CC BY
25
96
УДК 615.451.032:611.13/.16
Jiang Xiaoling, Zhang Liang, Xu Zhuoyu, Guo Chenghao
EFFECT OF KANGLAITE INJECTION ON ANGIOGENESIS
Medical college of Qing Dao University, China
ABSTRACT
Objective: To evaluate the effect of Kanglaite injection (KLT) on angiogensis. Method: The rings of rat aorta were embedded in collagen gel and cultured in a 1:1 mixture of DMEM with HAM FI2, a serum-free medium for 28 days. The twenty four cultures were divided into three groups: Group A: control group; Group B: O.lmg/ml VitE was added; Group C: 10|il/ml KLT was added. Curves of micro vascular growth were generated by counting daily the number of newly formed microvessels with an inverted microscope. Results: Both lOpl/ml KLT and
0,lmg/ml VitE had significant inhibiting effect on angiogenesis (P<0,01), furthermore, lOftl/ml KLT had a more intensive inhibiting effect than 0,1 mg/ml VitE (P<0,01). Conclusion: KLT has a significant inhibiting effect on angiogenesis. It’s an important mechanism by which KLT inhibits tumors.
Key words: Kanglaite injection, angiogenesis, neo-angiogenesis
Янг Ксаолинг, Джанг Лянг, Key Джу ою, Гио Ченгао
ВЛИЯНИЕ КАНГЛАЙТА ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ НА АНГИОГЕНЕЗ
Медицинский колледж университета Квинг Дао, Китайская Народная Республика
РЕЗЮМЕ
Данная работа посвящена изучению влияния препарата Канглайт для инъекций (КЛТ) на ангиогенез. Нарезанные кольца крысиной аорты помещали в коллагеновый гель. Кольца культивировали в течение 28 дней в смеси 1:1 среды DMEM и бессывороточной среды НАМ F12. Разделили 24 культуры на 3 группы: группа А - контрольная, в культуру группы В добавили ОД мг/мл витамина Е, а группы С -10 мкл/мл КЛТ. Кривые роста микрососудов строили путем ежедневного подсчета в инвертированном микроскопе количества вновь образованных микрососудов. Обнаружили, что как КЛТ в дозе 10 мкл/мл, так и витамин Е в концентрации 0,1 мкг/мл ингибировали ангиогенез (Р<0,01). Эффект КЛТ был более выражен по сравнению с витамином Е. Следовательно, механизмом действия КЛТ является угнетение неоангиогенеза в опухоли.
Ключевые слова: Канглайт для инъекций, ангиогенез, неоангиогенез
ВВЕДЕНИЕ
Исследования противоопухолевого действия препаратов постепенно перемещались от киллерно-го механизма (главного в химиотерапии) к ингиби-ции ангиогенеза в опухоли. К настоящему времени выделены и очищены многие ангиогенез-ингибиру-ющие факторы, но до сих пор эти препараты не доступны для клинического применения. Противоопухолевый препарат КЛТ может повышать иммунологические функции организма, ингибировать рост экспериментальных опухолей, но до сих пор не ясна корреляция между КЛТ и ангиогенезом. Цель данного исследования - оценка влияния КЛТ на ангио-
генез, в качестве модели использовали культуру аорты в бессывороточной среде.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Реагенты и инструменты
Канглайт для инъекций (КЛТ) был предоставлен Zhejiang Pharmaceutical Co., Ltd.(серия N9808191-2); среды DMEM, HAMF-12 Nutrient Mixture произведены Gibco; витамин E получен от Shanghai 2nd Reagent Co.
Инвертированный микроскоп произведен OLYMPUS; 250-мл культуральные флаконы продук-
ции Greiner Labortechnik; низкотемпературная высокоскоростная центрифуга - продукция SIGMA ЗКЗОВ.
Культура тканей
Из колец торакальной или абдоминальной аорты здоровых самцов крыс 2 - 3-недельного возраста делали аортальные кольца размером 1 мм. Раствор коллагена готовили по модифицированному методу Elsdar и Bard, смешивая 7:2:1 растворы коллагена, 11,7 мг/ил NaHC03 и 10-кратной среды DMEM [1]. 4 капли раствора капали на дно агарозного бассейна (с внутренним и внешним диаметром 10 и 17 мм соответственно) и клали кольца аорты в бассейн, который после мицеллизации полностью заполняли смешанным раствором. Когда раствор полностью коагулировал, добавляли культуральную среду (200 мкг/ мл гентамицина) и культивировали при 35,5° С. Культуральную среду меняли через день.
Классификация экспериментальных групп
Группа А - контрольная группа; Группа В - 0,1 мг/мл витамина Е; Группа С - 10 мкл/мл KJIT.
Оценка ангиогенеза
Количество вновь образованных сосудов подсчитывали ежедневно и строили кривую микроваскуляр-ного роста. В некоторых культуральных флаконах наблюдались наброски рисунка кольца аорты. Стандарт подсчета образованных микрососудов под инвертированным микроскопом был следующим:
1). специфическое появление микрососудистой почки (большое утолщение, однообразное сцепление и продолжающийся экстенсивный рост), отличающееся от фибробластов;
2). одна микрососудистая почка с бифуркацией, продуцирующей 2 новые почки, из которых образуются 2 новых микрососуда;
3). образование сосудистых петель из 2 почек, которые формируются с помощью анастомозов между 2 микрососудами.
Таблица 1
Образование микрососудов в контрольной группе (группа А)
Дни 1 2 3 4 5 6 7
Количество вновь образованных микрососудов 0±0 0±0 0,63±0,74 2,13 ±2,47 2,63±1,85 3,13±2,17 3±1,85
Дни 8 9 10 11 12 13 14
Количество вновь образованных микрососудов 2,63±1,60 3,13±3,00 1,75±1,16 2,88±2,75 4,5±4,24 6,5±5,37 9,63±6,41
Дни 15 16 17 18 19 20 21
Количество вновь образованных микрососудов 9,38±6,00 9,5±5,90 9,25±5,63 7,38±3,70 7,63±5,93 9,25±6,14 8,5±5,40
Дни 22 23 24 25 26 27 28
Количество вновь образованных микрососудов 7,25±4,40 6,25±4,80 5±3,82 5,13±3,60 4,63±3,70 4,25±3,11 4,13 ±3,40
Статистический анализ был выполнен с помощью программного обеспечения вРЗБ и теста Б^еп^Мечутап-КеиЬ.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Характеристика ангиогенеза
Характеристиками генеза микрососудов в среде ОМЕМ/НАМ Б12 были: фаза задержки - фаза роста - фаза затухания. Солитарные эндотелиальные почки начинали расти на концах срезов и коллате-ралях кольца аорты после культивирования в течение 48 ч. Рост микрососудов отмечался к концу первой недели, продолжался в течение 2 нед, затем быстро снижался (табл. 1, рис. 1).
Влияние витамина Е на ангиогенез На рис. 2 изображена кривая роста микрососу-
Среднее количество ежедневно вновь образованных микрососудов
1 5 9 13 17 21 25 День
Рис.1. Кривая роста микрососудов в контрольной группе (группа А)
Среденее количество ежедневно вновь образованных сосудов в группе В
13 17 21 25 День
Рис.2. Кривая роста микрососудов в группе В при обработке культуры аорты витамином Е в концентрации 0,1 мкг/мл
дов после обработки культуры аорты витамином Е в концентрации 0,1 мкг/мл. В этой группе количество вновь образованных сосудов было меньшим по сравнению с контрольной группой (табл. 2), а кривая роста сосудов - ниже и статистически значимо отличалась от контрольной группы (Р<0,01).
Влияние КЛТ на ангиогенез
В группе С, где кольца аорты росли в присутствии КЛТ в концентрации 10 мкл/мл, было образовано только несколько микрососудов в течение первых дней, а к концу первой недели быстро наступила фаза затухания (рис. 3, табл. 3). Ингибиция образования микрососудов в группе С значительно отличалась по сравнению с группами А и В (С по сравнению с В -Р<0,01; С по сравнению с В - Р<0,01). На рис. 4 одновременно представлены кривые образования микрососудов в контрольной группе А, при культивировании колец аорты в присутствии витамин Е (В) и при культивировании в присутствии КЛТ. Из рисунка видно, что КЛТ угнетает образование новых сосудов в культуре колец аорты.
ОБСУЖДЕНИЕ
Бессывороточный трехмерный коллагеновый гель для культивирования колец крысиной аорты -идеальная модель, при которой отсутствуют ограничивающие, инактивирующие или стимулирующие сывороточные факторы. При этом прогрессивном методе исследования неоангиогенеза достигается высокая степень чувствительности и надежности. Изучая влияние КЛТ на ангиогенез, мы взяли две группы сравнения - негативный контроль (группа А) и позитивный (группа С). Позитивным контролем служил витамин Е в концентрации 0,1 мг/мл. Витамин Е может ингибировать активную пролиферацию опухолевых клеток путем удаления свободных радикалов кислорода, восстановления иммунной функции организма и блокировки химического канцерогенеза. В 1996 г. Shklar G. и Schwartz J.L. [5] продемонстрировали на животной модели, что витамин Е эффективно ингибирует индукцию опухолей диметилбензантраценом (ДМБА). Размер опухолей был существенно меньше по сравнению с контрольной группой. Рост эндотелиальных клеток и экспрессия TGF-альфа были ингибированы. Авторами было показано, что действие витамина Е, ингибирующего рост опухоли, коррелировало с влиянием на ангиогенез. В предварительных результатах мы обнаружили, что витамин Е в дозах 0,2 мг/мл и 0,1 мг/мл оказывал ингибирующее действие на ангиогенез. Количество вновь образованных сосудов было уменьшено, поэтому в качестве контроля в этом исследовании мы использовали концентрацию витамина Е 0,1 мг/мл.
КЛТ взяли в дозе 10 мкл/мл, оказывающей максимальный ингибирующий эффект [6]. Результаты показали, что после обработки колец аорты 10 мкл/мл КЛТ вновь образованные сосуды были редкими, а фаза угнетения была быстрая (рис.З и 4). Ингибирующее действие КЛТ на ангиогенез было более эффективным, нежели влияние 0,1 мг/мл витамина Е (Р<0,01). Следоватльно, противоопухолевое дей-
Образование микрососудов в кольцах аорты, обработанных витамином Е
Таблица 2
Дни 1 2 3 4 5 6 7
Количество вновь образованных микрососудов 0±0 0±0 0,63±0,52 1,48±1,06 2,25±1,16 2,5±0,76 3,5±1,69
Дни 8 9 10 11 12 13 14
Количество вновь образованных микрососудов 2,63±1,60 2,38±1,30 2,75±1,91 2+1,41 2,38+1,19 3,63±1,85 5±2,33
Дни 15 16 17 18 19 20 21
Количество вновь образованных микрососудов 4,63+2,56 5,88±2,53 7,25±2,76 5,55±2,67 5,25±2,82 5,25±2,05 4,13±2,03
Дни 22 23 24 25 26 27 28
Количество вновь образованных микрососудов 4,25±1,83 4,13±2,30 3,63±1,41 3,13±1,73 3,13±1,73 2,38±1,06 2,38±1,06
Среднее количество ежедневно вновь образованных микрососудов в группе С
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27
День
Рис. 3. Кривая образования микрососудов в культуре колец аорты в присутствии КЛТ в концентрации 10 мкл/мл
ствие КЛТ может быть обусловлено ингибицией ангиогенеза, но этот механизм до конца не ясен.
КЛТ - препарат второго класса согласно китайской классификации препаратов растительного происхождения, приготовленный по современной технологии из семян злакового растения Коикса (Semen Coicis), используемых в традиционной китайской медицине. Этот препарат обладает широким спектром противоопухолевого действия: прямым киллингом опухолевых клеток, усилением иммунологических функций, энергетической поддержкой организма, устранением побочного действия химиопрепаратов и радиотерапии и повышением каче-
ства жизни [4]. Это исследование - первое, предпринятое с целью изучения влияния КЛТ на ангиогенез, объясняющее важную роль КЛТ в лечении опухолей. Механизм, который лежит в основе киллин-гового влияния КЛТ на опухолевые клетки, может быть связан с рядом факторов: ингибицией деления и метастазирования сосудистых и эндотелиальных клеток (изучение влияния обработки КЛТ на клеточный цикл показало, что он задерживает клетки в в2+М фазе и угнетает пропорцию клеток в Б фазе); угнетением освобождения позитивных регулирующих факторов для ангиогенеза опухолевыми клетками; остановкой образования рецепторов или по-
Таблица 3
Влияние КЛТ на образование микрососудов
Дни 1 2 3 4 5 6 7
Количество вновь образованных микрососудов 0+0 0,43+0,53 0,43±0,53 0,86+1,10 0,86+1,10 0,86±1,10 0,71±1,11
Дни 8 9 10 11 12 13 14
Количество вновь образованных микрососудов 0,29±0,49 0,43±0,79 0,29±0,76 0,29±0,76 0,29±0,76 0,29±0,76 0,29±0,76
Дни 15 16 17 18 19 20 21
Количество вновь образованных микрососудов 0,29±0,76 0,29±0,76 0,29±0,49 0,29±0,49 0,14±0,38 0,14±0,38 0±0
Дни 22 23 24 25 26 27 28
Количество вновь образованных микрососудов 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0
Кривые ежедневных средних значений
День
Рис. 4. Кривые образования микрососудов в группах А, В и С:
—•—Control group —О— 0,lmg/inl VitE —±— 1 Oul/ml KLT
зитивных регулирующих факторов для ангиогенеза в форме антител; изменением дифференцировки сосудистых эндотелиальных клеток к образованию интактных капилляров и препятствием образованию анастомозов между вновь образованными сосудами и основным сосудом. Точный механизм, с помощью которого КЛТ оказывает ингибирующие влияние на ангиогенез и киллинг опухоли, остается еще не исследованным.
Ангиогенез - сложный биологический процесс, при котором новые сосуды растут из оригинального почкованием эндотелиальных клеток, регулируемым растворимыми факторами, эндотелием и экстрацеллюлярным матриксом. Рост и метастази-рование опухоли полностью зависит от ангиогенеза. В 1863 г. Р. Вирхов наблюдал острое повышение количества кровяных сосудов в злокачественных опухолях. В 1945 г. О.Н. А^ге предложил концепцию неоваскуляризации опухоли. После формирования солидной опухоли рост ее останавливается в инфильтративной стадии, при которой питание поддерживается главным образом че-
рез активную диффузию. Диаметр такой опухоли обычно менее чем 2-3 мм с количеством клеток менее 107. Если объем опухоли в дальнейшем повышается без образования новых капилляров или малых сосудов, необходимых для обеспечения питания, рост опухоли прекращается и она погибает, а опухолевая ткань дегенерирует. Однако если новые сосуды в опухоли образуются, они растут в 50-200 раз быстрее, чем в нормальной ткани, и поэтому появляются инфильтрирующие или метаста-зирующие опухоли. Неоангиогенез - важный фактор быстрой пролиферации и метастазирования опухоли [2], а ингибиция ангиогенеза является реальным методом терапии злокачественных новообразований. В 1971 г. J. Folkman предложил план, где кровеносные сосуды опухоли являются мишенью при терапии рака. Это направление вызывает всеобщий интерес [3] и с 1998 г. стало главной темой клинических исследований в США.
ВЫВОДЫ
КЛТ активно ингибирует рост опухолей, предохраняет от развития метастазов, усиливает иммунологическую функцию организма, поддерживает организм высоким энергетическим питанием, имеет выраженный ингибирующий эффект на ангиогенез и не создает побочных реакций. Все это подтверждает, что КЛТ - идеальное противоопухолевое средство, которое будет широко использоваться в клинике.
ЛИТЕРАТУРА
1. Elsdale Т., Bard J. Collagen substrate for studies on cell behavior // J. Cell. Biol. - 1972. - Vol. 54. - P. 626-637.
2. Folkman J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors // Ann. Surg. - 1972. - Vol. 175. - P. 409-416.
3. Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? // J. Natl. Cancer Inst. - 1990. -Vol. 82. - P. 4-6.
4. Ran Jianghua, Zhang Jiahua, WangXi. Effect of Kanglaite Injection on the Post operative Immunologic function of Patients with cancers of Large Intestine // China oncology Clinic and Rehabilitation. - 1999. -Vol. 2. - P. 20-22.
5. Shklar G., Schwartz J.L. Vitamin E inhibits experimental carcingenesis and tumor angiogenesis // Eur. J. Cancer B. Oral. - 1996. - Vol. 32Bi(2). - P. 114-119.
6. Wang Junjie, Sun Xinchen, Shen Wenjiang et al. A study on the Apoptosis of Renal cancer cells and P53, bc-2 Expression Induced by Kanglaite Injection // China Oncology Clinic. - 1999. - Vol. 6. - P. 439-442.
