CC BY
31УДК 619:599.735.5:616-002.5:579.873.21:616-097
СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД PMPB70 ВЫЯВЛЯЕТ СПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
12Э.А.Шуралев - кандидат ветеринарных наук, доцент, вед.н.с.; 1Т.Х.Фаизов - доктор ветеринарных наук, профессор, зав. лабораторией; 1Н.И.Хаммадов - кандидат биологических наук, вед.н.с.;
1К.А.Осянин - кандидат биологических наук, ст.н.с.; 1К.В.Усольцев - кандидат ветеринарных наук, вед.н.с.; 2Н.М.Александрова - кандидат биологических наук, вед.н.с.
1ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420008, г. Казань, Научныйгородок-2, тел. +7(843) 239-53-20, e-mail: vnivi@mail.ru) 2ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г.Казань (420008, г.Казань, ул.Кремлевская, 18, тел.+7(843) 233-71-09, e-mail:public.mail@kpfu.ru).
Рассматривается оценка антигенной активности сконструированного синтетического полипептида иммуно-генного эпитопа MPB70 для выявления специфических антител при туберкулезе крупного рогатого скота (КРС). Биоинформационным анализом была определена антигенная детерминанта белка MPB70, наиболее специфичная для вирулентных штаммов Mycobacterium bovis. Далее был сконструирован и синтезирован полипептид pMPB70m, который использовали в качестве антигена в иммуноферментном анализе (ИФА). Показания читки реакции ИФА с образцами проб сыворотки крови 54 животных из благополучных хозяйств составляли 0,050...0,350 OD, что интерпретируется как отрицательный результат. При исследовании 47 образцов сыворотки крови КРС из неблагополучных по туберкулезу хозяйств методом ИФА, антитела кpMPB70m выявлялись на высоком уровне (0,500.3,500 OD) у 19 животных и интерпретировались как положительные, у 6 животных - они были на низком уровне (0,360. 0,470 OD) и интерпретировались как сомнительные. У 22 животных специфические антитела не выявлялись, а результаты читки реакции находились в диапазоне 0,050.0,350 OD, что интерпретируется как отрицательный результат. Средние значения показателя оптической плотности результатов ИФА в группах составили: 0,175±0,102 OD для отрицательных, 0,415±0,044 OD - для сомнительных, и 1,199±0,788 OD - для положительных проб. Статистически подтверждено, что интерпретация результатов ИФА с антигеном pMPB70m достоверна (p<0,05) при использовании критериев: <0,350 OD - результат отрицательный; 0,350.0,500 OD -результат сомнительный; >0,500 OD - результат положительный. Таким образом, установлена высокая антигенная активность pMPB70m для выявления специфических антител при туберкулезе КРС.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Mycobacterium bovis, туберкулез, крупный рогатый скот, антигены, антитела, серологическая диагностика.
Туберкулез остается одной из главных проблем современности и создание современных высокоэффективных методов диагностики этого заболевания является актуальным. В настоящее время для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота (КРС) используется туберкулиновый тест, который последние годы становится малоэффективным в борьбе с этим заболеванием. Регулярно выявляются животные с неспецифическими реакциями на туберкулин, связанными, в том числе, и с циркуляцией нетуберкулезных микобактерий [1], что требует усовершенствования их дифференциации. С этой целью продолжается работа по повышению эффективности симультанной туберкулиновой пробы с ППД для млекопитающих и комплексного аллергена из атипичных микобактерий [2]. Проводятся испытания нового ре-комбинантного аллергена [3].
С другой стороны, существует проблема перси-стирования L-форм Mycobacterium bovis в организме КРС с латентным течением заболевания, способных реверсировать в исходный бактериальный вид, что является фактором рецидива туберкулеза в оздоров-
ленных хозяйствах [4]. Такие животные часто дают отрицательную реакцию на туберкулин, а для эффективной диагностики скрытых форм туберкулеза требуются более глубокие исследования иммунного статуса животных с определением фагоцитарной активности крови и цитохимическим исследованием лейкоцитов на миелопероксидазу [5].
Большие успехи достигнуты в совершенствовании ПЦР-индикации M.bovis [6, 7], но диагностическая эффективность данного метода высока только при пост-мортальных исследованиях.
Для более совершенного контроля распространения инфекционных заболеваний необходимы инновационные подходы, с использованием современных иммуноаналитических и молекулярно-биологических методов. При этом актуальной проблемой в борьбе с туберкулезом остается прижизненная лабораторная диагностика данного заболевания у КРС и других видов животных. Поиск высокоспецифичных антигенов М.Ьомв и МАиЬегси1ов'1в даёт предпосылки внедрения в ближайшем будущем серологической, в том числе дифференциальной, диагностики туберкулеза [8,
9]. Особое место в этом направлении занимают им-мунохроматографические экспресс-тесты [10, 11]. Успешные результаты получены при использовании тест-системы на основе дот-блот иммунофермент-ного анализа для проведения скрининговых исследований на туберкулез [12]. Более информативными в этом плане являются мультиплексные технологии, позволяющие проводить анализ с выявлением антител к нескольким антигенам одновременно [13].
Одним из перспективных направлений является разработка серологических тест-систем на основе синтетических пептидов иммуногенных эпитопов антигенов M.bovis [14]. Ранее проведенными исследованиями были выявлены микобактериальные белки, среди которых потенциальными антигенными свойствами обладают секреторные (ESAT-6 и CFP-10) и структурные (MPB70 и MPB83) белки [15], которые также позволяют дифференцировать вакцинированных BCG и инфицированных M.bovis животных [16] и идентифицировать животных со скрытым течением туберкулеза, реагирующих отрицательно на туберкулин [17].
Целью данной работы была оценка антигенной активности сконструированного синтетического полипептида иммуногенного эпитопа белка MPB70 для выявления специфических антител при туберкулезе КРС.
Материалы и методы. Для конструирования синтетического антигена на основе аминокислотных последовательностей иммуногенного эпитопа (антигенных детерминант) белка MPB70 (M. bovs) применяли методы биоинформатики с использованием инструментов программы «Standard Protein BLAST» и ресурсов базы данных «National Center for Biotechnology Information» (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Для определения основных физико-химических показателей пептидов на стадии конструирования использовали программу «Peptide property calculator» («Innovagen AB», Швеция) (https://pepcalc.com/). Синтез сконструированных пептидов провели в компании ООО «АТг Сервис Ген». Полученный материал подвергли хрома-тографическому анализу на чистоту целевого продукта. Данный синтетический полипептид использовали в качестве испытуемого антигена.
Биологическим материалом для исследований служили пробы сыворотки крови КРС из неблагополучных (n=47) и благополучных (n=54) по туберкулезу хозяйств (из коллекции ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»).
Сыворотки крови исследовали иммунофер-ментным анализом (ИФА). Антиген в концентрации 5 мкг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,0) иммобилизировали на дно лунок высокосвязы-вающих планшет (Corning) в течение 16 ч при t 40С с последующей 4-х кратной промывкой фосфатно-бу-ферным раствором с 0,05% твина-20 (ФБР-Т). В лунки планшет вносили блокирующий буфер (ФБР-Т с 1% блокирующего агента (БА)) с экспозицией 2 ч при t 370С с последующей 4-х кратной промывкой ФБР-Т. Сыворотки крови в разведении 1:200 в ФБР-Т с 1% БА
инкубировали в течение 60 мин при t 300С с последующей 4-х кратной промывкой ФБР-Т. Далее вносили кроличьи антитела против IgG КРС, меченные перок-сидазой хрена (Sigma-Aldrich), которые инкубировали в течение 30 мин при t 300С с последующей 4-х кратной промывкой ФБР-Т. Визуализацию продуктов реакции проводили при помощи тетраметилбензидинового субстрата (ТМБ), который инкубировали в течение 15 мин при 300С, с последующей остановкой реакции 0,1М серной кислотой. Читку реакции осуществляли на спектрофотометре Multiskan GO (Thermo Scientific), при этом оценивали уровень антител в оптических единицах (OD) при длине волны 450 нм.
При статистической обработке результатов использовали программу ANOVA (Vassar Stats) (http:// vassarstats.net/), определили показатели: среднее значение (M), стандартное отклонение (m), медиана (F(x)), максимальное (Xmax) и минимальное (Xmin) значения, коэффициент асимметрии (y1), дисперсия случайной величины (D[X]), коэффициент эксцесса (y2). Для оценки достоверности результатов определяли показатель Student's t-test.
Результаты исследований. Используя базы данных PubMed, определена антигенная детерминанта (иммуногенный эпитоп) белка MPB70, наиболее специфичная для вирулентных штаммов M.bovis. В результате был сконструирован полипептидный антиген pMPB70, который имеет следующую аминокислотную последовательность: SVQGMSQDPVAVAASNNPEL.
В виду низкой адсорбции синтетического полипептида к белковому носителю N-конца, была необходима его модификация без потери функционально важных участков. Нами была проведена модификация полипептида (pMPB70m) с добавлением линк-после-довательности (L-), после чего вновь были оценены физико-химические показатели (табл. 1). Модификацией было увеличено количество аминокислотных последовательностей до 25, молекулярная масса составила 2431 г/моль. Добавление линк-последова-тельности не повлияло на коэффициент экстинкции, а показатели изоэлектрической точки и суммарного заряда сдвинулись в более эффективную позицию. Растворимость в воде синтетического полипептида pMPB70m после модификации также повысилась. Однако для такого рода пептидов необходима предварительная обработка с использованием ДМСО и/или раствора с крайне щелочной рН.
Полученный синтетический полипептид был исследован на чистоту целевого продукта хроматогра-фическим методом. Чистота продукта составила 98%. Синтезированный полипептид удовлетворял поставленным при дизайне и конструировании требованиям, что позволило использовать его в дальнейшем в качестве антигена в ИФА.
Для интерпретации полученных результатов ИФА с pMPB70m использовали следующие критерии оценки:
Таблица 1
Основные характеристики сконструированного полипептида pMPB70 и его модифицированного вариантаp MPB70m
Показатель pMPB70 pMPB70m
Химическая формула последовательности C83H136N24O32S1 C99H164N30039S1
Количество аминокислотных остатков 20 25
Молекулярная масса 2014 г/моль 2431 г/моль
Коэффициент экстинкции 0 M-1cm-1 0 M-1cm-1
Изоэлектрическая точка pI = pH 0,63 pI = pH 3,93
Суммарный заряд при рН=7 - 2 - 1
- при значениях оптической плотности <0,350 ОЭ
- результат считается отрицательным,
- при значениях оптической плотности 0,350...0,500 ОЭ - результат считается сомнительным,
- при значениях оптической плотности >0,500 ОЭ
- результат считается положительным.
Показания читки реакции ИФА с образцами проб сыворотки крови 54 животных из благополучных хозяйств составляли 0,050.0,350 ОЭ (рисунок), что интерпретируется как отрицательный результат. При
исследовании 47 образцов сыворотки крови КРС из неблагополучных по туберкулезу хозяйств методом ИФА, антитела к синтетическому пептиду МРВ70 выявлялись на высоком уровне (0,500.3,500 ОЭ) у 19 животных и интерпретировались как положительные, у 6 животных - они были на низком уровне (0,360.0,470 ОЭ) и интерпретировались как сомнительные. У 22 животных специфические антитела не выявлялись, а результаты читки реакции находились в диапазоне 0,050.0,350 ОЭ, что интерпретируется как отрицательный результат.
Рис. Результаты ИФА к антигену pMPB70m с образцами сывороток крови КРС из благополучного и неблагополучного по туберкулезу хозяйств (пунктирной линией выделен участок, где результат
интерпретируется как сомнительный).
Отсутствие положительных результатов ИФА при исследовании 54 голов КРС из благополучного по туберкулезу хозяйства указывает на специфичность изучаемого антигена рМРВ70т и невозможность неспецифических реакций «антиген-антитело». Следовательно, положительные результаты ИФА с данным антигеном означают наличие специфических антител в исследуемой сыворотке крови, указывающих на развитие туберкулезного инфекционного процесса в организме животного.
В данном исследовании мы использовали 47 образцов сыворотки крови КРС из неблагополучного по туберкулезу хозяйства. Отбор проб крови осуществлялся до проведения туберкулинизации. Понятно, что среди этих 47 голов туберкулезный процесс был на разных стадиях, и, естественно, не всё поголовье было заражено. Этим объясняется разнообразие уровня антител к антигену рМРВ70т, выявляемого в ИФА.
К тому же белок MPB70 не во всех случаях приводит к образованию специфических антител в организме КРС, инфицированного M. bovis, о чем свидетельствуют ранее проведенные исследования с использованием рекомбинантного антигена MPB70 [15]. В связи с этим рекомендуется проводить исследования по выявлению сывороточных специфических антител к нескольким антигенам M. bovis [18].
Для получения ответа на вопрос о диагностической значимости сконструированного и синтезированного антигена был проведен статистический анализ полученных результатов ИФА в проекции сопоставления их согласно интерпретации: для отрицательной, сомнительной и положительной групп. Средние значения показателя оптической плотности результатов ИФА в группах составили: 0,175±0,102 OD для отрицательных, 0,415±0,044 OD для сомнительных, и 1,199±0,788 OD - для положительных проб (табл. 2).
Таблица 2
Статистические показатели результатов ИФА с антигеном pMPB70m
Группа M m F(x) X max X min Y1 D[X] Y2
Отрицательные 0,175 0,102 0,152 0,346 0,054 0,335 0,0103 1,514
Сомнительные 0,415 0,044 0,413 0,464 0,364 0,000 0,0019 0,000
Положительные 1,199 0,788 0,833 3,254 0,514 1,029 0,6230 3,120
В таблице даны следующие показатели: среднее значение (М), стандартное отклонение (т), медиана №)), максимальное (Хта)) и минимальное (Хт|п) значения, коэффициент асимметрии дисперсия случайной величины (Э[Х]), коэффициент эксцесса (у2).
Оценки различия в указанных группах по критерию Student's t-test (табл. 3) указывают на достоверность полученных результатов. Таким образом, статистически подтверждается, что в указанных выше условиях и режимах проведения ИФА с ан-
тигеном рМРВ70т интерпретация результатов будет достоверной при использовании критериев: < 0,350 ОЭ - результат отрицательный; 0,350...0,500 ОЭ - результат сомнительный; > 0,500 ОЭ - результат положительный.
Таблица 3
Достоверность различий в разных группах для p<0,05
Показатель Сравниваемые группы
положительная v's отрицательная сомнительная v's положительная сомнительная v's отрицательная
Степень свободы 19 18 20
Абсолютное распределение Стьюдента 5,619 4,314 8,570
Критическое распределение Стьюдента 2,093 2,101 2,086
Абсолютное > критическое ДА ДА ДА
Результат достоверно достоверно достоверно
Статистической обработкой результатов установлена высокая антигенная активность сконструированного синтетического полипептида рМРВ70т для выявления специфических антител при туберкулезе КРС. Полученные данные открывают перспективы серологической диагностики туберкулеза КРС, эффективность (высокая чувствительность и специфичность) которой можно будет достичь при использовании также
синтетических полипептидов антигенных детерминант и других антигенов (ЕБДТ-6, СРР-10, МРВ83 и других) в комбинации с антигеном рМРВ70т, что определяет дальнейшую научную работу в этом направлении.
Заключение. Биоинформационным анализом сконструирован синтетический полипепти-дантигенной детерминанты белка МРВ70 М.Ьо^я, физико-химические показатели которого после
модификации с добавлением линк-последователь-ности (рМРВ70т) были удовлетворительными для использования последнего в качестве антигена в ИФА. Проведенными исследованиями проб сыворотки крови КРС, установлена и подтверждена высокая антигенная активность синтетического
полипептида рМРВ70т для выявления специфических антител при туберкулезе. Дальнейшие исследования секреторных и структурных белков М.Ьоу'я позволят подобрать комбинации синтетических антигенов для эффективной серологической диагностики туберкулеза КРС.
Литература
1. Проблема неспецифических реакций на туберкулин и совершенствование симультанной пробы для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота / А.Х.Найманов, Г.И.Устинова, Н.Г.Толстенко [и др.] // Ветеринария. - 2015. - № 6. - С. 20-25.
2. Совершенствование симультанной туберкулиновой пробы для дифференциации неспецифических реакций у КРС / А.Х.Найманов, Г.И.Устинова, Н.Г.Толстенко [и др.] // Ветеринария и кормление. - 2016. - № 1. - С. 11-13.
3. Ощепков, В.Г. Новый перспективный аллерген (НРА) для диагностики туберкулеза у животных / В.Г.Ощеп-ков, Н.Н.Кощеев // Достижения науки и техники АПК. - 2015. - Т. 29, №10. - С. 91-94.
4. Макаров, Ю.А. Выявление некультивируемых форм микобактерий туберкулеза при латентном течении инфекции / Ю.А.Макаров, Н.Е.Горковенко, И.Ю.Макаров // Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии». - 2017. - № 2. - С. 54-58.
5. Макаров, Ю.А. Выявление крупного рогатого скота со скрытым течением туберкулезной инфекции / Ю.А. Макаров, Н.Е.Горковенко // Ветеринария Кубани. - 2015. - № 6. - С. 4-5.
6. ПЦР на современном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота / А.Х.Найманов, Е.П.Вангели, Н.Г.Толстенко [и др.] // Ветеринария. - 2016. - № 2. - С. 20-23.
7. Дифференциальная диагностика туберкулеза у человека и животных с применением мультиплексной тест-системы / Н.М.Александрова, Н.И.Хаммадов, Э.А.Шуралев [и др.] // Молекулярная диагностика 2017: сб. трудов IX Всерос. науч.-практ. конф. с Mеждунар. участием. - М: ООО фирма "Юлис", 2017. - С. 493.
8. Валеева, А.Р. Влияние интоксикации кадмием на антителогенез кроликов при экспериментальном инфицировании Mycobacterium bovis / А.Р.Валеева // Ветеринарный врач. - 2016. - № 3. - С. 48-55.
9. Функционирование и серологическая активность экстракта клеток и продуктов экспрессии Mycobacterium bovis / Э.А.Шуралев, К.С.Хаертынов, А.Р.Валеева [и др.] // Ветеринария и кормление. - 2017. - № 3. - С. 103-105.
10. Изыскание экспресс метода диагностики туберкулеза крупного рогатого скота / Р.Г.Ильязов, Т.А.Яхно, Р.А.Хамзин [и др.] // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2014. - Т. 220, №4. - С. 115-118.
11. Использование экспресс-теста Bovine TB для проведения скрининговых исследований на туберкулез крупного рогатого скота / Д.Н.Мингалеев, Р.Х.Равилов, Н.И.Садыков [и др.] // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2016. - Т. 225, №1. - С. 50-52.
12. Джакаит, Д.А. Дот-блот ИФА тест-система для выявления антител к микобактериям туберкулеза крупного рогатого скота / Д.А.Джакаит // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана. - 2017. - Т. 231. - С. 37-40.
13. Выявление специфических антител у вапити при туберкулезе / Э.А.Шуралев, М.Н.Мукминов, К.Велан [и др.] // Ветеринария. - 2013. - № 8. - С. 54-57.
14. Шуралев, Э.А. Микобактериальные антигены: синтетические пептиды и рекомбинантные белки / Э.А. Шу-ралев // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. -2013. - Т. 216. - С. 403-407.
15. Multiplex immunoassay for serological diagnosis of Mycobacterium bovis infection in cattle / C.Whelan, E.Shuralev, G.O'Keeffe [et al.] // Clinical and Vaccine Immunology. - 2008. - Vol. 15 (12). - P. 1834-1838. doi: 10.1128/ CVI.00238-08.
16. Performance of the Enferplex TB assay with cattle in Great Britain and assessment of its suitability as a test to distinguish infected and vaccinated animals / C.Whelan, A.O.Whelan, E.Shuralev [et al.] // Clinical and Vaccine Immunology. - 2010. - Vol. 17 (5). - P. 813-817. doi: 10.1128/CVI.00489-09.
17. Use of a multiplex enzyme-linked immunosorbent assay to detect a subpopulation of Mycobacterium bovis-infected animals deemed negative or inconclusive by the single intradermal comparative tuberculin skin test / C.Whelan, E.Shuralev, H.F.Kwok [et al.] // Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. - 2011. - Vol. 23 (3). - P. 499-503.
18. Мультиплексный иФа с хемилюминесцентной меткой для диагностики туберкулеза у кабанов / Э.А.Шуралев, М.Н.Мукминов, А.Р.Валеева [и др.] // Ветеринария. - 2013. - № 2. - С. 25-28.
SYNTHETIC POLYPEPTIDE PMPB70 DETECTS SPECIFIC ANTIBODIES IN CATTLE WITH TUBERCULOSIS
12Shuralev E.A. - Candidate of Veterinary Sciences; 1Faizov T.Kh. - Doctor of Veterinary Sciences, Professor;
1Khammadov N.I. - Candidate of Biological Sciences; Osyanin K.A. - Candidate of Biological Sciences;
1Usoltsev K.V. - Candidate of Veterinary Sciences; 1,2Aleksandrova N.M. - Candidate of Biological Sciences.
1Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: vnivi@mail.ru).
2Kazan Federal University, Kazan (e-mail: public.mail@kpfu.ru).
The evaluation of the antigenic activity of the engineered synthetic polypeptide of the immunogenic epitope MPB70 for the detection of specific antibodies in cattle tuberculosis (CRS) is considered. Using the bioinformatic analysis, the antigenic determinant of the MPB70 protein, the most specific for the virulent strains of Mycobacterium bovis, was determined. At the next step, a polypeptide pMPB70m was designed and synthesized which was used as an antigen in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The readings of the IFA response with serum samples from 54 animals from healthy farms were 0.050 ... 0.350 OD, which was interpreted as a negative. When 47 samples of blood serum from the farm with persisting tuberculosis were tested by ELISA, the antibodies to pMPB70m were detected at a high level (0.500 ... 3.500 OD) in 19 animals and were interpreted as positive, in 6 animals the results were at a low level (0.360... 0.470 OD) and interpreted as. Inconclusive. In 22 animals, the specific antibodies were not detected, and the ELISA results were in the range of 0.050... 0.350 OD, which were interpreted as negative. The ELISA mean values of the optical density in the groups were: 0.175+0.102 OD for negative, 0.415±0.044 OD for inconclusive, and 1.199±0.788 OD for positive samples. The interpretation of the ELISA results with the antigen pMPB70m was statistically confirmed to be reliable (p<0.05) when using the criteria: <0.350 OD - the result was negative; 0.350... 0,500 OD - the result was inconclusive; >0.500 OD - the result was positive. Thus, the high antigenic activity of pMPB70m for the detection of specific antibodies in cattle with tuberculosis was confirmed.
KEYWORDS: Mycobacterium bovis, tuberculosis, cattle, antigens, antibodies, serological diagnosis.
References
1. Problema nespetsificheskikh reaktsii na tuberkulin i sovershenstvovaniye simultannoi probi dlya diagnostiki tuberkuleza krupnogo rogatogo skota [The problem of nonspecific reaction to tuberculin and development of simultaneous probe for bovine tuberculosis diagnostics] / A.H.Naymanov, G.I.Ustinova, N.G.Tolstenko [et al.] // Veterinariya. - 2015.
- № 6. - P. 20-25.
2. Sovershenstvovaniye simultannoi tuberkulinovoi probi dlya differentsiatsii nespetsificheskikh reaktsii u KRS [Development of simultaneous probe for differentiation of nonspecific reactions in cattle] / A.H.Naymanov, G.I.Ustinova, N.G. Tolstenko [et al.] // Veterinariya i kormleniye. - 2016. - № 1. - P. 11-13.
3. Oschepkov, V.G. Novyi perspektivnyi allergen (NPA) dlya diagnostiki tuberkuleza u zhivotnikh [New promising allergen (NRA) for the diagnosis of tuberculosis in animals] / V.G.Oschepkov, N.N.Koshcheev // Dostizheniya nauki i tekhniki APK. - 2015. - № 29 (10). - P. 91-94.
4. Makarov, Yu.A. Viyavleniye nekultiviruyemykh form mikobakterii tuberkuleza pri latentnom techenii infektsii [Detecting noncultivated forms Mycobacteria of tuberculosis at the latent course of an infection] / Yu.A.Makarov, N.E.Gorkovenko, I.Yu.Makarov // Rossiysky zhurnal «Problemy veterinarnoi sanitarii, gigieny i ekologii». - 2017.
- № 2. - P. 54-58.
5. Makarov, Yu.A. Viyavleniye krupnogo rogatogo skota so skritym techeniem tuberkuleznoy infektsii [Identification of cattle with a hidden course of tuberculosis infection] / Yu.A.Makarov, N.E.Gorkovenko // Veterinariya Kubani. - 2015.
- № 6. - P. 4-5.
6. PCR na sovremennom etape borbi s tuberkulezom krupnogo rogatogo skota [Using PCR for bovine tuberculosis control in the present time] / A.K. Naimanov, E.P. Vangely, N.G. Tolstenko [et al.] // Veterinariya. - 2016. - № 2. - P.20-23.
7. Differentsialnaya diagnostika tuberkuleza u cheloveka i zhivotnikh s primeneniem multipleksnoi test-sistemy [Differential diagnostics of tuberculosis in humans and animals using a multiplex test system] / N.M.Aleksandrova, N.I.Khammadov, E.A.Shuralev [et al.] // Molekularnaya diagnostika 2017: proceedings of IX Russian research conference with international participation. - M.: «Yulis», 2017. - P. 493.
8. Valeeva, A.R. Vliyaniye intoksikatsii kadmiyem na antitelogenez krolikov pri eksperimentalnom infitsirovanii Mycobacterium bovis [Cadmium-intoxication impact on antibody response of experimentally Mycobacterium bovis infected rabbits] / A.R.Valeeva // Veterinarny vrach. - 2016. - № 3. - P. 48-55.
