CC BY
53
232 Вестник СамГУ — Естественнонаучная серия. 2010. № 6(80)
УДК УДК 57.04
ВЛИЯНИЕ ИОНОВ КАДМИЯ НА КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ СОСТАВ ЛИПИДОВ И ПИГМЕНТОВ В ФОРМИРУЮЩИХСЯ ЛИСТЬЯХ
МАТТЕВСС1А вТНЯиТНЮРТЕтв
© 2010 О.А. Розенцвет, Е.С. Богданова,1 О.Н. Макурина2
Показано, что ионы кадмия приводят к снижению уровня хлорофиллов и каротиноидов, а также увеличению количества общих липидов в формирующихся листьях МаЫвиесга вШтиЬЫорЬвпв. Рассматриваются обнаруженные изменения липидного и пигментного состава как компенсаторный механизм поддержания гомеостаза развивающихся листьев МаЫвиесга вШтиЬЫорЬвтв.
Ключевые слова: МаЫеиеаа вЬНгиЬЫорЬетв, мембранные липиды, улитки, пигменты, тяжелые сеталлы.
В последние годы усиливается загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами (ТМ) в масштабах, которые несвойственны природе [1]. Адаптация организмов к измененным условиям внешней среды возможна благодаря действию компенсаторных механизмов, связанных с изменением активности и направленности действия метаболических процессов [7].
Кадмий (С^ является одним из наиболее опасных загрязнителей окружающей среды из числа ТМ. Это подвижный активный элемент, который, попадая в живые организмы (в растения, животных и человека), способен конкурировать с железом, медью, кальцием и другими металлами [8].
В ряде обзоров обобщены известные данные об аккумуляции и физиологических аспектах толерантности высших растений к действию Cd [6; 11; 12; 22; 24]. В число токсических эффектов, которые Cd оказывает на высшие растения, входит снижение поглощения минеральных элементов; ингибирование активности ферментов, фотосинтеза и дыхания. Многие из этих эффектов связаны с влиянием Cd на мембранный генезис и целостность биологических мембран, что во многом определяется составом липидов как основного структурообразующего компонента [21; 23].
Фотосинтез растений в значительной степени зависит от состава липидов, поскольку пигментно-белковый комплекс фотосинтетического аппарата встроен в матрицу полярных глицеролипидов мембран тилакоидов, состоящих из моно- и ди-галактозилдиацилглицеринов (МГДГ, ДГДГ), сульфохиновозилдиацилглицеринов
1Розенцвет Ольга Анатольевна ([email protected]), Богданова Елена Сергеевна (coralisamail.ru), Институт экологии Волжского бассейна РАН, 445003, Российская Федерация, г. Тольятти, ул. Комзина, 10.
2Макурина Ольга Николаевна ([email protected]), кафедра биохимии Самарского государственного университета, 443011, Российская Федерация, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.
(СХДГ) и фосфатидилглицеринов (ФГ) [10; 15]. Липиды создают среду для функционирования компонентов фотосистем и регулируют взаимодействие отдельных комплексов [19].
Несмотря на большое количество работ, связанных с влиянием Сd на рост, фотосинтез, состав липидов, работ по возрастным изменениям в составе липидов в растениях, испытывающих воздействие ТМ, включая Cd, явно недостаточно.
Целью наших исследований было изучение динамики состава липидов и пигментов в листьях папоротника МаЫеиеаа вЬНтиЬЫорЬетв (Ь.) Т^аго (страусника обыкновенного), формирующихся в присутствии ионов Cd. Данный вид является представителем древнейшей группы сосудистых растений. Он широко распространен в лесных фитоценозах средней полосы России. Отметим, что современные папоротники представляют огромный интерес в изучении стратегии выживания растительных организмов, поскольку обладают достаточно простыми и эффективными приспособительными реакциями к условиям окружающей среды [13].
Материалы и методы исследования
Растительный материал. Папоротники М. вЬНгиЬЫорЬетв (Pсlypсdiсphyta) собирали в мае 2009 г. на одном из участков Жигулевского заповедника им. И.И. Спрыгина в районе с. Бахилово Самарской области, когда растения находились в состоянии органического покоя.
Инкубация. Растения отмывали от почвы в проточной воде и осушали фильтровальной бумагой. После взвешивания образцы помещали в отдельные сосуды с питательной средой Кнопа (соотношение веса корневища/водная среда 1:4). После одних суток адаптации к новым условиям в питательную среду одноразово добавляли Cd(NOз)2 в концентрации 100 мкМ. Выбор концентрации сделан согласно предварительным исследованиям, показавшим наиболее значимые изменения роста [4]. Растения инкубировали в условиях освещения 1400 ± 200 лк при 15-часовом световом дне и температуре 20 °С в течение 1-10 суток. Для биохимических анализов использовали ткани фотосинтезирующих органов: улитки и верхние и средние сегменты взрослых листьев.
Экстракция и анализ пигментов. Содержание хлорофиллов ”а” и ”Ь” определяли спектрофотометрическим методом на 8реос1 (Чехия) в ацетоновой вытяжке и рассчитывали по формулам [17].
Экстракция и анализ липидов. Выделение липидов проводили по методу [9]. Разделение гликолипидов (ГЛ) проводили методом одномерной тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках (10x10 см) с закрепленным слоем силикагеля с использованием системы растворителей: ацетон : бензол : вода (91:30:8). Проявляли ГЛ опрыскиванием пластинок 5 % 12МсОз х Н3РО4 в метаноле и последующим нагреванием их при температуре 150 °C в течение 10 мин. Количество ГЛ определяли денситометрически (Кейтс, 1975).
Разделение фосфолипидов проводили методом двумерной ТСХ на стеклянных пластинках (6 х 6 см) с закрепленным слоем силикагеля с использованием систем растворителей: хлороформ : метанол : бензол : аммиак (130:60:20:12) — первое направление; хлороформ : метанол : бензол : ацетон : уксусная кислота (140:60:20:10:8) — второе направление. Проявляли фосфолипиды (ФЛ) опрыскиванием пластинок 10 % Н28О4 в метаноле с последующим нагреванием их при температуре 180 °C в течение 15 мин. Количество фосфатидилглицерола (ФГ) определяли по содержанию неорганического фосфора [25].
Анализ жирных кислот. Для анализа жирных кислот (ЖК) использовали их метиловые эфиры, которые получали путем кипячения в 5 % НИ в метаноле. Полученные эфиры очищали препаративной ТСХ и анализировали на газожидкостном хроматографе ”Хроматэк Кристалл 5000.1” (Россия) с использованием капиллярной колонки длиной 105 м и диаметром 0,25 мм ’’ИЕВТЕК” (США). Температура колонки — 180 °С, испарителя и детектора — 260 °С. Скорость тока газа-носителя (гелий) — 20 мл/мин.
Статистика. Данные обрабатывали статистически. Значения в таблицах и рисунках представляют средние арифметические из всех опытов и их стандартные ошибки.
Результаты и их обсуждение
М. вЬНгиЬЫорЬетв относится к столонообразующим видам папоротников, имеет короткий вертикальный стволик, на верхушке которого располагается крупная почка [3]. Листья папоротников на ранней стадии развития улиткообразно закручены (улитки) и нарастают верхушкой.
Согласно предварительным исследованиям, более 80 % поглощенного растением Cd задерживалась корневой системой, а меньшая часть металла проникала в клетки корня и транспортировалась в листья. В молодых, улиткообразно закрученных листьях (улитках) содержание кадмия составило 1,3 мкг/г сухого веса, а в тканях развернувшихся листьев — 3,2 мкг/г (средняя часть) и 4,1 мкг/г (верхняя часть листьев) [5].
Многочисленные исследования показали, что фотосинтетический аппарат растений очень чувствителен к повышенному содержанию металлов в среде. Это связанно, в первую очередь, с их негативным влиянием на фотосинтетические пигменты [16]. В наших экспериментах содержание зеленых пигментов в листьях контрольных вариантов заметно различалось в зависимости от стадии развития листьев (см. таблицу). Максимальное количество хлорофиллов ”а” и ”Ь” отмечено в средней части листьев и составило 0,88 мг/г и 0,23 мг/г сырой массы соответственно. Содержание фотосинтетических пигментов в листьях папоротника в присутствии Cd в питательном субстрате снижалось, однако степень его влияния на содержание пигментов зависела от стадии развития листьев. Так, в тканях улиток и тканях средних частей листьев количество хлорофилла ” а” снижалось в среднем на 40 %, а в верхних частях — только на 10 %. Содержание хлорофилла ” Ь” в тканях улиток оказалось более чувствительным к действию ионов кадмия по сравнению с хлорофиллом ”а” (его уровень снижался на 60 %). В других сегментах листьев содержание хлорофилла ” Ь” снижалось в той же степени, что и содержание хлорофилла ” а”. Отмечено также снижение уровня каротинои-дов в улитках и серединных частях листьев в 1,6-2,4 раза, а в верхних частях — в 1,2 раза в сравнении с контролем.
Отношение хлорофиллов ” а/Ь” является одним из показателей нормального хода фотосинтетических реакций листьев. У всех образцов папоротника под влиянием Cd соотношение между хлорофиллами ”а” и ”Ь” не менялось. Известно, что хлорофилл ” а” входит в состав реакционных центров и периферических антенных комплексов фотосистемы I (ФС1) и фотосистемы II (ФС11), в то время как хлорофилл ” Ь” преимущественно является компонентом светособирающего комплекса ФС11 [18]. Постоянство данного отношения указывает на то, что, несмотря на снижение общего количества пигментов, которое происходит под влиянием ионов Сd,
Таблица
Динамика содержания пигментов (мг/г сырой массы) в листьях М.вЬНгиЬЫорЬетв, формирующихся в присутствии ионов Cd
Листья Пигменты
Хлоро- филл а Хлоро- филл Ь Соотно- шение хлоро- филлы а/Ь ССК Кароти- ноиды Соотн. хлоро филлы а+Ь/каро-тиноиды
Улитки
Контроль 0,27±0,01 0,09±0,06 3,0 1,20±0,00 0,11±0,10 3,3
Cd 0,16±0,01 0,04±0,09 3,7 1,00±0,40 0,07±0,04 2,8
Верхние листья
Контроль 0,73±0,05 0,16±0,01 4,5 1,20±0,00 0,07±0,02 12,7
Cd 0,66±0,10 0,14±0,04 4,5 1,10±0,40 0,06±0,02 13,3
Средние листья
Контроль 0,88±0,10 0,23±0,03 3,8 1,20±0,00 0,08±0,01 13,8
Cd 0,53±0,10 0,15±0,02 3,5 1,20±0,00 0,05±0,01 16,9
соотношение между комплексами реакционных центров фотосистем и светособирающих комплексов оставалось неизменным.
Возможными причинами снижения содержания зеленых пигментов в растениях является непосредственное действие ТМ на активность ферментов биосинтеза хлорофилла. При этом основными мишенями ингибирования выступают образование фотоактивного хлорофиллидредуктазного комплекса и синтез ^-аминолевулиновой кислоты [20]. Известно, что Cd так же, как ^ и Zn, может нарушать биосинтез хлорофилла, взаимодействуя с 8Н-группами белков, в результате чего снижается активность протохлорофилидоксидоредуктазы [6].
Данные, представленные на рис. 1, показывают, что в листьях, формирующихся в присутствии Cd, происходило увеличение содержания всех липидов, отвечающих за структуру мембран хлоропластов. Так, в контроле по мере формирования листьев наблюдалось увеличение доли МГДГ в составе гликолипидов с 45 % (улитки) до 67 % (средние части листьев). Под действием Cd концентрация и относительный вклад МГДГ в состав липидов листьев снижался: в липидах верхних листьев с 63 до 57 % , а в липидах средних листьев — с 67 до 55 % по сравнению с контрольными вариантами. При этом увеличивалось относительное содержание двух других компонентов ДГДГ и СХДГ, особенно ярко выраженное для СХДГ: его вклад в состав ГЛ взрослых листьев увеличивался более чем в 5 раз.
^абилизация тилакоидных мебран зависит также и от величины отношения МГДГ/ДГДГ. Снижение этого показателя может приводить к редукции содержания хлорофилла и фотосинтетической активности, изменяя структуру хлоропла-стов [15]. Полученные нами данные показывают, что отношение МГДГ/ДГДГ снижается на 8 % в липидах верхних листьев и на 37 % — в липидах средних листьев. Возможно, что одна из причин снижения количества зеленых пигментов была связана с изменением данного соотношения, характеризующего структуру гран в хлоропласте.
Увеличение же количества ГЛ у страусника обыкновенного свидетельствует об интенсификации обмена липидов, направленной, по-видимому, на обеспечение
200
180
160
140
О ц 120
с Ег 100
.1- (- 2 80 60
40
20
0
У ВЧ СЧ МГДГ
£
У ВЧ СЧ У ВЧ СЧ У ВЧ СЧ
ДГДГ кпсч СХДГ ФГ
Рис. 1. Состав липидов мембран хлоропластов папоротника МаЫвиоаа вШтиЬЫорЬвпв: У — улитки, ВЧ — верхняя часть листьев, СЧ — средняя часть листьев
оптимальной среды для замены поврежденных в результате воздействия Cd белков. В связи с этим уместно отметить более высокое накопление этих липидов, особенно ДГДГ и СХДГ. Не менее важным является накопление ФГ, поскольку данный липид служит одним из ключевых факторов, стабилизирующих олигомерную форму светособирающего комплекса (ССК) фотосистемы II.
Среди ацильных компонентов общих липидов в листьях папоротника более 80 % от суммы составляли кислоты С\6 и С18 ряда, и влияние Cd в целом мало отразилось на соотношении насыщенных и ненасыщенных кислот (данные не приведены). Однако заметные изменения наблюдались в составе ненасыщенных ЖК. Большая часть ненасыщенных ЖК улиток и средних частей листьев представлена полиеновыми кислотами, главным образом, полиеновыми (рис. 2). В верхних частях листьев больше доля моноеновых кислот, которая превышала количество диеновых кислот. Следует отметить, что Cd практически не приводил к изменению ненасыщенности ацильных цепей в липидах растущих частей листа — улиток и верхних сегментах. В отличие от них, в более зрелых частях листа, влияние Cd было более существенным — увеличивалась доля моноеновых, но снижалась доля полиеновых ЖК.
35
30
25
^ 20
І
£ 15
О
I 10
5
0
1 2 3 1 2 3 1 2 3
У ВЧ СЧ
■к пса
Рис. 2. Содержание ненасыщенных жирных кислот в составе общих липидов
МаНеиоога вЬНтиЬНгорЬеггз:
1 — моноеновые кислоты; 2 — диеновые кислоты, 3 — полиеновые
Таким образом, в листьях папоротника M. sthruthiopteris, формирование которых происходило в присутствии Cd, отмечено снижение уровня пигментов и каротиноидов. В то же самое время наблюдалось увеличение общего содержания липидов, отвечающих за структуру фотосинтетического аппарата, а также изменение их вклада относительно друг друга, что можно расценивать как компенсаторную реакцию клетки, направленную на стабилизацию фотосинтезирующих комплексов. Интенсификация липидного обмена в клеточных мембранах, направленная на усиленный синтез гликолипидов, обеспечивает защиту от этого металла и поддержание нормального гомеостаза клеток в формирующихся листьях папоротника.
Литература
[1] Город и биосфера / Л.О. Карпачевский [и др.] // Биосфера. 2009. № 1. С. 153-165.
[2] Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975. 323 с.
[3] Нехлюдова М.В., Филин В.Р. Страусник обыкновенный. Биологическая флора Московской области / под ред. В.Н. Павлова, В.Н. Тихомирова. М.: Изд-во МГУ, 1993. Ч. 1. С. 5-21.
[4] Нестеров В.Н., Розенцвет О.А. Мурзаева С.В. Изменение состава липидов пресноводного растения Hydrilla verticillata (L. fil.) Royle при аккумуляции и элиминации ионов тяжелых металлов. Физиология растений. 2009. Т. 56. С. 97-106.
[5] Розенцвет О.А., Богданова Е.С. Влияние ионов кадмия на содержание фо-тосинтетических пигментов листьев разного возраста папоротника Matteuccia sthruthiopteris // Физические механизмы становления и поддержания функции организма: материалы Международной научно-практической конференции. Сухуми, 2010. С. 415-418.
[6] Серегин И.В., Иванов В.Б. Физиологические аспекты токсического действия кадмия и свинца на высшие растения // Физиология растений. 2001. Т. 48. № 4. С. 606-630.
[7] Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений. СПб.: Изд-во СПбГУ, 2002. 240 с.
[8] Распределение Cd и Fe в растениях Mesembryanthemum crystallinum при адаптации к Cd-стрессу / Н.И. Шевякова [и др.] //Физиология растений. 2003. Т. 50. № 5. С. 756-763.
[9] Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method for total lipid extraction and purification // Canad. J. Biochem. Physiol. 1959. № 37. P. 911-917.
[10] Benning C. A role for Lipid Trafficking in Chloroplast Biogenesis // Prog. Lipid Res. 2008. V. 47. P. 381-389.
[11] Clemens S. Toxic metal accumulation, responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants // Biochimie. 2006. V. 88. P. 1707-1719.
[12] Cobbet C.C. Phytochelatins and their roles in Heavy Metal Detoxication // Plant Physiol. 2006. V. 123. P. 825-832.
[13] Dyer A.F. The Experimental Biology of Ferns. Edinburgh: Academic Press, 1979. P. 1-10.
[14] Hall J.L. Cellular mechanisms for heavy metal detoxication and tolerance // J. Experiment. Bot. 2002. V. 53. P. 1-11.
Holzl G., Dorman P. Structure and Function of Glycerolipids in Plants and Bacteria // Progr. Lipid Res. 2007. V. 46. P. 225-243.
Heavy metal-induced inhibition of photosynthesis: target of in vivo heavy metal chlorophyll formation / H. Kupper [et al] // J. Phycology. 2002. V. 38. P. 429-441.
Lichtenthaler H.K., Welburn R.R. Determination of total carotenoids and chlorophylls a and b of extracts in different solvents // Biochem. Soc. Trans. 1983. V. 603. P. 591-592.
Crystal structure of spinach major light-harvesting complex at 2.72 A resolution / Z. Liu [et al.] // Nature. 2004. V. 428. P. 287-292.
Lipids in Photosystem II: Interactions with Protein and Cofactors / B. Loll // Biochim. Biophysic. Acta. 2007. V. 1767. P. 509-519.
Mysliwa-Kurdziel B., Strzalka K. Influence of Cd(II), Cr(VI) and Fe(III) on early steps of deetiolarion process in wheat: fluorescence spectral changes of protochlorophyllide and newly formed chlorophyllide // Ag. Ecosys. Environ. 2004. V. 106. P. 199-207.
Comparative study of cadmium effects on membrane lipid composition of Brassica juncea and Brassica napus leaves / I. Nouairi [et al.] // Plant Science. 2006. V. 170. P. 511-519.
Cadmium regulated nitrate reductase activity in Hydrilla verticillata (L.F.) Royle / U.N. Rai [et al.] // Water, Air and Soil Pollution. 1998. V. 106. P. 171-177.
Rama Devi S., Prasad M.N.V. Membrane lipid alteration in heavy metal exposedplants // Prassad MNV, Hagemeyer J (eds.) Heavy metal stress in plants. From molecules to ecosystems. Berlin: Springer, 1999. P. 99-117.
Sanita di Toppi L., Gabbrielli R. Response to cadmium in higher plants. Environmental and Experiment. Bot. 1999. V. 41. P. 105-130.
Vaskovsky V.E., Latyshev N.A. Modified Jungnickel s reagent for detecting phospholipids and other phosphorus compounds on thin-layer chromatograms // J. Chromatogr. 1975. V. 115. P. 246-249.
Поступила в редакцию 3/ VI/2010; в окончательном варианте — 3/ VI/2010.
INFLUENCE OF CADMIUM IONS ON QUALITATIVE AND QUANTITATIVE COMPOSITION OF LIPIDS AND PIGMENTS IN THE FORMING LEAVES OF MATTEUCCIA
STHR UTHIOPTERIS
© 2010 O.A. Rozentsvet, E.S. Bogdanova? O.N. Makurina4
It was shown that cadmium ions lead to decreasing the level of chlorophyll and carotenoids, but also to the increasing the quantity of the general lipids in the forming leaves of Matteuccia sthruthiopteris. The found out changes in the structure of lipids and pigments as compensatory mechanism of homeostasis maintenance of developing leaves of Matteuccia sthruthiopteris are considered.
Key words: Matteuccia sthruthiopteris, membrane lipids, ferns, pigments, heavy metals.
Paper received 3j VIj2010. Paper accepted 3j VIj2010.
3Rozentsvet Olga Anatolievna (olgarozenapochta.ru), Bogdanova Elena Sergeevna
(coralisSmail.ru), Institute of Ecology of Volga Basin RAS, Togliatti, 445003, Russian Federation.
4Makurina Olga Nikolaevna (dekanat.05.54 S mail.ru), the Dept. of Biochemistry, Samara State University, Samara, 443011, Russian Federation.
