CC BY
10ЕГЕПШАРНЫЙ
Врач
УДК 619:616.98:579.873.21:616-07
влияние интоксикации кадмием на антителогенез кроликов при экспериментальном инфицировании MYCOBACTERIUM BOVIS
А.Р.Валеева - младший научный сотрудник.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420075, г.Казань, Научный городок-2, e-mail: vnivi@mail.ru).
Известно, что кадмий обладает способностью вытеснять биометаллы из белковых структур, ингибирует каталитические свойства ферментов, угнетает факторы неспецифического иммунитета, осложняет течение инфекционного процесса. Целью данной работы явилось - изучить динамику синтеза специфических антител у кроликов, инфицированных M.bovis, на фоне их интоксикации малыми дозами хлорида кадмия. Материалы и методы. Кроликов разделили на 4 группы, по 3 головы в каждой. Хроническую интоксикацию моделировали с применением соли хлористого кадмия, водный раствор которого перорально вводили кроликам 1 и 3 групп ежедневно в течение 60 дней в дозе 1,5 мг/кг. Животные 2 и 4 групп получали плацебо. Через 14 сут от начала эксперимента кроликов 2 и 3 групп инфицировали M.bovis Bovinus-8. Динамику антителогенеза определяли методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием антигенов, полученных нами, и мультиплексным иммуноанализом. Диагностическую значимость полученного антигенного материала подтверждали аналитическим электрофорезом и иммуноблотом. Результаты исследований. У инфицированных животных (2 группа) антителогенез проявлялся, начиная с 14-х сут после заражения. При этом уровень антител в сыворотке крови был стабилен до конца срока наблюдения (42 сут), а показатели оптической плотности достигали 1,177 ОЕ для экстракта клеток M.bovis Bovinus-8 и 0,238 ОЕ для их вторичных метаболитов. У кроликов, инфицированных на фоне интоксикации (3 группа), отмечалась задержка синтеза специфических антител до 28-42 суток. Показатели ИФА у неинфицированных животных (1 и 4 группы) не превышали 0,179 ОЕ и 0,078 ОЕ для указанных антигенов, соответственно. Мультиплексным иммуноанализом установлено, что при инфицировании M.bovis образование специфических антител у кроликов 2 группы начиналось с 7-х сут, достигая максимальных значений (более 50000 RLU) на 21-42сут. Выраженное угнетение антителогенеза отмечалось в 3 группе, где максимальные значения уровня антител не превышали 9000 RLU. У кроликов 1 и 4 групп показания не превышали средний фоновый уровень - 500 RLU. Заключение. Мультиплексным и иммуноферментным анализом выявлено, что интоксикация хлоридом кадмия приводит к угнетению выработки специфических антител у кроликов при инфицировании M.bovis.
клюЧЕВЫЕ слоВА: туберкулез, антигены, тяжелые металлы, ифА, иммуноблот.
Для современного мира характерно увеличение зон с высокой антропогенной нагрузкой. Урбанизация, рост потребностей населения, развития промышленности и сельского хозяйства приводят к экологическому дисбалансу среды обитания, который влияет на состояние здоровья человека [1,2] и животных [3, 4].Одним из основных полютантов окружающей среды являются тяжелые металлы, которые обладают кумулятивными свойствами и при длительном поступлении даже в небольших дозах способны накапливаться и влиять на метаболические процессы, оказывать иммуносупрессивное действие в отношении иммуноглобулинов классов ^ и митоген-ин-дуцированной стимуляции пролиферации иммуно-цитов [5]. При этом прослеживается корреляционная зависимость депонирования тяжелых металлов в организме животных от близости расположения кормовых угодий к промышленным предприятиям и автомагистралям [6]. Высокий уровень содержания тяжелых металлов в кормах и в большей степени в сене и силосе [7] обусловлен их большей аккумуляцией в вегетативных органах растений [8].
Особую опасность представляет кадмий, который обладает способностью вытеснять биометаллы из белковых структур, ингибируя каталитические свойства ферментов. Ионы кадмия угнетают факторы неспецифического иммунитета, ингибируют активность анти-оксидантной системы, приводят к образованию свободных радикалов и усилению процессов перекисного окисления липидов [9].В организме крупного рогатого скота кадмий больше всего аккумулируется в почках, при этом наблюдается выраженная иммунодепрессия, что проявляется снижением уровня Т-лимфоцитов, фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови, увеличением циркулирующих иммунных комплексов, эозинофилией [10]. Хроническое воздействие малыми дозами кадмия на крыс стимулирует спонтанную пролиферацию лимфоцитов селезенки и снижает их ответ на митогены [11]. Эпидемиологическими исследованиями [12] статистически значимые (р<0,05) высокие концентрации кадмия обнаружены в образцах волос от больных туберкулезом людей. При этом никакой корреляции с кадмием не было получено у пациентов с сердечными заболеваниями, диабетом,
гепатитом, заболеваниями дыхательных путей, дерматитами и гипотонией. Результаты клинических исследований [13] показали значительно более высокие уровни кадмия (р<0,001) в биологических образцах пациентов с ВИЧ, по сравнению с контрольной группой. При этом отмечается, что высокие уровни кадмия могут быть прогностическими факторами туберкулеза и других вторичных инфекций у ВИЧ больных. На фоне кадмиевой интоксикации наблюдается увеличение смертности мышей, инфицированных штаммом BCG Mycobacterium bovis (M.bovis) [14]. У затравленных в течение 9 месяцев солями кадмия, свинца, хрома в дозах ниже ПДК морских свинок после заражения M.bovis отмечается более тяжелое течение инфекции, прогрессирующая потеря живой массы, достоверно более интенсивные аллергические реакции на туберкулин [15].
Ранее нами было установлено, что при инфицировании микобактериями туберкулеза бычьего типа на фоне хронической интоксикации малыми дозами CdCl2 наблюдаются замедление роста и развития кроликов, изменение показателей теплового состояния организма, характеризующееся волнообразными колебаниями температуры тела, и клинико-биохимиче-ских показателей крови [16], морфофункциональные нарушения внутренних органов [17].
целью данной работы явилось изучение динамики синтеза специфических антител у кроликов, инфицированных M.bovis, и влияние на нее интоксикации малыми дозами CdCl2.
Материалы и методы. Схема экспериментального заражения и интоксикации кроликов описана в наших предыдущих работах [16, 17]. В качестве модельных животных использовали кроликов весом 3-3,5 кг. Экспериментальных животных содержали в стандартных условиях, соответствующих зоотехническим нормам и требованиям. Животные были разделены на группы по принципу аналогов с учетом породы, возраста, пола и массы тела(табл. 1).
Таблица 1
Экспериментальные группы животных
В работе использовали шестинедельную культуру штамма M.bovis Bovinus-8, предоставленного ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ), выращенную на плотной питательной среде
Левенштейна-Йенсена, приготовленной по классическому рецепту в лаборатории культуры клеток и питательных сред ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Подготовленные бактерии использовали для инфицирования экспериментальных животных и выделения антигенных фракций белков для серологических исследований.
Хроническую интоксикацию тяжелыми металлами моделировали с применением соли хлористого кадмия (ГОСТ 4330-66) (С0С12),водный раствор которого вводили кроликам 1-ой и 3-ей групп перорально ежедневно в течение 60 дней в дозе 1,5 мг/кг (1/100 часть ЛД50 для кроликов)при помощи тонкого эластичного зон5д0 а (катетер, питающий с ренгено контрастной полосой метрический, 50см, Conva Tec). Животные 3-ей и 4-ой групп получали плацебо. Через 14 сут после 1-го введения CdCl2 кроликам 2-ой и 3-ей групп, подкожно в области правого бедра вводили 1 мл суспензии, содержащей 10 ЕД микробных тел/мл(по стандартному отраслевому образцу мутности бактериальных взвесей, ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России) M.bovis Bovinus-8 в стерильном физиологическом растворе. В день перед инфицированием, а также на 7, 14, 21, 28, 42 сутки после, у животных брали кровь из краевой вены уха по стандартной методике с использованием вакуумных пробирок с активатором свертывания (Vacuette Serum Clot Activator, Grener Bio-One).
Для определения уровня антител в сыворотке крови в динамике инфекционного процесса провели оптимизацию метода непрямого иммуноферментного анализа (ИФА)с антигенами, полученными из M.bovis Bovinus-8, а также модифицировали мультиплексный иммуноанализ. Для этих целей использовали диагностические гипериммунные сыворотки крови кроликов против M.bovis Bovinus-8, полученные ранее [18].
В качестве антигенов для серологических исследований использовали экстракт клеток микобактерий, полученный в нашей лаборатории описанным ранее способом [19] и их вторичные метаболиты, выделенные из супернатанта при экстракции. Электрофорез антигенного материала проводили в 12,5% разделяющем полиакриламидном геле по U.K.Laemmli, как описано ранее [20]. Серологическую активность антигенов изучали в реакции иммуноблот, который ставили по схеме, аналогично описанной ранее [20], для чего фракционированный материал переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Иммуноблот, как высокоспецифичный и высокочувствительный референтный метод, проводили и для определения специфичности антител в сыворотке крови исследуемых животных к микобактериальным антигенам, сравнивая показания с таковыми, полученными с гипериммунной кроличьей сывороткой крови против M.bovis Bovinus-8. Результаты электрофореза и иммуноблота документировали на Gel Doc XR+ Sistem (Bio Rad) и обрабатывали с использованием программного обеспечения «Image Lab Software».
Группа Характеристика воздействия Кол-во животных
1 Хроническая интоксикация (ОТС12) 3
2 Инфицирование М.Ьоу1б ВОУ1ПиБ-8 3
3 Инфицирование М.Ьоу1б Воу|пив-8 на фоне хронической интоксикации (С(^12) 3
4 Интактные животные 3
L ^ ЕТЕРКНАРНЫЙ
Врач
Для постановки ИФА антигены иммобилизи-ровали на поверхности лунок разборного полистиролового 96 луночного планшета (Biomedical LTD). При проведении реакции применяли коммерческие растворы и реагенты: фосфатно-солевой раствор (Phosphate Buffered Saline Tablets, Ampresco) (PBS), в качестве антивидового конъюгата - козьи антитела против иммуноглобулинов кролика, меченные пероксидазой (Sigma), для проявления реакции -однокомпонентный субстрат тетраметилбензидина (ТМБ) производства BektorCorp. Учет результатов ИФА осуществляли на спектрофотометре Multiscan GO (Thermo Scientific^ оценкой абсолютных показателей оптической плотности (ОП) исследуемой и контрольной проб сыворотки крови животных.
Мультиплексный иммуноанализ ставили по описанной ранее методике [21, 22] в модификации для определения уровня специфических антител у кроликов, для чего в качестве конъюгата использовали указанные выше антитела против иммуноглобулинов кролика. Уровень антител определяли в относительных световых единицах (RLU).
Результаты исследований. При анализе электрофоретического фракционирования экстракта клеток M.bovis Bovinus-8 и их вторичных метаболитов был выявлен широкий спектр структурных компонентов M.bovis Bovinus-8, распределяющийся в диапазоне молекулярных масс от 200 до 6,5кДа для первого антигена и от 200 до 16,1 кДа для второго (рис. 1).
Рис.1. Электрофорез антигенного материала в полиакриламидном геле, окрашивание серебром: а - экстракт клеток М.Ьомв Воутив-Б; б - вторичные метаболиты клеток М.Ьомв Воутив-Б
Серологическую активность определяли в реакции иммуноблот с гипериммуной сывороткой кролика против М.Ьоте Воу1пиз-8 (рис. 2). При анализе результатов реакции выявили несовпадение с результатами аналитического электрофореза. С положительной сывороткой реагировали фракции антигена, полученного из вторичных метаболитов М.Ьоте Воу1пив-8, с молекулярными массами 50,5, 29,4, 22,4 и 20,6 кДа, а антигенный материал из экстракта клеток был активен в зоне от 82,3 до 6,5 кДа. Это позволяет предположить, что, по всей видимости, серологическая активность дислоцирована не в белковых, а в липидных структурах, что связано с особенностями строения клеточной стенки микобактерий. Однако спектр полученных препаратов охватывает комплекс диагностически значимых антигенов, что исключает получение ложноотрицательных результатов. Полученный антигенный материал использовали в дальнейших серологических исследованиях.
При оптимизации условий и режимов постановки непрямого ИФА для изучения показателей специфичного иммунного ответа у кроликов при инфицировании M.bovis Bovinus-8, с использованием гипериммунных сывороток, выявлено оптимальное для постановки реакции разведение антигенного материала, при котором достигается минимальное значение фона реакции - 1:100 на 0,2М карбонатно-бикарбонатном буферном растворе с рН 9,6. При этом для более эффективной иммобилизации антигена в лунках полистиролового планшета его необходимо инкубировать при комнатной температуре в течение 24 ч с дальнейшей 3-кратной промывкой PBS. Установлено, что наиболее приемлемым для постановки ИФА разведением исследуемых сывороток являлось 1:100 в 0,1М фос-фатно-солевом буферном растворе с pH 7,2-7,4 с добавлением 0,5% твина-80 (ФБР-Т) с режимом инкубации - 40 мин при 300 об/мин и температуре 37°С с
ЯШ* м м л
1« 1. г\ \ л 1 п
V. ЛГ ■ и ■ л 1 i 1
11 \Ш\ 11 \шяшш ш п
м и •» ц. «/1 1«
I -г «1- II 1* km г\
L «О- к / \ / \ J 1 / / V/ V
•4 1 •я м ^ •П (■
Рис.2.иммуноблот с гипериммунной кроличьей сывороткой против М.Ьоу1э: а - экстракт клеток М.Ьоу1э Воутиэ-8;б - вторичные метаболиты клеток М.Ьоу1э Воушиз-8.
последующей 5-кратной промывкой ФБР-Т. При этом условия инкубирования и отмывки были оптимальны и на этапе внесения антивидового канъюгата, который применяли в рабочем разведении 1:60000 на ФБР-Т. Для проявления реакции в лунки планшета вносится субстратная смесь ТМБ, инкубируется при комнатной температуре в течение 10 мин. Для остановки реакции используется 1М раствор серной кислоты. Наилучшее считывание результатов реакции при фотометрическом измерении наблюдали при длине волны 450 нм и референсном фильтре со значением 655 нм. При таких условиях и режимах постановки ИФА с гипериммуной сывороткой оптическая плотность достигала 3,203 ОЕ при использовании в качестве антигена вторичных клеточных метаболитов и была выше 3,500 ОЕ при использовании экстракта клеток.
В результате ИФА выявили, что в группе животных, зараженных M.bovis (2 группа), антителогенез проявлялся, начиная с 14-28сут после инфицирования. Оптическая плотность 5-7-кратно превышала показатели животных до инфицирования и интактных при использовании в качестве антигена экстракта клеток и не более чем в 4 раза при использовании вторичных метаболитов клеток M.bovis Bovinus-8. При этом уровень антител в сыворотке крови был стабилен до 42 сут исследовани-я(до конца срока наблюдения) и оптическая плотность достигала 1,177 ОЕ для экстракта клеток и 0,238 ОЕ для вторичных метаболитов. В 3-ей группе кроликов, инфицированных на фоне интоксикации, специфические антитела обнаруживались только на 28-42 сут после инфицирования. При этом значения оптической плотности превышали показатели у данных животных до ин-
фицирования не более чем в 3 раза и достигали 0,947 и 0,221 ОЕ для указанных антигенов соответственно. Показатели оптической плотности у животных 1-ой и 4-ой групп во все сроки исследования находились на уровне 0,111-0,179 ОЕ для экстракта клеток M.bovis Bovinus-8 и 0,055-0,078 ОЕ для их вторичных метаболитов, что являлось общим фоном реакции.
Таким образом, хроническая интоксикация малыми дозами CdCl2 вызвала угнетение специфичного иммунного ответа организма кроликов на введение заражающей дозы возбудителя туберкулеза, что проявлялось в более поздних сроках начала антителоге-неза и низком уровне антител в сыворотке крови животных, инфицированных на фоне интоксикации.
Далее с сыворотками крови животных проводили иммуноблот и определяли молекулярную массу фракций антигенных препаратов, реагирующих с ними. Высокой серологической активностью обладали фракции, локализованные в низкомолекулярной зоне - 31-24 кДа (рис. 3), тогда как гипериммунная сыворотка реагировала с фракциями в диапазоне от 82,3 до 6,5 кДа. По-видимому, образование связей в реакции антиген-антитело специфичных иммунных компонентов исследуемых сывороток крови кроликов с низкомолекулярными фракциями связано с особенностями иммунного ответа у животных, подвергнутых экспериментальному инфицированиюМ.bovis Bovinus-8 на фоне хронической интоксикации CdCl2. Полученные результаты указывают на необходимость проведения дальнейших исследований по препаративному выделению данных специфических компонентов и изучению их серологической значимости.
Рис. 3. Результаты иммуноблота с сыворотками крови кролика, инфицированного М.Ьоу1в Воутив-8
на фоне хронической интоксикации СДО12: а - экстракт клеток М.Ьоу1в Воутив-8, б - вторичные метаболиты клеток М.Ьоу1в Воушив-Б; 1 - 0, 2 - 7, 3 - 14, 4 - 21, 5 - 28, 6 - 42 сут после инфицирования,7 - гипериммунная сыворотка
кролика против М.Ьоу1в Воу1пив-8.
При анализе результатов мультиплексного имму-ноанализа было установлено, что гипериммунизация кроликов вызывает активизацию антителогенеза к антигенам MPB70 и MPB83 уже после первого введения микобактериальных антигенов, полученных из M.bovis. При этом максимальный уровень антител к указанным антигенам достигал более 60000 RLU спустя 21сутпосле иммунизации и держался на этом уровне до конца срока наблюдения (140 сут). Антите-лообразование к ранним секретируемым антигенам ESAT-6 и CFP-10 активизировалось после каждого введения микобактериальных антигенов, а максимальный уровень антител (до 50000 RLU) отмечался через 14 сут после 4-й иммунизации.
При инфицировании M.bovis образование специфических антител к MPB70 у кроликов 2-ой группы начиналось с 7-хсут, достигая максимальных значений (более 50000 RLU) на 21-42 сут. Антитела к антигенам MPB83, ESAT-6 и CFP-10 у животных этой группы выявлялись на более низком уровне и не превышали 10000 RLU во все сроки исследования. Выраженное угнетение антителогенеза отмечалось в группе животных, инфицированных на фоне кадмиевой интоксикации (3-я группа). Антитела к ранним секретируемым ан-
тигенам улавливались на уровне менее 3000 ЯШ, а к МРВ-83 - менее 1000 ЯШ. Максимальные значения уровня антител к МРВ70 не превышали 9000 ЯШ даже спустя 42 сут после инфицирования. У всех кроликов 1-ой и 4-ой групп, которым инфекционный материал не вводился, антитела к указанным антигенам не выявлялись, а показатели мультиплексного иммуноанализа не превышали средний фоновый уровень - 500 ЯШ.
Заключение. В ходе исследования проведена оптимизация условий и режимов постановки ИФА с использованием полученного антигенного материала. Установлено, что спектр полученных препаратов из экстракта клеток М.Ьоу1б Воу1пив-8 и их вторичных метаболитов охватывает комплекс диагностически значимых антигенов, что исключает получение лож-ноотрицательных результатов при серологических исследованиях на туберкулез. Мультиплексным и имму-ноферментным анализом выявлено, чтоинтоксикация хлоридом кадмия приводит к угнетению выработки специфических антител у кроликов при инфицировании М.Ьоу1б. Задержка в иммунном ответе составляла до 28-42суток, а выявление антител наблюдалось в иммуноблоте только к антигенным фракциям, локализованным в низкомолекулярной зоне.
Литература
1. Анализ заболеваемости населения и определение ее взаимосвязи с факторами окружающей среды / Н.К.Дю-сембаева, А.Е.Шпакова, Б.М.Салимбаева, Е.А.Дробченко // Научный альманах. - 2015. - №3 (5). - С. 132-138.
2. Кряжев, Д.А. Комплексная оценка неканцерогенного риска на здоровье населения моногородов и сельских поселений от воздействия загрязняющих химических веществ / Д.А.Кряжев, М.В.Боев, Л.М.Тулина // Альманах молодой науки. - 2015. - № 3. - С. 3-8.
3. Содержание тяжелых металлов в кормах и молоке коров в регионе нефтедобычи / Ф.К.Дхметзянова, Г.Г.И-льязов, Л.П.Зарипова, P.P.Зайсанов // Ученые записки ^BAM. - 2005. - Т. 180. - С. 9-1б.
4. Донник, ИМ Oкружающая среда и здоровье животных / ИМДонник, ИАШкуратова // Ветеринария Кубани. - 2011. - № 2. - С. 12-13.
5. Изучение влияния полихлорированных бифенилов и тяжелых металлов на показатели иммунной системы в эксперименте / ИАЗастенская, КП.Пивень, В.В.Кочубинский, A.B.Kочубинский // Токсикологический вестник.
- 2014. - № 2. - С. 28-31.
6. Эколого-биологические особенности крупного рогатого скота в условиях техногенеза/ ИАШкуратова, ИМДонник, A.Г.Исаева, A.С.Kривоногова // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. -2015. - № 2. - С. 3бб-3б9.
7. Лоретц, O.r. Состояние здоровья и молочная продуктивность коров в промышленных регионах / O.T^-ретц, M.И.Барашкин // Ветеринарная патология. - 2012. - Т. 40, № 2. - С. 113-115.
8. E^^, E.K.Aтомно-адсорбционное и гистохимическое изучение аккумуляции свинца и кадмия растениями, произрастающими вблизи автомагистрали / EXE^^, M.Д.Eськова, Л.В.Серая // Вестник Pоссийской академии сельскохозяйственных наук. - 2012. - № 2. - С. б2-б3.
9. Pазвитие адаптационных механизмов у самок белых крыс в ответ на воздействие ионов кадмия / E^Ore-панова [и др.] // Токсикологический вестник. - 2008. - № 3. - С. 23-27.
10. Динамика накопления экотоксикантов в биологических ресурсах регионов с интенсивной антропогенной нагрузкой / ИМДонник, ИАШкуратова, Э.И.Хасина, E.B.Якубенко // Ветеринария Кубани. - 2012.
- № б. - С. 21-24.
11. Дмитруха, H.H. Изменения в иммунных органах крыс при субхронической интоксикации свинцом и кадмием / ККДмитруха // Бюлопятварин. - 2010. - Т. 12, № 2. - С. 403-408.
12. Mehra, R.Hair as an indicator for assessing adverse effect of cadmium on human health / R.Mehra, M.Juneja // J Environ Sci Eng. - 2005. - V. 47, № 1. - P. 59-б4.
13. Evaluation of arsenic, cadmium, lead, nickel, and zinc in biological samples (scalp hair, blood, and urine) of tuberculosis and diarrhea male human immunodeficiency virus patients / H.I.Afridi[et al.] // Clin Lab. - 2011. - V. 57, № 11-12. - P. 8б7-878.
14. Bozelka, B.E.Increased mortality of cadmium-intoxicated mice infected with the BCG strain of Mycobacterium bovis / B.E.Bozelka, P.M.Burkholde // J Reticuloendothel Soc. - 1979. - V. 2б, № 3. - P. 229-237.
15. Влияние интоксикации стойкими органическими загрязнителями и тяжелыми металлами на течение туберкулезной инфекции / ИАЗастенская, A.П.Лысенко, В.В.Кочубинский, A.B.Kочубинский // Токсикологический вестник. - 2014. - № 3. - С. 18-21.
16. Валеева, A.P.Hекоторые физиологические и биохимические показатели кроликов при патогенезе туберкулеза на фоне интоксикации тяжелыми металлами / A.P.Bалеева, P.M.Aхмадеев, З.З.Длеева // Aктуальные направления инновационного развития животноводства и ветеринарной медицины: мат.Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Уфа: Башкирский TAy, 2014.- С. 1б-18.
17. Патоморфологические изменения у кроликов при заражении Micobacterium bovis на фоне хронической интоксикации тяжелыми металлами / A.P.Bалеева [и др.] // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2015. - № 2. - C. 28-30.
18. Сравнительная оценка эффективности схем иммунизации кроликов для получения диагностических сывороток при туберкулезе / H.A.Xисматуллина [и др.] // Биотехнология: реальность и перспективы: мат. Mежду-нар. науч.-практ. конф. - Саратов, 2014. - С. 218-219.
19. Пат. 2390559 Pос. Федерация, Ml^ d2N7/00. Способ получения антигена из Micobacteriumtuberculosis / ИМ^аертынова, A.П.Цибулькин, P.Ш.Bалиев, O.M.Pоманенко, К.С^аертынов, КГ.Уразов; заявитель и патентообладатель ГОУ ВГЮ Казанский государственный медицинский университет. - № 2008141939/13; заявл. 22.10.2008; опубл. 27.05.2010.
20. Способ получения антигена с молекулярной массой 45 кДа из Mycobacteriumtuberculosis / Э.Длфредо [и др.] // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 1-1. - С. 18-22.
21. Mультиплексный ИФA с хемилюминесцентной меткой для диагностики туберкулеза у кабанов / ЭАШура-лев[и др.] // Ветеринария. - 2013. - № 2. - С. 25-28.
22. Шуралев, ЭА Сравнительный анализ тест-систем для диагностики туберкулеза у альпак / ЭАШуралев // Ветеринарный врач. - 2012. - № 5. - С.30-33.
CADMIUM-INTOXICATION IMPACT ON ANTIBODY RESPONSE OF EXPERIMENTALLY MYCOBACTERIUM BOVIS INFECTED RABBITS
Valeeva A.R. - research assistant.
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: vnivi@mail.ru).
It is known that cadmium has the ability to supersede biometals from the protein structures, inhibits the catalytic properties of the enzymes, depresses innate immunity factors, exacerbates the infectious process. The aim of this work was to explore the dynamics of the specific antibodies synthesis in M.bovis infected rabbits and the impact of intoxication with low doses of cadmium chloride on it. Materials and methods. The animals were divided into 4 groups, three rabbits each. The chronic intoxication was caused by using cadmium chloride the aqueous solution of which was administered orally to rabbits of groups 1 and 3 daily for 60 days in a dose of 1.5 mg/kg. The animals of groups 2 and 4 received placebo. After 14 days from the beginning of the experiment rabbits of groups 2 and 3 were infected with M.bovis Bovinus-8. The antibody genesis dynamics was determined using indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on home-made antigens and multiplex immunoassay. The diagnostic significance of the antigens was confirmed by analytical electrophoresis and immunoblot. Results. The antibody response of infected animals (group 2) was detected since the 14th day after inoculation.Thus level of serum antibodies was stable until the end of the observation period (42 days), and the optical density reached 1.177 OD with M.bovis Bovinus-8 cell extract and 0.238 OD with their secondary metabolites. There was a specific antibody synthesis delay of up to 28-42 days in rabbits infected after preliminary intoxication (group 3). ELISA results of uninfected animals (groups 1 and 4) did not exceed 0.179 OD and 0.078 OD for those antigens, respectively. Using multiplex immunoassay it was established that the production of specific antibodies inM.bovis infected rabbits (group 2) was started on the 7th day, reaching the maximum values (greater than 50.000 RLU) on days 21-42.The evident suppression of antibody genesis observed in the group 3, when the maximum values did not exceed 9.000 RLU. The signals did not exceed the average background level (500 RLU) in rabbits of groups 1 and 4. Conclusion. It was found that cadmium chloride intoxication leads to inhibition of specific antibody production in M.bovisinfected rabbits what was demonstrated by multiplex immunoassay and ELISA.
KEYWORDS: tuberculosis, antigens, heavy metals, ELISA, Western Blot.
References
1. Analiz zabolevaemosti naseleniya i opredeleniye yeye vzaimosvyazi s faktorami okruzhayuschey sredi [Problems of revealing the interrelation between of environmental factors and diseases of population living in urban areas] / N.K.Dyusembaeva, A.E.Shpakov, B.M.Salimbaeva, E.A.Drobchenko // NauchniyAlmanakh. - 2015. - Vol.3, 5. - P. 132-138.
2. Kryazhev, D.A. Kompleksnaya otsenka nekantserogennogo riska na zdorovye naseleniya monogorodov i selskikh poseleniy ot vozdeystviya zagrayznyayuschikh khimicheskikh veschestv [Comprehensive assessment ofanon-cancer risk on the population health of mono-towns and rural settlements from a chemical pollutant exposure] / D.A.Kryazhev, M.V.Boev, L.M.Tulin // Almanakh molodoy nauki. - 2015. - Vol. 3. - P.3-8.
3. Akhmetzyanova, F.K. Soderzhaniye tyazhyolikh metallov v kormakh i molokye korov v regionye neftedobichi [Heavy metals content in forages and cow milk at the oil production areas] / F.K.Akhmetzyanova, G.G.Ilyazov, L.P.Zaripov, R.R.Zaysanov // Uchyoniye zapiski KGAVM. - 2005. - Vol.180. - P.9-16.
4. Donnik, I.M. Okruzhayuschaya sreda i zdorovye zhivotnikh [Environment and health of animals] / I.M.Donnik, I.A.Shkuratova // Veterinarya Kubani. - 2011. - Vol. 2. - P. 12-13.
5. Izucheniye vliyaniya polikhlorirovannikh bifenilov i tyazhyolikh metallov na pokazateli immunnoy sistemi v eksperimentye [Influence of polychlorinated biphenyls and heavy metals on immune system indexes in experimental study] / I.A.Zastenskaya, N.P.Piven, V.V.Kochubinsky, V.V.Kochubinski // Toksikologicheskiy vestnik. - 2014. -Vol. 2. - P. 28-31.
6. Ekologo-biologicheskiye osobennosti krupnogo rogatogo skota v usloviyakh tekhnogeneza [Ecological, biological characteristics of cattle in technogenesis] / I.A.Shkuratova, I.M.Donnik, A.G.Isayeva, A.S.Krivonogova // Voprosi normativno-pravovogo regulirovaniya v veterinarii. - 2015. - Vol. 2. - P. 366-369.
7. Loretz, O.G. Sostoyaniye zdorovya i molochnaya produktivnost korov v promishlennikh regionakh [Heals status and dairy productivity of cows in industrial areas] / O.G.Loretz, M.I.Barashkin // Veterinarnaya patologiya. - 2012. - V.40, №2. - P. 113-115.
8. Yeskov,Ye.K.Atomno-adsorbtsionnoye i gistohimicheskoye izucheniye akkumulyatsii svintsa i kadmiya rasteniyami, proizrastayuschimi v blizi avtomagistrali [Atomic adsorptive and gystochemical study of lead and cadmium accumulation by plants, which grow hear] / Ye.K.Yeskov,M.D.Yeskova, L.V.Seraya // VestnikRossiyskoyakademiiselskokhozyaystvenni khnauk. - 2012. - Vol. 2. - P. 62-63.
9. Razvitiye adaptatsionnikh mekhanizmov u samok belikh kris v otvet na vozdeystviye ionov kadmiya [Development of adaptation mechanisms in white female rats in response to exposure to cadmium ions] / Ye.V.Stepanova [idr.] // Toksikologicheskiyvestnik. - 2008. - Vol. 3. - P. 23-27.
10. Dinamika nakopleniya ekotoksikantov v biologicheskikh resursakh regionov s intensivnoy antropogennoy nagruzkoy [Accumulation dynamics of ecotoxicants in biological resources in the region of intense anthropogenic] / I.M.Donnik, I.A.Shkuratova, E.I.Khasina, E.V.Yakubenko // Veterinariya Kubani. - 2012. - Vol. 6. - P. 21-24.
11. Dmytrukha, N.N. Izmeneniya v immunnikh organakh kris pri subkhronicheskoy intoksikatsii svintsom i kadmiem [Immune organs changes in rats during subchronic lead and cadmium intoxication] / N.N.Dmitrukha // Biologiyatvarin. -2010. - Vol.12, №2. - P. 403-408.
12. Mehra, R. Hair as an indicator for assessing adverse effect of cadmium on human health / R.Mehra, M.Juneja // J Environ Sci Eng. - 2005. - Vol.47, №1. - P. 59-64.
13. Evaluation of arsenic, cadmium, lead, nickel, and zinc in biological samples (scalp hair, blood, and urine) of tuberculosis and diarrhea male human immunodeficiency virus patients / H.I.Afridi [et al.]// Clin Lab. - 2011. - Vol.57, №11-12. - P. 867-878.
14. Bozelka, B.E.Increased mortality of cadmium-intoxicated mice infected with the BCG strain of Mycobacterium bovis / B.E.Bozelka, P.M.Burkholder //J Reticuloendothel Soc. - 1979. - V.26, №3. - P. 229-237.
15. Vliyaniye intoksikatsii stoykimi organicheskimi zagryaznitelyami i tyazhyolimi metallami na techeniye tuberkulyoznoy infektsii [Influence of exposure to persistent organic pollutants and heavy metals on the development of tuberculosis infection] / I.A.Zastenskaya, A.P.Lysenko, V.V.Kochubinsky, A.V.Kochubinsky // Toksikologicheskiyvestnik.
- 2014. - Vol. 3. - P. 18-21.
16. Valeeva, A.R. Nekotoriye fiziologicheskiye i biokhimicheskiye pokazateli krolikov pri patogenezye tuberkulyoza na fonye intoksikatsii tayzhyolimi metalami [Some physiological and biochemical indices of rabbits in the pathogenesis of tuberculosis on a background of heavy metal intoxication]/ A.R.Valeeva, R.M.Akhmadeev, Z.Z.Aleeva// Aktualniye napravleniya innovatsionnogo razvitiya zhivotnovodstva i veterinarnoy meditsini: mat.Vseross.naych.-prakt. konf. S mezhdunar. uchastiem. - Ufa:Bashkirskiy GAU, 2014. - P. 16-18.
17. Pathomorfologicheskiye izmeneniya u krolikov pri zarazhenii Micobacterium bovis na fonye khronichyeskoy intoksikatsii tayzhyolimi metalami [Pathomorphological lesions in M.bovis infected rabbits underheavy metal chronic intoxication] / A.R.Valeeva, V.A.Konyukhova, N.A.Khismatullina, R.M.Akhmadeev, E.A.Shuralev, M.N.Mukminov // Voprosi normativno-pravovogo regulirovaniya v veterinarii. - 2015. - №2. - P. 28-30.
18. Khismatullina, N.A. Sravnitelnaya otsenka effektivnosti skhem immunizatsii krolikov dlya polucheniya diagnosticheskikh sivorotok pri tuberkulyoze [Comparative estimation of the effectiveness of rabbit immunization schemes for the production of tuberculosis diagnostic sera] / N.A.Khismatullina, A.M.Gulyukin, E.A.Shuralev, K.S.Khaertynov, R.M.Akhmadeev // Biotekhnologiya: realnost i perspektivi: materiali Mezhdunar. nauch.-prakt. konf.
- Saratov,2014. - P. 218-219.
19. Patent 2390559 Rus. Federation, IPC 12N7/00 Sposob polucheniya antigena iz Micobacterium tuberculosis [A method for producing Micobacterium tuberculosis antigen] / I.M.Khaertynova, A.P.Tsibulkin, R.Sh.Valiev, O.M.Romanenko, K.S.Khaertynov, N.G.Urazov; patent applicant and owner: GOU VPO Kazan State medical university. -№ 2008141939/13;applied on 22.10.2008; published on 27.05.2010.
21. Sposob polucheniya antigena s molekulyarnoy massoy 45 kDa iz Mycobacterium tuberculosis [A method for obtaining an antigen with a molecular weight of 45kDa from Mycobacterium tuberculosis] / E.Alfredo [i dr.] // Fundamentalnie issledovaniya. - 2013. - Vol. 1-1. - P. 18-22.
22. Multipleksniy IFA skhem ilyuminestsentnoy metkoy dlya diagnostiki tuberkulyoza u kabanov [Assessment of antigen specificity for diagnostics of tuberculosis in wild boars] / E.A.Shuralev [i dr.] // Veterinariya. - 2013.
- Vol. 2. - P. 25-28.
23. Shuralev E.A. Sravnitelniy analiz test-sistem dlya diagnostiki tuberkulyoza u alpak [Comparison of test-systems for detection of tuberculosis in alpacas] / E.A.Shuralev // Veterinarniyvrach. - 2012. - Vol. 5.- P. 30-33.
