CC BY
16Токсикологический вестник (111)
УДК 615.03:616-085 Шилов Ю.В. , Носов А.В., Гребенюк А.Н.
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, г Санкт-Петербург
Влияние интерлейкина-ф
на выживаемость и среднюю
продолжительность
мышей при острой интоксикации
5-фторурацилом, циклофосфамидом,
2.2-дихлордиэтилсульфидом
Проведена экспериментальная оценка эффективности терапевтического применения
интерлейкина-^ по критериям выживаемости и средней продолжительности жизни погибших животных у мышей при интоксикации 5-фторурацилом, циклофосфамидом, 2.2-дихлордиэтилсульфидом. Показано, что применение интерлейкина-1р через 24 ч после введения 5-фторурацила или циклофосфамида увеличивает выживаемость мышей.
Ключевые слова: цитотоксиканты, лейкопения, интерлейкин-ф, терапия, лабораторные животные (мыши).
Введение. Цитотоксиканты - большая группа высокотоксичных веществ, включающая боевые отравляющие вещества (иприт, люизит, ипритно-люизитные смеси), некоторые промышленные агенты (бензол, этиленоксид, тринитротолуол и др.), лекарственные препараты (циклофосфамид, трометамин/кеторолак, азатиоприн и др.). Поражение ими возможно в ходе боевых действий, при химических авариях и катастрофах, не исключено применение цито-токсикантов с диверсионными и террористическими целями [2, 3, 7, 10]. Разработка новых средств и методов лечения поражений цитотоксическими ядами является одной из актуальных проблем современной токсикологии [6].
Хорошо известно, что цитоксиканты в первую очередь поражают активно делящиеся клетки, к которым относятся и кроветворные клетки, тем самым формируют цитопени-ческий синдром и подавляют иммунную систему. При тяжелых отравлениях изменения в крови устойчивы и носят закономерный характер. В связи с этим с особой остротой встает проблема разработки новых средств лечения поражений цитотоксикантами, эффект которых был бы обусловлен вмешательством в ключевые звенья патогенеза поражений этими ядами, в частности, направлен на снижение выраженности миелодепрессии. Весьма перспективным для решения этой задачи представляется применение средств, оказывающих стимулирующее влияние на гемо- и иммунопоэз. Таким действием обладают цитокины - эндогенные медиаторы, посредством которых работа различных клеток гемопоэтической системы становится скоординированной и регулируемой [4].
Особый интерес в этом плане представляют препараты интерлейкина-lß - ключевого медиатора гемопоэза, регулирующего процессы пролиферации и дифференцировки, а также функциональную активность клеток иммунной и гемопоэтической систем [1], тем самым способствующего восстановлению нарушенного вследствие токсического воздействия костномозгового кроветворения. Однако вопрос о терапевтической эффективности интерлейкина-1
ß (ИЛ-lß) при лейкопеническом синдроме, формируемом цитотоксикантами с различными механизмами токсического действия в дозах, вызывающих отравление тяжелой степени, не решен, что требует проведения дальнейших исследований.
Материалы и методы исследования. Экспериментальные исследования проведены на 432 белых нелинейных мышах-самцах с массой тела 20-22 г, полученных из питомника РАМН «Рапполово» (пос. Рапполово Ленинградской обл.). Эксперименты проводили в соответствии с «Правилами лабораторной практики» (Приказ Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г №708 н).
В качестве цитотоксикантов в работе использовали фармакопейные препараты «5-Фто-рурацил-Эбеве» (5-ФУ) производства EBEWE Pharma (Австрия) и препарат циклофосфамида «Эндоксан» (ЦФ) производства Baxter Oncology (Германия), а также химически чистый 2.2-дихлордиэтилсульфид (2.2-ДХДЭС).
5-ФУ экспериментальным животным вводили внутрибрюшинно однократно в дозах 225, 250, 275, 300 и 350 мг/кг (0,8; 0,9; 1,0; 1,1 и 1,3 лД50 соответственно), ЦФ вводили внутрибрюшинно однократно в дозах 450, 500, 550 и 600 мг/кг (0,8; 0,9; 1,0 и 1,1 ЛД50 соответственно). 2.2-дихлордиэтилсульфид (2.2-ДХДЭС) экспериментальным животным вводили подкожно в основание складки области пояса передних конечностей в дозах 5, 6 и 8 мг/кг (0,8; 1,0 и 1,3 ЛД50 соответственно). Рабочий раствор 2.2-ДХДЭС готовили непосредственно перед введением путем растворения в глицерине из расчета 0,1 мл на 10 г веса.
В работе использовался рекомбинантный ИЛ-^lß человека производства Государственного научно-исследовательского института особо чистых биопрепаратов Федерального медико-биологического агентства (г. Санкт-Петербург). Препарат экспериментальным животным вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мкг/кг (1 мкг/особь) через 1 ч или 24 ч после введения цитотоксикантов, разведенным в 0,2 мл физиологического раствора. Животные контрольных
групп вместо ИЛ-^lß получали 0,2 мл физиологического раствора по той же схеме и в те же сроки, что и животные опытных групп.
Оценку выживаемости и средней продолжительности жизни мышей, подвергшихся воздействию цитотоксикантов, проводили в течение 30 сут после введения токсикантов. Для этого ежедневно учитывали количество павших и оставшихся в живых животных, динамику их гибели. По итогам 30-ти суточного наблюдения рассчитывали процент павших и выживших особей, индекс терапевтической эффективности, а также среднюю продолжительность жизни погибших в результате токсического воздействия животных.
Статистический анализ токсичности и фармакологической активности соединений проводили методом пробит-анализа (по Финни). Проверку значимости различий в выживаемости леченных и нелеченных животных осуществляли с помощью точного метода Фишера, среднюю ошибку альтернативных показателей определяли по таблицам Генесса.
Результаты и обсуждение. В результате проведенных исследований было установлено,
что в группе животных, получивших 5-ФУ в дозах 1,1 ЛД50 и 1,3 ЛД50, летальность составила
65% и 89% соответственно (табл. 1). Применение ИЛ-1^ через 24 ч после введения цито-токсиканта приводило к снижению летальности на 30% и 45% соответственно и увеличению средней продолжительности жизни погибших животных на 2 сут. Выживаемость животных,
получивших ИЛ-1р через 24 ч после введения 5-ФУ в дозах менее 1,1 ЛД5о, не отличалась от контроля.
Применение ИЛ-1|3 через 1 ч после введения 5-ФУ в дозах 1,1 ЛД5о и 1,3 ЛД5о не оказывало существенного влияния на выживаемость животных. При использовании ИЛ-1|3 через 1 ч после введения 5-ФУ в дозах 0,8-1,0 ЛД5о отмечалась тенденция к увеличению гибели животных.
Таким образом, применение ИЛ-^ через 24 ч после введения 5-ФУ в высоких дозах (1,1 и 1,3 ЛД50) позволяло снизить гибель экспериментальных животных. Индекс терапевтической эффективности препарата составил 1,27. В тоже время, введение ИЛ-1р через 1 ч после введения 5-ФУ увеличивало смертность экспериментальных животных, а индекс терапевтической эффективности при таком режиме введения препарата составил 0,87.
Подобная закономерность наблюдалась и при применении ИЛ-1р после введения ЦФ. Как видно из результатов эксперимента, представленных в таблице 2, применение
ИЛ-1^ через 24 ч после введения ЦФ в дозах менее 1,1 ЛД50 не влияло на выживаемость животных, в то время как его применение после введения ЦФ в дозе 1,1 ЛД50 снижало летальность на 50%, хотя практически не влияло на среднюю продолжительность жизни погибших животных.
При использовании ИЛ-1р через 1 ч после введения ЦФ в дозах 0,8-1,0 ЛД50 отмечалась
тенденция к увеличению гибели экспериментальных животных. Введение ИЛ-^ через 1 ч после применения ЦФ в дозе 1,1 ЛД50 не влияло на выживаемость, но уменьшало среднюю продолжительность жизни погибших мышей на 3 сут.
Таким образом, применение ИЛ-1р через 24 ч после введения ЦФ в высоких дозах (1,1 ЛД50) позволяло снизить гибель экспериментальных животных, а индекс терапевтической эффективности препарата составил 1,28. Введение ИЛ-10 через 1 ч после введения цитоток-сиканта увеличивало смертность экспериментальных животных, индекс терапевтической эффективности при таком режиме введения препарата составил 0,89.
Как видно из данных, представленных в таблице 3, достоверных различий в выживаемости животных в опытных (получивших ИЛ-1^ через 1 или 24 ч после токсиканта) и контрольных группах при всех используемых дозах 2.2-ДХДЭС не наблюдалось.
Пик гибели животных, отравленных 2.2-ДХДЭС, приходился на первые 6-8 ч после введения цитотоксиканта, отдельные животные погибали в начале вторых суток с момента введения 2.2-ДХДЭС. Использование ИЛ-1^ в качестве терапевтического средства при обоих режимах введения не оказывало существенного влияния на динамику гибели мышей и среднюю продолжительность жизни животных, отравленных 2.2-ДХДЭС.
Заключение. Проведенные нами исследования показали, что при интоксикации мышей 5-ФУ или ЦФ в дозах, вызывающих отравление тяжелой степени, наиболее эффективным
было применение ИЛ-1^ через 24 ч после введения цитотоксиканта. Использование ИЛ-1р через 1 ч после введения 5-ФУ или ЦФ способствовало увеличению числа погибших мышей.
Применение ИЛ-1р после введения 2.2-ДХДЭС не оказывало влияния на выживаемость и среднюю продолжительность жизни погибших животных.
Терапевтический эффект ИЛ-1|3 при интоксикации 5-ФУ или ЦФ может быть связан с его способностью стимулировать митотическую активность клеток костного мозга, в результате чего происходит выход покоящихся стволовых кроветворных клеток в цикл, стабилизация их популяции и стимуляция клеточной дифференцировки [8, 9]. С другой стороны, ИЛ-1
Р активирует метаболизм соединительной ткани, стимулируя пролифирацию фибробластов и выработку ими ростовых факторов, интерлейкинов и интеферонов. Ещё одним из механизмов
43
Н ОЯ БР Ь
- ДЕКАБРЬ 2О 1 1
Таблица 1
Выживаемость (%) и средняя продолжительность жизни (сут) белых нелинейных мышей при внутрибрюшинном введении интерлейкина-1Р через 1 или 24 ч после применения 5-фторурацила в дозах 225, 250, 275, 300 и 350 мг/кг
Доза 5-ФУ мг/кг Группа Кол-во погибших животных / Общее кол-во животных в группе Выживаемость за 30 сут, % Средняя продолжительность жизни, сут
225 (0,8 ЛД50) Контроль 2 / 12 83 ± 11 9,5 ± 0,5
ИЛ-1р через 1 ч 6 / 12 50 ± 15 7,4 ± 0,3
ИЛ-1р через 24 ч 2 / 12 83 ± 11 8,8 ± 0,5
250 (0,9 ЛД50) Контроль 5 / 15 67 ± 13 8,4 ± 0,2
ИЛ-1р через 1 ч 8 / 15 47 ± 13 8,8 ± 0,5
ИЛ-1р через 24 ч 5 / 15 67 ± 13 8,0 ± 1,2
275 (1,0 ЛД50) Контроль 8 / 16 50 ± 13 7,6 ± 0,7
ИЛ-1р через 1 ч 10 / 16 38 ± 12 9,0 ± 0,4
ИЛ-1р через 24 ч 6 / 16 62 ± 12 8,1 ± 0,4
300 (1Д ВД50) Контроль 11 / 17 35 ± 12 7,7 ± 0,5
ИЛ-1р через 1 ч 9 / 17 47 ± 12 6,9 ± 1,2
ИЛ-1р через 24 ч 6 / 17 65 ± 12 9,5 ± 0,4#
350 (1,3 ЛД50) Контроль 16 / 18 11 ± 8 8,3 ± 0,5
ИЛ-1р через 1 ч 14 / 18 22 ± 10 9,5 ± 0,6
ИЛ-1Р через 24 ч 8 / 18 56± 12*# 10,4 ± 0,9*
*- р < 0,05 по сравнению с контролем
# - р < 0,05 по сравнению с группой животных, получивших ИЛ-1р через 1 ч
терапевтического действия ИЛ-1р является его способность увеличивать чувствительность клеток-предшественников к ростовым факторам, стимулировать их продукцию клетками эндотелия, гепатоцитами, Т-лимфоцитами и клетками стромы костного мозга [5]. На наш взгляд, вышеуказанные эффекты способствуют восстановлению структурно-функциональной организации костного мозга, а значит и восстановлению нарушенного вследствие химического воздействия гемопоэза.
Этим механизмом можно объяснить и низкую эффективность или даже пагубность применения ИЛ-^ через 1 ч после введения 5-ФУ или ЦФ, которую мы наблюдали в экспериментах. Активация процессов пролиферации на фоне циркуляции химических агентов в крови приводит к гибели стволовых клеток, а значит и к увеличению глубины лейкопенического синдрома и, как следствие, повышению летальности экспериментальных животных, что мы и отмечали в ходе выполнения исследований.
Выводы:
® Интерлейкин-^ в дозе 50 мкг/кг при применении через 24 ч после введения 5-фтору-рацила или циклофосфамида в среднесмертельных дозах увеличивает выживаемость мышей.
® Применение интерлейкина-^ в дозе 50 мкг/кг через 1 или 24 ч после подкожного введения 2.2-дихлордиэтилсульфида в дозах 0,8-1,3 ЛД50 не оказывает влияния на выживаемость мышей.
44
Токсикологический вестник (111)
Таблица 2
Выживаемость (%) и средняя продолжительность жизни (сут) белых нелинейных мышей при внутрибрюшинном введении интерлейкина-1Р через 1 или 24 ч после применения циклофосфамида в дозах 450, 500, 550 и 600 мг/кг
Доза ЦФ, мг/кг Группа Кол-во погибших животных/Общее кол-во животных в группе Выживаемость за 30 сут, % Средняя продолжительность жизни, сут
450 (0,8 ЛД50) Контроль 1 / 9 89 ± 11 6
ИЛ-10 через 1 ч 3 / 9 67 ± 17 4,7 ± 1,8
ИЛ-1Р через 24 ч 1 / 9 89 ± 11 10
500 (0,9 ЛД50) Контроль 4 / 9 56 ± 18 4,7 ± 3,6
ИЛ-1р через 1 ч 5 / 9 44 ± 18 6,0 ± 2,6
ИЛ-1Р через 24 ч 5 / 9 44 ± 18 4,3 ± 1,0
550 (1,0 ЛД50) Контроль 3 / 9 67 ± 17 5,7 ± 1,8
ИЛ-1р через 1 ч 7 / 9 22 ± 14* 2,3 ± 0,7*
ИЛ-1Р через 24 ч 3 / 9 67 ± 17 8,0 ± 3,3#
600 (М ВД50) Контроль 8 / 9 11 ± 11 6,1 ± 1,3
ИЛ-1Р через 1 ч 8 / 9 11 ± 11 3,3 ± 1,1*
ИЛ-1Р через 24 ч 3 / 9 67 ± 17*# 4,0 ± 0,9
*- р < 0,05 по сравнению с контролем
# - р < 0,05 по сравнению с группой животных, получивших ИЛ-1Р через 1 ч
45
н оя бр ь
- ДЕКАБРЬ 2 О 1 1
Таблица 3
Выживаемость (%) и средняя продолжительность жизни (сут) белых нелинейных мышей при внутрибрюшинном введении интерлейкина-1Р через 1 или 24 ч после применения 2.2-дихлордиэтилсульфида в дозах 5, 6 и 8 мг/кг
Доза2.2-ДХДЭС, мг/кг Группа Кол-во погибших животных / Общее кол-во животных в группе Выживаемость за 30 сут, % Средняя продолжительность жизни, сут
5 (0,8 ЛД50) Контроль 3 / 10 70 ± 15 1,7 ± 0,3
ИЛ-1р через 1 ч 2 / 10 80 ± 13 1,0 ± 0,2
ИЛ-1Р через 24 ч 2 / 10 80 ± 13 1,0 ± 0,3
6 (1,0 ЛД50) Контроль 5 / 10 50 ± 17 1,4 ± 0,2
ИЛ-1Р через 1 ч 5 / 10 50 ± 17 1,2 ± 0,2
ИЛ-1Р через 24 ч 4 / 10 60 ± 16 1,3 ± 0,2
8 (1,3 ЛД50) Контроль 7 / 10 30 ± 15 1,3 ± 0,2
ИЛ-1р через 1 ч 6 / 10 40 ± 16 1,3 ± 0,2
ИЛ-1Р через 24 ч 6 / 10 40 ± 16 1,0 ± 0,2
*- р < 0,05 по сравнению с контролем
# - р < 0,05 по сравнению с группой животных, получивших ИЛ-1Р через 1 ч
46
Токсикологический вестник (i i i)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 _
1. Абрамов В.В., Абрамов Т.Я. Интерлейкин-1 в цитокиновой сети: фундаментальные и прикладные аспекты // Успехи совр. биол. - 2007. - Т. 127, № 6. - С. 570-579. 2. Гребенюк А.Н., Носов А.В., Мусийчук Ю.И., Рыбалко В.М. Медицинские и защитные мероприятия при химических авариях и катастрофах // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. - 2009. - № 2. - С. 14-20. 3. Казнин Ю.Ф., Соляников В.Д., Блиндин В.М. Медико-санитарные проблемы химического терроризма // Рос. семейный врач. - 2009. - Т. 13, № 2. - С. 5-11. 4. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины - СПб.: Фолиант, 2008. - 552 с. 5. Симбирцев А.С. Интерлейкин-1. Физиология. Патология. Клиника. - СПб.: Фолиант, 2011. - 480 с. 6. Чрезвычайные ситуации химической природы: химические аварии, массовые отравления, медицинские аспекты / Под ред. Ю.Ю. Бонитенко, А.М. Никифорова. - СПб.: Гиппократ, 2004. - 464 с. 7. Cirincione J., Wolfsthal J.B., Rajkumar M. Deadly arsenals: tracking weapons of mass distraction. - Washington: Carnegie Endowment for International Peace, 2002. - P. 175-186. 8. Dinarello C. Biological basis for interleukin-1 in disease // Blood. - 1996. - V. 87 - P. 2095-2147. 9. Dinarello C. Immunological and inflammatory functions of the interleukin-1 family // Ann. Rev. Immunol. - 2009. - V. 27. - P. 519-550. 10. Saladi R.N., Smith E., Persaud A.N. Mustard: a potential agent of chemical warfare and terrorism // Clin. Exp. Dermatology. - 2005. - Vol. 31, № 1. - P. 1-5.
Shilov Yu.V., Nosov A.V., Grebenyuk A.N.
Effect of interleukin-l[3 on the survival and life expectancy of mice in acute intoxication by 5-fluorouracil, cyclophosphamide, bis(2-chloroethyl)sulfide
S.M.Kirov Military Medical Academy, St. Petersburg
The effectiveness of the therapeutic application of interleukin -lfi was experimentally assessed basing on the criteria of survival and life span of dead mice intoxicated by 5-fluorouracil, cyclophosphamide, bis(2-chloroethyl)sulfide. It was shown that the use of interleukin-lfi 24h after injection of 5-fluorouracil or cyclophosphamide increases the survival of mice.
Материал поступил в редакцию 29.07.20ll г
47
