CC BY
15УДК 616-002.828: 57.086.3
влияние изоконазола на ультраструктуру клеток культур staphylococcus
aureus (SA1) и
staphylococcus haemolyticus (SH1)
Степанова А.А. (зав. лаб.)*, Васильева н.В. (директор института, зав. кафедрой), Босак и.А. (с.н.с.), Котрехова Л.П. (врач-дерматолог)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
©Коллектив авторов, 2015
Показаны четкие различия в общем ходе ультраструктурных изменений естественного старения клеток двух видов бактерий в контроле и характера преобразований их тонкого строения под влиянием изоконазола. Это позволяет говорить о наличии специфических тонких механизмов деструктивного характера, вызванных данным антимикотиком. Интактные клетки через 3 часа экспозиции в исследуемых взвесях уже отсутствовали.
Ключевые слова: изоконазол, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, тра-нсмиссионная электронная микроскопия, ультраструктура
THE INFLUENCE OF ISOCONAZOLE ON THE ULTRASTRUCTURE OF CELL CULTURES staphylococcus aureus (SA1) AND staphylococcus haemolyticus (SH1)
Stepanova A.A. (head of the laboratory), Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the chair), Bosak I.A. (senior scientific collaborator), Kotrekhova L.P. (dermatologist)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
©Collective of authors, 2015
The clear differences in the general course of ultrastructural changes of the natural-rate of aging cells of the two species of bacteria in the control and character of their thin structure under the influence of isoconazole. This permit say about the presence of specific fine mechanism of a destructive nature, caused by this antimicotic. Intact cells after 3 hours of exposure in the studied sediment already absent.
Key worda: isoconazole, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, transmission electron microscopy, ultrastructure
введение
В последнее время имеет место тенденция возрастания числа больных с бактериально-грибковыми поражениями кожного покрова, в связи с чем являются актуальными детальные исследования влияния антимикотиков не только на грибы, но и на бактерии. Ранее были проведены исследования по выявлению влияния изоконазола (субстанции кремов Травоген, Травокорт) на культуры микромицетов [1], а также определению бактериостатической и бактерицидной концентраций его в отношении Staphylococcus aureus и Staphylococcus haemolyticus [2]. В ряде работ [Bastide M. et al. // Pathol.
Контактное лицо: Степанова Амалия Аркадьевна, тел.: (812) 303-51-40
Biol. - 1982. - Vol. 30, №6; Moulin-Traffort J. et al. // Pathol. Biol. - 1986. - Vol. 34, №8 и др.] проводили изучение влияния изоконазола на ультраструктуру клеток культур Candida albicans. Представляло интерес выявить ультраструктурные аспекты влияния бактерицидной концентрации изоконазола на клетки культур этих видов бактерий.
материал и методы
Состав исследуемых объектов: образец №1 - изоконазол (субстанция № 80166010).
Тест-культуры микроорганизмов, выделенные от пациентов с бактериально-гриб-ковой инфекцией кожи:
Staphylococcus aureus 1-изолят (SA1)
Staphylococcus haemolyticus 1-изолят (SH1)
Выделение культур микроорганизмов-патогенов осуществляли с кожи больных, страдавших от бактериально-грибковой инфекции и находившихся в микологической клинике НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина на лечении в период с 4.05 по 11.05.2011 г. Культуры бактерий изолировали после посева биоматериала (кожные чешуйки, отделяемое эрозий, пустул) на кровяной агар. Видовую идентификацию Staphylococcus spp. проводили по результатам культурального исследования - посевов на кровяной и желточно-солевой агары, микроскопии мазков, окрашенных по Грамму, а также при помощи тест-системы Staph Plus® (BioMerieux) .
Культуры бактерий пересевали в столбики полужидкого питательного агара и сохраняли в рефрижераторе при +4 °С в течение трех суток. В качестве растворителя для изоконазола использовали неразведенный диметилсульфоксид (ДМСО).
Определение чувствительности проводили методом серийных разведений в жидкой питательной среде согласно методическим указаниям «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» МУК 4.2.1890-04. Титрование выполняли методом последовательных двукратных разведений, начиная с максимальной концентрации 100 мкг/мл до минимальной - 0,195 мкг/мл. Взвеси Staphylococcus spp. готовили из суточной культуры, выращенной при 37 °С на мясо-пептонном агаре в пробирках, затем клеточную массу снимали микробиологической петлей с поверхности агара, помещали в стерильную пробирку, постепенно добавляя 0,85% раствор натрия хлорида до густоты рабочих взвесей 1 ЕД по стандарту мутности Мак-Фарланда. Количество вносимой рабочей взвеси в каждую пробирку ряда составляло 0,1 мл (3107) .
В каждом опыте ставили 3 контроля:
№ 1 культуры (1 мл питательной среды + 0,1 мл рабочей взвеси тест-культуры);
№ 2 питательной среды (1 мл среды без культуры и без исследуемого препарата);
№ 3 контроль препарата (0,9 мл питательной среды + 0,1 мл исходного разведения препарата).
Все ряды подготовленных разведений с тест-культурами и контрольные выдерживали при 37 °С в течение суток. Минимальной бактериостатической концентрацией исследуемого препарата считали разведение в последней пробирке, где визуально отсутствовал рост микроорганизма.
Для определения бактерицидного действия исследуемого препарата делали высев штрихами микробиологической петлей на секторы среды мясо-пептонный агар в чашках Петри из каждой пробирки, в которой визуально отсутствовал рост тест-культуры, а также из контрольной пробирки №1. Чашки с высевами ставили в термостат при 37 °С на срок до
•■к
появления роста колонии в контрольном секторе, после чего учитывали рост культуры во всех секторах.
Взвеси тест-культур в жидкой среде Мюллер-Хинтона концентрацией клеток 2 ЕД по стандарту мутности Мак-Фарланда без изоконазола (контроль) и с его добавлением в бактерицидной концентрации (6,3 мкг/мл - для S. aureus и 3,1 мкг/мл - для S. haemolyticus) фиксировали через 30 минут, 1, 2 и 3 часа от начала эксперимента для целей трансмиссионной электронной микроскопии в 3% растворе глутарового альдегида, приготовленном на какодилатном буфере (pH 7,2). Затем образцы промывали от фиксатора какодилатным буфером, фиксировали 1 час в 1% растворе осмиевой кислоты, обезвоживали в серии спиртов (30%, 50%, 70%, 80%, 90% и 100%) и ацетоне с последующей заливкой в смесь эпоксидных смол эпон-аралдит. Полимеризацию блоков проводили 3 суток в термостате при 60°, а затем затачивали на пирамитоме 11800 LKB. Ультратонкие срезы окрашивали 5 минут уранилацетатом и 10 минут - свинцом азотнокислым, а затем исследовали в трансмиссионном электронном микроскопе Jem-100SX (Япония).
результаты и их обсуждение
Результаты изучения антибактериальной активности изоконазола приведены в таблице 1.
Таблица 1
In vitro активность изоконазола в отношении тест-культур бактерий - изолятов из пат. материала
Тест-культура Минимальная бактериостатическая и бактерицидная концентрации, мкг/мл
бактериостатическая бактерицидная
Staphylococcus aureus (SA1) -3,1 6,3
Staphylococcus haemolyticus (SH1) 1,6 3,1
Ультраструктура интактных клеток S. aureus (SA1) и S. haemolyticus (SH1) в жидкой среде без добавления изоконазола (контроль). Компонентами ультраструктуры интактных клеток изученных видов бактерий были: нуклеоид (ядерное вещество), цитозоль, плазмалемма и клеточная стенка (Рис. 1 а, 2 а). Для завершивших деление клеток бактерий была характерна поперечная трехслойная (со светлым центральным и темными латеральными слоями) перегородка (Рис. 1 а, 2 а). Нуклеоид довольно плотный, неправильной формы, тонко-фибриллярной структуры, занимал большую и центральную часть клетки. Цитозоль умеренной электронной плотности, богат свободными рибосомами. Плазмалемма трехслойная асимметричная плотно прилегала к однослойной, довольно тонкой, плотной, гомогенной клеточной стенке. Интактные клетки изученных видов бактерий различались между собой по толщине клеточных стенок. Так, у S. aureus они были тоньше (в среднем, 0,2 мкм) в сравнении с таковыми S. haemolyticus (в среднем, 0,4 мкм), что прямо коррелировало со значениями средних размеров интактных клеток этих видов бактерий (более мелкие у первого вида и более крупные у второго).
Рис. 1. Особенности ультраструктуры клеток S. aureus в жидкой среде Мюллер-Хинтона: a-г - контроль (без добавления изоконазола); эксперимент (д-м) через 30 минут (д-ж), 1 час (з-к) и 2 часа (л, м) после начала эксперимента. f д-з - показывает разрыв в клеточной стенке. Условные обозначения здесь и на рис. 2-5. КС - клеточная стенка; Ну - нуклеоид; П - периплазматическое пространство; Пл - плазмалемма; ПП - поперечная перегородка;
Р - рибосома; Цз - цитозоль. Ув.: х 70000 Ультраструктура стареющих клеток S. aureus (SA1) в контроле, а также в эксперименте с добавлением бактерицидной концентрации изоконазола. Ультраструктурные аспекты старения клеток бактерий в условиях контроля. Естественное старение клеток бактерий начиналось с неравномерного просветления нуклеоида и цитозоля (Рис. 1 б). Деструктивные изменения клеточной стенки и содержимого бактерий происходили одновременно и заключались в следующем. Клеточная стенка становилась умеренной электронной плотности, равномерно утоньшалась (Рис. 1 в) и, в конечном итоге постепенно лизи-ровала, обнажая разрушающееся содержимое клетки (Рис. 1 г). Плазмалемма приобретала неровный контур и отходила от клеточной стенки (Рис. 1 в), что приводило к формированию светлого и неравномерного по толщине периплазма-тического пространства. Цитозоль исчезал, в содержимом клетки выявляли варьирующие по размерам и электронной плотности сгустки неправильной формы и обрывки мембран, как правило, приуроченные к плазмалемме (Рис. 1 в). Позже последняя распадалась на фрагменты и лизировала. На заключительном этапе старения клетки бактерий этого вида имели вид «теней» (Рис. 1 г), в которых можно было различить контур сильно извилистой, рыхлой и слабо контрастной клеточной стенки, а также наблюдать отсутствие плазмалем-мы и присутствие в содержимом некогда живой клетки бесформенные скопления разных размеров и формы.
Отметим, что частота встречаемости интактных клеток изученных видов бактерий и находящихся в состоянии естественного старения была сходной во всех изученных вариантах контроля (табл. 2).
Таблица 2
частота встречаемости (%) интактных, стареющих и разрушающихся под действием изоконазола клеток изученных видов бактерий
_контроль 30 минут, 1час, 2 часа, 3 часа_
50%
интактные клетки
50%
стареющие клетки
экспозиция 30 минут
40»% 30% 30%
экспозиция 1 час
10% 20% 60%
экспозиция 2 часа
10% 10% 80%
экспозиция 3 часа
- - -
интактные клетки стареющие клетки разрушающиеся клетки
Экспозиция 30 минут, 1, 2 и 3 часа от начала эксперимента. Характер деструктивных изменений ультраструктуры клеток бактерий практически при всех экспозициях эксперимента был сходным; с увеличением времени экспозиции отмечали лишь постепенное снижение числа интактных клеток и увеличение частоты встречаемости разрушающихся бактерий (табл. 2). Исключение составлял лишь 3-х часовой срок экспозиции, при котором интактные клетки уже отсутствовали, как и отсутствовали их высевы на питательную среду. В связи с вышесказанным, приведенное ниже описание ультраструктурных изменений бактериальных клеток может быть отнесено ко всем срокам экспозиции.
Первые изменения под влиянием изоконазола происходили в строении клеточной стенки бактерий, которая претерпевала локальные разрывы (Рис. 1 д, стрелка). Формированию разрывов предшествовало локальное снижение электронной плотности клеточной стенки. Замечено, что в бактериях, находящихся на той или иной стадии деления (с формирующимися), или сразу после его завершения (с уже сформированными поперечными перегородками), разрыв клеточной стенки происходил именно в зоне контакта их с поперечными перегородками (Рис. 1 е, ж, стрелки). После разрыва клеточной стенки вблизи поперечных перегородок происходил лизис их среднего светлого слоя (Рис. 1 ж, стрелка), а затем - и темных латеральных ее слоев, что приводило к значительному оголению протопласта молодых клеток бактерий и дальнейшему развитию деструктивных процессов в них. В бактериях, лишенных поперечных перегородок, разрывы клеточной стенки могли быть одиночными (Рис. 1 д) либо множественными (Рис. 1 з, стрелки). Наблюдали картины уплотнения цитозоля (Рис. 1 и, 1 к, стрелка) разного объема, происходящие параллельно с формированием светлых локальных расширений периплазматического пространства (Рис. 1 и, стрелка), а также асимметричного «разрыхления» верхнего слоя клеточной стенки (Рис. 1 и).
Описанные деструктивные изменения в строении клеточной стенки бактерий усиливали влияние изоконазола на содержимое клетки. При этом заметно снижалась электронная плотность нуклеоида (Рис. 1 е, ж). В цитозоле клеток формировались локальные просветления (Рис. 1 ж). Со временем цитозоль полностью исчезал, и в содержимом клетки можно было наблюдать сгустки разной электронной плотности и конфигурации, часто приуроченные к плазмалемме (Рис. 1 л), которая приобретала сильно извилистые очертания и разрывалась, что приводило к выходу содержимого клетки наружу (Рис. 1 к). Вблизи разрушающихся и разрушенных клеток бактерий часто отмечали обрывки темных клеточных стенок разной протяженности (Рис. 1 м).
Ультраструктура стареющих клеток S. haemolyticus (SH1) в контроле, а также в эксперименте с добавлением бактерицидной концентрации изоконазола. Ультраструктурные аспекты старения клеток бактерий в условиях контроля. Процессы естественного старения клеток бактерий в условиях контроля протекали аналогично описанным для S. aureus. Вначале наблюдали просветление нуклеоида (Рис. 2 б, стрелка) и одновременно - постепенное довольно равномерное утоньшение клеточной стенки по всему периметру клетки (Рис. 2 в, стрелка).
Лу
Рис. 2. Особенности ультраструктуры клеток S. haemolyticus в жидкой среде Мюллер-Хинтона: a-e - контроль (без добавления изоконазола); ж-м - эксперимент через 30 минут (ж), 1 час (з, и) и 2 часа (к-м) после начала эксперимента, f б - нуклеоид; f в -утоньшение клеточной стенки; f г - фрагменты плазмалеммы; f ж (клетка сверху и слева), и - разрывы в клеточной стенке; f ж (клетка слева и снизу) - уплотнение цитозоля; f з - просветление цитозоля.
Ув.: х 70000
Цитозоль полностью исчезал (Рис. 2 г, д), плазмалемма распадалась на фрагменты, которые формировали везикулярные элементы разнообразной морфологии (Рис. 2 г, стрелки). Со временем последние также полностью лизиро-вали. В некоторых клетках распад плазмалеммы совпадал с локальным лизисом клеточной стенки, которая в этот момент отличалась низкой электронной плотностью, неравномерной толщиной и неровным контуром (Рис. 2 д). После практически полного разрушения клеточной стенки от некогда живой клетки оставались только бесформенные и аморфные остатки (Рис. 2 е).
Экспозиция 30 минут, 1, 2 и 3 часа от начала эксперимента. Последовательность, характер ультраструктурных изменений и временные рамки проявления деструктивных процессов (табл. 2) были аналогичны с ранее выявленными для клеток бактерий S. aureus.
В клеточной стенке бактерий формировались одиночные (Рис. 2 з) или множественные (Рис. 2 ж) локальные разры-
вы. В делящихся и только что завершивших деление клетках бактерий, снабженных поперечными перегородками, разрыв клеточной стенки так же, как и S. aureus, происходил в зоне контакта их с латеральными клеточными стенками (Рис. 2 и, стрелки). Затем отмечали лизис среднего слоя последней, а позже и темных ее слоев (Рис. 2 з), что давало возможность изоконазолу вступать в контакт непосредственно с плазма-леммой. Часто отмечали картины уплотнения цитозоля бактерий (Рис. 2 ж, стрелка) разного объема и асимметричного «разрыхления» верхнего слоя клеточной стенки (Рис. 2 ж, клетка внизу и справа электроннограммы).
Нуклеоид просветлялся (Рис. 2 и), в цитозоле клетки также формировались локальные просветления (Рис. 2 з, стрелки) и сгустки разной электронной плотности и формы, обычно приуроченные к плазмалемме. Со временем цито-золь полностью исчезал (Рис. 2), однако в содержимом клетки долго сохранялись вышеописанные включения. Плазма-лемма клетки становилась сильно извилистой, при этом она сохраняла трехслойное строение; со временем она сильно утоньшалась - до полного лизиса, что приводило к выходу из нее содержимого клетки. Довольно часто на срезах отмечали обрывки клеточных стенок (Рис. 2 м) и бесформенные аморфные «тени» от некогда живых клеток.
В проведенных исследованиях показано, что характер ультраструктурных изменений в клетках изученных двух видов бактерий при естественном старении (контроль) и под влиянием бактерицидной концентрации изоконазола был разным: при естественном старении клеток двух видов бактерий (жидкая среда без изоконазола, контроль) изменения в тонком строении клеточных стенок, нуклеоида и цитозоля происходили одновременно; плазмалемма исчезала из клеток последней. Общий ход естественного процесса старения схематически можно представить следующим образом (Рис. 3 а-е).
ности клеточной стенки и были причиной ее механического разрыва в данных зонах. Отметим, что фунгицидные концентрации изоконазола были причиной разрыва клеточной стенки и клеток культур Candida albicans [Bastide M. et al. // Pathol. Biol. - 1982. - Vol. 30, №6; Moulin-Traffort J., ^ al. // Pathol. Biol. - 1986. - Vol. 34, №8]. Общеизвестно, что ригидная клеточная стенка бактерий является не только механическим каркасом клетки, придающим ей определенные размеры и форму, но и структурой, предохраняющей ее от неблагоприятных внешних воздействий. Она также участвует в обмене веществ клетки с окружающей средой. Возникшая в итоге доступность плазмалеммы для изоконазола приводила к серии деструктивных процессов, в первую очередь, затрагивающих нуклеоид клетки (просветление до полного лизиса), что нарушало общий ход жизнедеятельности бактериальной клетки и сопровождалось лизисом цитозоля, а, следовательно, и свободных рибосом. Далее происходило образование бесформенных сгустков, разрушение плазмалеммы, что приводило к гибели клеток. Часто выявляемые картины разрушения клеточной стенки вблизи формирующихся или сформированных поперечных септ в клетках бактерий уже через 30 минут от начала эксперимента являются показателями того, что изоконазол, прежде всего, ингибировал рост и развитие делящихся и молодых клеток, тем самым нанося «удар по будущему популяции бактерий». Объяснение тому, почему основной удар изоконазола приходится именно в эти зоны следующее: общеизвестно, что в ходе деления бактериальной клетки (Рис. 4) происходит образование не только поперечных септ, но и клеточной стенки. Таким образом, в образовавшихся сразу после завершения этого процесса молодых клетках 50% стенок (включая поперечные септы) будут еще некоторое время «ювенильными», а, следовательно, и более уязвимыми для изоконазола.
Рис. 3. Схема, иллюстрирующая ультраструктуру стареющих
клеток S. aureus и S. haemolyticus (контроль) В результате проведенных исследований установлено, что характер ультраструктурных изменений при бактерицидной концентрации изоконазола был идентичен в разные сроки инкубации (за исключением 3-х часов) и протекал по одному сценарию в клетках двух видов бактерий. Как видно из приведенных данных, изоконазол уже через 30 минут от начала эксперимента вызывал одиночные или множественные разрывы клеточной стенки у клеток двух изученных видов бактерий, что оголяло плазмалемму и давало толчок к дальнейшему развитию деструктивных процессов. Разрыву клеточной стенки предшествовало ее локальное просветление, связанное с лизисом структурных компонентов клеточной стенки (микрофибрилл). Возникшие в итоге различия в плот-
m
Рис. 4. Схема, иллюстрирующая локализацию поперечной перегородки и вновь образованной части клеточной стенки (показана черным) в ходе деления бактериальной клетки Схематически деструктивные изменения в ультраструктуре клеток двух изученных видов бактерий под влиянием изоконазола можно представить следующим образом (Рис. 5).
Рис. 5. Схема, иллюстрирующая влияние изоконазола на ультраструктуру клеток бактерий S. aureus и S. haemolyticus. КС -
клеточная стенка; Ну - нуклеоид; Р - рибосома; Ц - цито-золь. | г - разрывы в клеточной стенке; | е - разрывы в плазмалемме.
Сравнительным анализом общего хода ультраструктурных изменений естественного старения клеток двух видов бактерий в контроле и характера преобразований их тонкого строения под влиянием изоконазола показаны четкие различия между ними, что позволяет говорить о наличии специфических тонких механизмов деструктивного характера, вызванных данным антимикотиком; уже через 3 часа экспозиции в исследуемых взвесях интактные клетки отсутствовали.
выводы
1. Выявлено, что характер ультраструктурных изменений в клетках изученных двух видов бактерий при естественном старении (контроль) и под влиянием бактерицидной концентрации антимикотика изоконазола был разным.
2. Показано, что при естественном старении клеток двух видов бактерий (жидкая среда без изоконазола, контроль) изменения в тонком строении клеточных стенок, нуклеоида и цитозоля происходили одновременно; плазмалемма исчезала из клеток последней.
3. В образцах уже через 30 минут экспозиции в присутствии изоконазола 30% из общего числа изученных клеток имели ультраструктуру, не типичную для стареющих клеток.
4. Общий ход деструктивных изменений в тонком строении клеток двух видов бактерий под действием бактерицидной концентрации изоконазола имел следующую направленность:
клеточная стенка ^ нуклеоид ^ цитозоль ^ плазмалемма
5. Установлено, что, независимо от видовой принадлежности бактерий, в экспериментах с применением бактерицидной концентрации изоконазола первые ультраструктурные изменения обнаружили в строении клеточной стенки: в ней появлялись одиночные или множественные разрывы. Образование разрывов вблизи формирующихся (клетки в период деления) и сформированных септ (клетки, недавно завершившие рост) наносило «удар по будущему бактериальной популяции».
благодарность
Авторы выражают благодарность фирме «Bayer HealthCare», оказавшей финансовую поддержку в ходе проведения данного исследования.
цитированная литература
1. Васильева Н.В., Разнатовский К.И., Котрехова Л.П., Михайлова М.А. Мониторирование чувствительности клинически значимых микромицетов к изоконазолу (субстанции кремов Травоген, Травокорт), оценка его эффективности и безопасности в лечении больных микозами кожи// Проблемы медицинской микологии. - 2007. - №2. - С. 19-21. 2 . Босак И.А., КотреховаЛ.П. Действие изоконазола в отношении избранных бактерий // Проблемы медицинской микологии. - 2010. - Т. 12, №4. - С. 49-51.
Поступила в редакцию журнала 13.02.2015 Рецензент: С.М. Игнатьева
