про захист хребетних тварин, що використовується для дослідних та інших наукових цілей. Як антикоагулянт використовували цитрат натрію. Усі дослідження проводили у день збору крові. Для отримання плазми кров центрифугували при 1500 об./хв упродовж 15 хв, потім відділяли плазму. Для визначення протромбінового індексу додавали 100 мкл плазми у пробірку з 100 мкл тромбопла-стину та 100 мкл 0,028 % кальцію хлориду та вимірювали час утворення згустку [2]. Для визначення концентрації фібриногену додавали до 1 мл плазми 100 мкл 5 % хлористого кальцію та інкубували за +37 °С протягом 15 хв. Далі згусток переносили на обеззолений паперовий фільтр і просушували іншим фільтром до повітряно-сухого стану, тобто до того як на фільтрі не залишиться вологої плями. Потім згусток висушеного фібрину негайно зважували на торсійних терезах [2].
Результати та їх обговорення
Розвиток пухлини (рис. 1) супроводжується збільшенням протромбінового індексу на 41 % та концентрації фібриногену на 67 % порівняно з контролем (рис. 2).
и
Ч
■ ІЗ « к т о К
о
&!
н
о
£
120
100
80
60
40
20
0
ІІІІ
сопітої Т8 Т8 + Т8 + Т8 + [Яе1 Т8 + [Яе1
[Яе1] пр' Ре1] + сРі] пр' +сРі] пр'
пр+сРі (4:1) (4:2)
Групи
Рис. 1. Значення протромбінового індексу у крові щурів із карциномою Герена при введенні сполук ренію та системи реній-платина (Яе1) у формі наночасток (пр):
див. Матеріал і методи досліджень, * - вірогідна різниця порівняно з групою Т8, р < 0,05
Це свідчить про активацію коагуляційної системи крові при розвитку новоутворення. Порушення коагуляційного гемостазу може бути викликане такими факторами: набутим чи спадковим зменшенням або порушенням синтезу плазменних і тромбоци-тарних факторів згортання крові та компонентів калікреїн-кінінової системи; зменшенням або збільшенням залучення цих факторів до біохімічних реакцій; збільшенням концентрації ендогенних антикоагулянтів; активізацією фібринолітичної системи [8]. При онкологічних захворюваннях система гемостазу характеризується збільшеною схильністю до згортання (тромбоемболічні ускладнення) [3; 6].
Тверді ліпідні наночастки, навантажені антиканцерогенними препаратами, являють собою нову перспективну лікарську форму, зручну для вживання та зберігання [12], та характеризуються значною ефективністю. При уведенні наночасток, навантажених тільки сполукою ренію Яві, не відбувалося значного зменшення пухлини (гальмування 34 %), проте протромбіновий індекс зменшувався на 57 %, не досягаючи норми, а концентрація фібриногену змінювалася на 49 % у бік нормалізації порівняно з групою пухлиноносіїв. Отже, застосування твердих наночасток, навантажених сполу-
ками ренію, зумовлює нормалізацію системи коагуляційного гемостазу незалежно від ефективності гальмування новоутворення.
2
о
к
и
р
ю « ■ 'В
сЗ
р
Н
К
<и
Я
К
о
control T8 T8 + T8 + T8 + [Rel T8 + [Rel
[Rel] np' [Rel] np' + cPt] np' + cPt] np'
+ cPt (4:1) (4:2)
Групи
Рис. 2. Концентрація фібриногену у крові щурів із карциномою Герена при введенні сполук ренію та системи реній-платина (Rel) у формі наночасток (np): див. рис. 1
Використання тих самих наночасток разом із розчином цисплатину, незважаючи на значну антиканцерогенну ефективність (гальмування пухлини - 80 %), викликало активацію системи гемостазу практично на рівні групи TS, що, на нашу думку, пов’язано із гепатотоксичністю розчинів цисплатину [11; 1б] та відповідним розладом білоксинтезувальної системи.
Включення Rel разом із цисплатином у нанокапсулу (система реній-платина) як при співвідношенні 4 : 1, так і 4 : 2, викликало значне зменшення протромбінового індексу (на 43 %) та зменшення концентрації фібриногену (на 41 %) порівняно з групою TS, при зменшенні росту пухлини на 30-40 %. Ці експерименти свідчать, що при застосуванні наночасток змішаного складу (тобто при перебуванні сполук ренію та цисплатину разом у нанокапсулі) відбувається дезактивація токсичної дії цисплатину. На жаль, разом із цим зменшується і ефективність протипухлинної системи реній-платина, що може бути наслідком хімічних взаємодій всередині наночастки. Проте загальним висновком з експериментів із наночастками, навантаженими Rel та цисплатином різного складу, може бути таке: уведення цієї сполуки сприяє нормалізації системи коагуляційного гемостазу незалежно від антиканцерогенних властивостей та знижує пошкоджувальну дію цисплатину на білоксинтезувальну активність печінки.
Наступним етапом роботи стало з’ясування питання про можливість здійснення згаданої корекції коагуляційного гемостазу сполуками ренію з почвсрним зв’язком і різними лігандами. При уведенні наночасток, навантажених Re2 та розчином цисплатину, спостерігалося значніше гальмування пухлинного росту (на 99 %), ніж для аналогічних груп із Rel, та зниження протромбінового індексу на 4б %, рівня фібриногену - на 51 % порівняно з групою TS (табл.). Порівняння двох сполук при однакових дозах і способах уведення дозволяє зробити висновок про залежність як протипухлинних властивостей кластерних сполук ренію, так і їх здатності до корекції системи гемостазу від структури сполуки (включаючи наявність почверного зв’язку та природу лігандів). Уведення системи Re2-Pt у вигляді змішаних наночасток було менш ефективним як для показників системи згортання крові, так і для виявлення антиканцерогенного ефекту, що підтверджує наш попередній висновок про наявність взаємодій всередині нанокапсули та дезактивацію одного або й двох компонентів системи.
Показники коагуляційного гемостазу при використанні Яв2^ системи
Група Протромбіновий індекс, % Фібриноген, г/л
Control 59,3 і 3,0 1,3 і 0,1
T8 100,0 і 5,0 3,9 і 0,2
Т8 + [Re2] np + cPt 61,7 і 3,1 1,9 і 0,1
Т8 + [Re2 + cPt] np 92,5 і 4,6 3,1 і 0,2
При застосуванні ЛеЗ-Р системи, де використано сполуку ренію з адамантильним лігандом Яе3, при різних способах її уведення спостерігалося як зменшення маси пухлини (на 90-98 %) порівняно з контролем, так і зниження протромбінового індексу (на 40 %), рівня фібриногену (на 69 %) порівняно з групою щурів-пухлиноносіїв (рис. 3, 4). Яе3 -сполука, яка проявляє значний гепатостабілізувальний ефект не тільки у моделі канцерогенезу, а й у моделі токсичного гепатиту [7; 9], що може пояснити ефекти нормалізації системи гемостазу, оскільки переважна більшість білкових факторів гемостазу синтезується в печінці.
&
120
100
80
60
40
20
control T8 T8 + [Re3] T8 + [Re3 T8 + [Re3] nl + cPt + cPt] nl sl+ cPt (4:2)
Групи
Рис. 3. Значення протромбінового індексу у крові щурів із карциномою Герена при введенні сполук ренію та системи реній-платина (Яг3) у різних формах: див. рис. 1
о
к
и
р
ю
(Я
'я
р
ё
о
Я
к
о
control
T8
T8 + [Re3] nl + cPt
T8 + [Re3 + cPt] nl (4:2)
T8 + [Re3]
sl+ cPt
Групи
Рис. 4. Концентрація фібриногену у крові щурів із карциномою Герена при уведенні сполук ренію та системи реній-платина (Яг3) у різних формах: див. рис. 1
0
Також вимірювали рівень ТБК-активних продуктів (рис. 5). Як відомо, при канцерогенезі спостерігається окисний стрес.
Групи
Рис. 5. Показники ТБК-активних продуктів і протромбінового індексу у крові щурів із карциномою Герена при уведенні сполук ренію та системи реній-платина із різними лігандами та у різних формах: див. матеріал і методи досліджень, * - вірогідна різниця порівняно з групою Control,р < 0,05, ** - вірогідна різниця порівняно з групою Т8,р < 0,05
У групі щурів-пухлиноносіїв відбувається збільшення інтенсивності перикисно-го окиснення ліпідів (збільшення ТБК-активних продуктів) на 67 % порівняно з контролем, що негативно впливає на метаболітичні процеси в організмі та сприяє руйнуванню клітин. При застосуванні системи реній-платина інтенсивність окиснення ліпідів зменшується на 40-48 % порівняно з тваринами-пухлиноносіями.
Висновки
1. Розвиток пухлини спричинює підвищення функціональної активності системи згортання крові. Застосування твердих наночасток і наноліпосом, навантажених сполуками ренію, зумовлює нормалізацію системи коагуляційного гемостазу незалежно від ефективності гальмування новоутворення.
2. При застосуванні наночасток змішаного складу (при перебуванні сполук ренію та цисплатину разом у нанокапсулі) відбувається дезактивація токсичної дії цис-платину на систему згортання крові. Разом із цим зменшується також ефективність протипухлинної системи реній-платина. Це може бути наслідком хімічних взаємодій всередині наночастки, що потребує додаткових досліджень у напрямку вдосконалення структури змішаних наночасток.
3. При різних способах уведення системи сполуки ренію з адамантильним лігандом спостерігалися значний протипухлинний ефект і стабілізувальна дія на систему коагуляційного гемостазу крові щурів-пухлиноносіїв, що вірогідно пов’язано з гепатостабілізувальною активністю цієї сполуки.
Бібліографічні посилання
1. Аяпбергенова Г. О. Профилактика тромбоэмболических осложнений у больных раком легких // Сибирский онкологический журнал. - 2009. - Прил. № 1. - С. 22-23.
2. Баркаган З. С. Основы диагностики нарушений гемостаза / З. С. Баркаган, А. П. Момот. -
М. : Ньюдиамед-АО, 1999. - 224 с.
3. Гладилин Г. П. Изменение показателей сосудисто-тромбоцитарного механизма гемостаза в зависимости от стадии рака молочной железы / Г. П. Гладилин, И. Л. Иваненко // Успехи современного естествознания. - 2009. - № 7 - С. 50-51.
4. Єгорова Д. Е. Взаємодія біядерних кластерів ренію (III) з фосфоліпідами та вищими карбоновими кислотами за формування мікрокапсул. Автореф. дис. ... канд. хім. наук: 02.00.01 - неорганічна хімія. - Держ. хім.-тех. ун-т. - Д., 2010. - 18 с.
5. Пантелеев М. А. Фундаментальные исследования и клиническая практика / М. А. Пантелеев, Ф. И. Атауллаханов // Клиническая онкогематология. - 2008. - Т. 1, № 1. - С. 50-б2.
6. Патологическая физиология / Н. Н. Зайко, Ю. В. Быць, А. В. Атаман и др. - К. : Логос, 199б. - 327 с.
7. Стан печінки щурів при розвитку карциноми Герена та гальмування її росту сполуками ренію / В. В. Івчук, Т. М. Політико. О. О. Сорочан, Н. І. Штеменко // Медична хімія. - 2009. - Т. 11, № 3. - С. б0-б4.
8. Ткаченко Б. И. Нормальная физиология человека. - 2-е изд. - М. : Медицина, 2005.
9. Цитостабілізуючі властивості кластерних сполук ренію як інгібіторів перекисного окиснення ліпідів у процесі зберігання клітин / В. В. Івчук, Д. В. Черкашина, О. Ю. Петренко та ін. // Вісник проблем біології і медицини. - 2009. - Вип. 3. - С. 23-29.
10. Golichenko A. A. Cluster rhenium (III) complexes with adamantanecarboxylic acids: Synthesis and properties / A. A. Golichenko, A. V. Shtemenko // Russian Journal of Coordination Chemistry. -200б. - Vol. 32. - P. 242-249.
11. Jung Y. Direct cellular responses to platinum-induced DNA damage / Y. Jung, S. J. Lippard // Chem. Rev. - 2007. - Vol. 107. - P. 1387-1407.
12. Medina C. Nanoparticles: Pharmacological and toxicological significance / C. Medina, M. J. Santos-Martinez, A. Radomski // British Journal of Pharmacology. - 2007. - Vol. 150. - P. 552-558.
13. Shtemenko A. V. Formation of binuclear halogenecaTboxylates of rhenium with quadruple metal-tometal bonds / A. V. Shtemenko, A. S. Kotel’nikova // Isvestiya Acadamy of Sciences of USSR, Chemistry. - 1980. - Vol. 11. - P. 2б30-2б31.
14. Shtemenko N. Liposomal forms of rhenium cluster compounds: Enhancement of biological activity / N. I. Shtemenko, E. D. Zhabitskaya, O. V. Beresenina // Chemistry & Biodiversity. - 2008. -Vol. 5. - P. 1б00-1бб7.
15. Synteses, characterization, in vivo antitumor properties of the cluster rhenium compound with GABA ligands and its synergism with cisplatin / A. V. Shtemenko, P. Collery, N. I. Shtemenko et al. // Dalton Trans. - 2009. - P. 5132-513б.
16. Zutphen S. van Targeting platinum anti-tumour drugs: Overview of strategies employed to reduce systemic toxicity / S. van Zutphen, J. Reedijk // Coord. Chem. Rev. - 2005. - Vol. 249. - P. 2845-2853.
Надійшла до редколегії 14.07.2011
