CC BY
81
ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2013
реляционных взаимоотношений между уровнем цитокинов. Прослеживалось влияние особенностей цитокинового профиля у больных на клинические проявления ГВЗ челюстнолицевой области. Так, в группах с низким уровнем IL-ф и IL-2 наблюдали неблагоприятное течение заболевания. В поиске найти показатель, отражающий связь между уровнем различных цитокинов между собой, а также лабораторный предиктор неблагополучных исходов тяжелых гнойновоспалительных заболеваний ранее были предложены различные индексы - IL-10/IFNy, Ra-IL-1p/TNFa [3, 4]. Однако при ГВЗ лица и шеи данные показатели не коррелировали ни с одним из клинических показателей. В то же время с клиническими показателями имело связь отношение концентрации основных цитокинов, участвующих в инициации адаптивного иммунного ответа, IL-ip и IL-2 к уровню цитокинов IL-4 и IL-10, оказывающих ингибирующее влияние на продукцию первых двух. Значения данного отношения отрицательно коррелировали с количеством койко-дней (rs = -0,58; р = 0,0004) и показателем развития септического шока (rs = -0,45; р = 0,002). У здоровых лиц он приближался к 1, что свидетельствовало о равнозначности уровня иммуноинициирующих и иммуносупрессирующих цитокинов. С возникновением тяжелого ГВЗ лица и шеи и активацией иммунных реакций, а также связанных с ними процессов возбуждения цитокиновой сети и преимущественной продукции иммуностимулирующих цитокинов его значение возрастало более чем в 10 раз. У больных с неблагоприятным течением заболевания были характерны более низкие, чем у больных с адекватной продукцией цитокинов, значения данного отношения. Следовательно, у пациентов с неблагоприятным течением заболевания возрастала продукция иммуносупрессирующих
цитокинов, обусловливающих нарушение необходимого для благоприятного течения заболевания баланса иммуностимулирующих и иммуносупрессирующих цитокинов.
Вы воды. 1. При тяжелых ГВЗ лица и шеи уровень иммуностимулирующих цитокинов преобладает над содержанием иммуносупрессирующих цитокинов.
2. Выделены два неблагоприятных в клиническом отношении типа цитокинового профиля у больных с тяжелыми ГВЗ лица и шеи. Первый тип обусловлен низким уровнем IL-ip на фоне высокой концентрации IL-4, IL-6 и Ra-IL-ip, второй - низким уровнем IL-2 в сочетании со сниженным уровнем IFNy и повышенным уровнем TNFa и IL-10.
3. Общей чертой в развитии цитокинового дисбаланса при каждом типе неблагоприятного цитокинового профиля является сдвиг баланса продукции цитокинов в сторону роста продукции иммуносупрессирующих цитокинов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Лазанович В.А., Смирнов Г.А., Маркелова E.B. и др. Ронко-лейкин в лечении септических больных. Медицинская иммунология. 2000; 2 (2): 224.
2. Малыш И.Р., Козлов В.К., Згржебловская Л.В. Профиль цитокинов в динамике посттравматического периода у пострадавших с тяжелой политравмой. Украинский журнал экстремальной медицины. 2005; 6 (3): 66-77.
3. Тимофеев А.А. Гнойная хирургия челюстно-лицевой области и шеи. Киев; 1995.
4. Mallat Z., BesnardS., DunezM. et al. Protective role of interleukin-10 in atherosclerosis. Circ. Res. 1999; 85: 17-24.
Поступила 17.02.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 616.98:578.825.11]-085.373:578.245].015.44
А.В. Карсонова12, И.Н. Зуйкова2, А.Е. Шульженко2, А.В. Караулов1, М.В. Пащенков2 ВЛИЯНИЕ ИНТЕРФЕРОНА-АЛЬФА НА ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ NK-КЛЕТОК У
больных часто рецидивирующим герпесом
1ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский институт им. И.М. Сеченова Минздрава России, 119991, Москва; 2ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, 115478, г. Москва
В настоящей работе исследовано влияние предварительный стимуляции интерфероном-а2Ь (IFNa2b) на функционирование NK-клеток при часто рецидивирующем герпесе (ЧРГ). В качестве критериев для оценки функций NK-клеток, помимо стандартного параметра NK-активности, использована реакция дегрануляции. Для более точной оценки в системе IFN-NK-клетка пациентов (основная группа) и здоровых доноров (контроль) разделили на 2 группы в зависимости от возраста: “молодые” (до 45 лет) и “пожилые” (после 45 лет) по медиане. Выявлено, что у пациентов с ЧРГ первой возрастной группы (до 45 лет) NK-клетки имели сниженные IFN-стимулированные показатели дегрануляции по сравнению с таковыми в группе контроля (здоровые доноры), причем дефицит ответа на IFNa2b имел стойкий характер и не зависел от фазы клинического процесса и используемой концентрации IFN, а в фазу ремиссии отличия между больными и донорами (контроль) оказались еще более выраженными, чем в фазу обострения. IFN-стимулированная NK-активность также была достоверно ниже у пациентов с ЧРГ по сравнению с донорами, однако данный дефицит функции имел место исключительно в фазу ремиссии. В фазу обострения дефицита IFN-стимулированной NK-активности не наблюдали. Таким образом, фаза ремиссии ЧРГ характеризовалась дефицитом IFN-стимулированных функций по обоим используемым параметрам (дегрануляция и NK-активность). В обеих возрастных группах четко выделяются пациенты, у которых не происходит увеличения показателей дегрануляции NK-клеток в ответ на повышение используемой концентрации IFN от 10 до 1000 Ед/мл (тип ответа B) и которые имеют достоверно более низкие показатели абсолютного прироста, чем в контроле. У остальных пациентов данные показатели достоверно не отличаются от таковых у доноров (тип ответа А). Доля пациентов с вышеописанным типом ответа в обеих возрастных группах составила около 1/3 (32 и 33%). Итак, при ЧРГ имеется дефицит ответа NK-клеток на стимуляцию IFNa, причем пациенты с ЧРГ являются гетерогенной по данному изучаемому параметру группой, что целесообразно учитывать при проведении иммунокорригирующей терапии, так как при определенных условиях возможно добиться увеличения данного параметра функционирования NK-клеток у пациентов с ЧРГ до уровня у здоровых доноров, чего ни при каких условиях невозможно добиться у пациентов другой подгруппы. В стадию ремиссии дефицит функций NK-клеток выражен в большей степени, нежели в стадию обострения.
Ключевые слова: NK-клетки, дегрануляция, вирус простого герпеса, цитотоксичность, CD107a, проточная цитометрия, интерферон-а
- 158 -
ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
A.V Karsonova1,2,1.N. Zuykova2, А.Е. Shulzhenko2, A.V Karaulov \ M.V Paschenkov2
EFFECT OF INTERFERON-ALPHA ON THE NK-CELLS CYTOTOXICITY IN PATIENTS WITH FREQUENTLY RECURRENT HERPES
The I.M. Sechenov first Moscow state medical University Ministry of health 1 , 119991, Moscow; State scientific center Institute of immunology of Federal Medico-biological Agency of Russia2, 115478, Moscow
In the present article we studied the effect of a daily stimulation of interferon-a2b (IFNa2b) on the functioning of NK-cells in frequently recurrent herpes (FRH). As criteria for the assessment of NK-cells in addition to the standard parameter IR-activity, used the reaction of degranulation. For a more accurate assessment of the system «IFN - NK-cell» of patients (the main group) and healthy donors (control) were divided into two groups depending on vozrata: «young» (up to 45 years old) and «older» (after 45 years). It is revealed, that in patients with FRH of the first age group (up to 45 years) NK-cells were reduced IFN-stimulated indicators degranulation in comparison with the donor group, with a shortfall answer to IFNa2b had a stable character and does not depend on the phase of the clinical process and the concentrations of interferon, and in the phase of remission differences between the group of patients and donor monitoring group has been even more pronounced than in the acute phase. IFN-стимулированная of NK activity was also significantly lower in patients with FRH compared with donors, however, the deficit of the function took place only in the phase of remission. In the acute phase of the deficit IFN-stimulated NK activity was not observed. Thus, the phase of remission FRH was characterized by a deficit of IFN-stimulated functions for both used parameters (degranulation and NK-activity). In both age groups are clearly identified patients, in which there is no increase in degranulation of NK-cells in response to the increased use of concentration of IFN from 10 to 1000 Units/ml (type the answer (B) and which has significantly more low indicators of absolute growth than in the control. In other patients, these figures don't differ from those of the donor (a type of the answer (A). The proportion of patients with the above type of response in both age groups amounted to about 1/3 (32%and 33%). So, when FRH there is a shortage of response of NK-cells for stimulation of IFNa, and patients with FRH are heterogeneous on the given parameters surveyed group, it is expedient to take into account in the immunocorrective therapy, since under certain conditions it is possible to increase this parameter functioning of NK-cells in patients with FRH to the level of healthy donors, that in no event it is impossible to achieve in patients of the other subgroups. In the stage of remission deficit functions of NK-cells is expressed to a greater extent than the stage of exacerbation.
Key words: NK-cells, degranulation, herpes simplex virus, cytotoxicity, CD107a, flow cytometry, interferon-alpha
Введение. Часто рецидивирующий герпес (ЧРГ), вызываемый вирусами простого герпеса (ВПГ) 1-го и 2-го типов (ВПГ-1 и ВПГ-2), является значимой медико-социальной проблемой. Лечение пациентов с ЧРГ до сих пор представляет значительные трудности, а известные методы терапии часто не позволяют достичь желаемых результатов. Элиминирование ВПГ из организма на данный момент развития науки не представляется возможным в связи с уникальной биологической особенностью герпес-вирусов-а формировать состояние латентности в нейронах регионарных ганглиев. Если элиминировать ВПГ невозможно, то необходимо добиться контроля над инфекцией, что также труднодостижимо в связи с функциональной иммунологической недостаточностью, возникающей вследствие длительной персистенции ВПГ. Широкое применение ациклических нуклеозидов полностью не решило данного вопроса, частые рецидивы определяют необходимость патогенетического лечения, направленного на коррекцию дефектов иммунного ответа.
Одним из интенсивно изучаемых факторов противовирусной резистентности являются интерфероны (IFN) 1-го типа. Действительно, ВПГ являются мощными индукторами выработки IFN 1-го типа (в частности, IFNa) мононуклеар-ными клетками (МНК) крови здоровых людей [1]. Основными продуцентами IFN 1-го типа в ответ на ВПГ являются плазмоцитоидные предендритные клетки, которые распознают ВПГ с помощью Toll-like рецептора (TLR9) [2, 3]. Установлено, что при рецидивирующем герпесе имеется дефицит выработки IFN 1-го типа мононуклеарными клетками крови [4-7]. Более того, врожденный дефект генов, отвечающих за индукцию выработки IFN 1-го типа (UNC93B, TLR3), проявляется именно тяжело протекающими инфекциями, вызванными ВПГ [8, 9]. Все эти данные послужили теоретической основой для целого ряда клинических испытаний препаратов IFN 1-го типа и индукторов IFN при рецидивирующем простом герпесе, лечебный эффект которых связан как с прямым противовирусным, так и с иммуномодулирующим действием IFN 1-го типа [10-16].
Однако иммунологическая недостаточность у пациентов с ЧРГ может быть вызвана не только недостаточностью интерфероногенеза, но и снижением ответа иммунокомпетент-
ных клеток на эти цитокины. Так, известно, что некоторые продукты ВПГ могут ингибировать ответ клеток на IFNa [17-20]. В частности, обнаружено, что в клетках, инфицированных ВПГ-1, ингибируется передача активационного сигнала от рецептора к IFNa/p (CD118) в ядро, что приводит к подавлению ответа клеток на IFNa [17]. Эффект связан, в частности, с нарушением активации Jak/STAT-сигнального пути.
Одними из основных эффекторных клеток, противодействующих репликации ВПГ в организме, являются NK-клетки. NK-клетки способны к цитолизу вирусинфициро-ванных клеток без предшествующей активации. Однако продуцируемые макрофагами и дендритными клетками в ответ на инфекцию цитокины (фактор некроза опухоли а (TNFa), IFNa/p, интерлейкин (IL)-12/IL-18)) резко повышают цитотоксичность NK-клеток, являясь мощными активаторами NK-клеток [21]. В экспериментах на лабораторных животных показано, что ранние стадии герпес-вирусной инфекции (ГВИ) могут контролироваться исключительно IFN, тогда как NK-клетки в сочетании с Т- и B-клетками необходимы для противодействия вирусу на более поздних стадиях инфекции [22]. Результаты ряда исследований показали, что при рецидивирующем герпесе имеет место снижение цитотоксической активности и дегрануляции NK-клеток [7, 23]. IFN 1-го типа, в частности IFNa, являются важнейшими активаторами NK-клеток. Поэтому одной из причин недостаточности функций NK-клеток при хронической рецидивирующей ГВИ (ХРГВИ) может быть дефект в системе IFN 1-го типа, причем не только по типу гипопродукции, но и вследствие блокировки ответа NK-клеток на IFN 1-го типа.
Вышеуказанные ингибирующие эффекты ВПГ на иммунокомпетентные клетки описаны на модельных клеточных линиях. Поэтому актуален вопрос: “Имеют ли место аналогичные нарушения у больных с ЧРГ?” Ответ на этот вопрос позволил бы также объяснить наблюдаемые в клинико-лабораторной практике расхождения между высокой продукцией IFNa и тяжелым течением ХРГВИ, понять причины неэффективности интерферонотерапии у некоторых пациентов, заранее отбирать пациентов для возможной фармакологической коррекции в системе IFNa - NK-клетка,
- 159 -
ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2013
прогнозируя потенциальную эффективность интерферонотерапии в каждом конкретном случае.
Целью нашего исследования стало изучение влияния IFNa на функции NK-клеток у пациентов с ХРГВИ.
Материалы и методы. Пациенты и здоровые доноры. Под наблюдением находились 50 пациентов (9 мужчин и 41 женщина; основная группа) в возрасте от 29 до 63 лет (средний возраст 45 лет) с верифицированным диагнозом ГВИ (здесь и далее в тексте все данные представлены как медиана (10—90-й процентили)). В исследование были включены пациенты как с ГВИ генитальной локализации (п = 33), так и с лабиальным простым герпесом (п = 10). У 7 больных имело место сочетание генитального и лабиального герпеса (п = 7). Длительность заболевания у большинства (п = 42) пациентов составила более 5 лет, у остальных (п = 8) - от 2 до 4 лет. Частота рецидивов ГВИ на момент обследования более 6 раз в год. Контрольную группу составили 32 здоровых донора (13 мужчин и 19 женщин) в возрасте от 22 до 59 лет (средний возраст 37 лет), давших добровольное письменное согласие на участие в исследовании по форме, одобренной Межвузовским комитетом по этике при ассоциации медицинских и фармацевтических работников. Критериями включения в группу контроля являлось отсутствие хронических инфекционных и воспалительных заболеваний, а также острых инфекций в течение минимум 1 мес до момента взятия крови. От всех исследуемых получали 15 мл венозной гепаринизированной крови.
Стимуляция МНК IFNa. МНК выделяли из венозной крови на градиенте плотности фиколл-урографина, отмывали средой 199 и ресуспендировали в полной культуральной среде (ПКС), которая представляла собой RPMI с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС) и 2 мМ L-глутамина (все реагенты “Панэко”, Россия). Полученные МНК (2 • 106/мл в полипропиленовых пробирках) культивировали в присутствии рекомбинантного человеческого IFNa2b ("Invitrogen", Великобритания) в концентрации 10, 100 и 1000 Ед/мл в течение 24 ч в СО2-инкубаторе (5% СО2, 37oC), одну из аликвот культивировали без IFN.
реакция дегрануляции NK-клеток, культивированных в присутствии человеческого IFNa. Дегрануляцию NK-клеток оценивали методом проточной цитометрии по экстернализации маркера CD107a после стимуляции in vitro по методике, подробно описанной в [24] c некоторыми нижеописанными изменениями. Через сутки после стимуляции IFN МНК отмывали средой 199 и в лунки 96-луночных круглодонных планшетов вносили (в указанном порядке): РС5-меченные антитела (АТ) к CD107a ("BD Pharmingen", США; конечное разведение 1:200), МНК (5 • 105 клеток на лунку), клетки эритромиелоидной HLA-I-линии K562 (5 • 105 клеток на лунку, соотношение эффектор/мишень 1:1). В лунку отрицательного контроля вместо индукторов дегрануляции добавляли равный объем ПКС. Для контроля окраски на CD107a в еще одну контрольную лунку не добавляли АТ к CD107a. Планшет инкубировали 4 ч в СО2-инкубаторе (5% СО2; 37oC). По окончании инкубации клетки ресу-спендировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с 0,02% азидом натрия и 0,02% ЭДТА для диссоциации клеточных агрегатов (5 мин, КТ), затем отмывали в ФСБ с 0,5% бычьим сывороточным альбумином (БСА; "Панэко", Россия) и окрашивали FITC-меченными АТ к CD3 и PC7-меченными АТ к CD56 ("Beckman Coulter", США) для идентификации NK-клеток (4°С, 20 мин). Окрашенные клетки анализировали на 5-канальном проточном цитометре Cytomics FC500 с использованием программного обеспечения CXP (все "Beckman Coulter", США). NK-клетки идентифицировали как CD3-CD56+-клетки со светорассеянием лимфоцитов. Результаты представляли как процент CD107a+ NK-клеток по отношению ко всем NK-клеткам. Рассчитывали следующие параметры:
ACD107a+ = (%CD107a+ NK-клеток в присутствии клеток-мишеней k562) - (%CD107a+ NK-клеток в отсут-
ствие индукторов дегрануляции (спонтанная дегрануляция));
AIFN(1000-10) = (ACD107a+ после стимуляции IFNa2b в концентрации 1000 Ед/мл) - (ACD107a+ после стимуляции IFNa2b в концентрации 10 Ед/мл).
Исследование NK-активности МНК, культивированных в присутствии человеческого IFNa. NK-активность МНК, культивированных 24 ч с различной концентрацией ИФНа2Ь, исследовали методом проточной цитометрии по киллингу клеток-мишеней K562, меченных CFSE (5-, 6-карбоксифлюоресцеиндиацетат-сукцинимидиловым эфиром) по методике, подробно описанной в [24].
Статистическая обработка данных. Все данные представлены как медиана (10-90-й процентили). Статистическую обработку данных проводили с помощью программ SPSS 11.5 для Windows. Для оценки достоверности различий между двумя группами использовали критерий Манна-Уитни (N-тест). Парные измерения сравнивали с помощью теста Уилкоксона.
Результаты. Дегрануляция NK-клеток у пациентов с ЧРГ без стимуляции ИФНа2Ь. Принимая во внимание тот факт, что с возрастом дегрануляция NK-клеток снижается [25], мы посчитали логичным разделить основную и контрольную группы по возрасту. За границу раздела между первой и второй возрастными группами была принята медиана (45 лет). При исследовании дегрануляции NK-клеток у пациентов с ЧРГ без стимуляции IFNa2b выявили достоверное снижение данного параметра по сравнению с таковым у здоровых доноров в возрастной группе до 45 лет, причем достоверный дефицит дегрануляции наблюдали на протяжении всех фаз клинического процесса - и в фазу обострения, и в фазу ремиссии. Эти данные по первой возрастной группе (до 45 лет) совпадают с данными V. Murugin и соавт. [10], полученными при исследовании дегрануляции в аналогичной возрастной группе (медиана возраста пациентов и доноров, включенных в исследование [10], 33 и 27 лет соответственно). Во второй возрастной группе (старше 45 лет) статистически значимых различий между пациентами с ЧРГ и здоровыми донорами не обнаружили (табл. 1).
Влияние IFNa на дегрануляцию NK-клеток у пациентов с ЧРГ. Учитывая зависимость исходных показателей дегрануляции от возраста, оценку влияния IFN на дегрануляцию NK-клеток также проводили в двух возрастных группах (до 45 и старше 45 лет) отдельно, поскольку снижение ответа на цитокин может быть обусловлено возрастными особенно-
—Доноры (л=18)
■ ЧРГ, фаза обострения (л=15)
А ЧРГ, фаза ремиссии (л=22)
Рис. 1. Влияние суточной стимуляции IFNa2b на уровень дегрануляции NK-клеток у здоровых доноров и пациентов с ЧРГ в фазы обострения и ремиссии первой возрастной группы (до 45 лет).
Здесь и на рис. 2-5: по оси абсцисс - концентрация IFNa2b (в Ед/мл); по оси ординат показаны медианы (10-90-й процентиль).
- 160 -
ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Таблица 1 Влияние суточной стимуляции IFNa2b в концентрации 10, 100 и 1000 Ед/мл на дегрануляцию NK-клеток у здоровых доноров и пациентов с ЧРГ в фазы обострения и ремиссии в двух возрастных группах
Дегрануляция NK-клеток (%CD107a+ CD3-CD56+)
Группа обследованных без стимуляции IFN после суточной стимуляции IFNa2b в концентрации 10 Ед/мл после суточной стимуляции IFNa2b в концентрации 100 Ед/мл после суточной стимуляции IFNa2b в концентрации 1000 Ед/мл
Без разделения на возрастные группы:
ЧРГ, фаза обострения (п = 39) 11,1 (4,1-25,1) 21,4 (9,8-38,9) 26,3 (12,2-44,5) 29,5 (14,1-45,1)
ЧРГ, фаза ремиссии (п = 33) 11,4 (6,6-25,2) 20,8 (12,6-41,8) 25,3 (16,9-47,9) 28,6 (19,2-50,3)
здоровые доноры (п = 31) 13,8 (4,3-29,6) 26,6 (7,9-46,4) 31,8 (12,5-50,1) 33 (15,3-56,7)
Возрастная группа до 45 лет:
ЧРГ, фаза обострения (п = 15) 11,1* (4,6-22,7) 24,3* (9,9-37,5) 27,8* (13,7-44,3) 33,3* (15,1-46,7)
p = 0,025 p = 0,052 p = 0,04 p = 0,052
ЧРГ, фаза ремиссии (п = 22) 11,4* (5,5-21,1) 20,3* (13,9-36,6) 26,2* (17,2-39,2) 28,4* (18,6-46,6)
p = 0,006 p = 0,014 p = 0,005 p = 0,009
здоровые доноры (п = 18) 22,2 (6,0-32,6) 34,6 (11,0-48,2) 40,7 (14,8-53,7) 43,0 (18,1-58,5)
Возрастная группа старше 45 лет:
ЧРГ, фаза обострения (п = 23) 11,3 (3,8-28,1) 19,9 (10,5-40,4) 25,5 (11,8-45) 28,9 (15-45,3)
ЧРГ, фаза ремиссии (п = 11) 11,6 (7,6-27,4) 21,7 (9,3-50,2) 25,2 (16,7-55,6) 29,4 (19,1-59,1)
здоровые доноры (п = 13) 11,2 (3,0-25,7) 22,6 (6,3-35,6) 24,8 (11,5-43,6) 31,4 (14,0-45)
Примечание. Здесь и в табл. 2: * - различия достоверны c указанным значением p по сравнению с показателем в контрольной группе (тест Манна-Уитни); показана медиана (10-90-й процентили).
стями, а вовсе не особенностями патогенеза ЧРГ В первой возрастной группе (до 45 лет) суточная стимуляция IFNa вызвала увеличение показателей дегрануляции, однако цито-кининдуцированные показатели дегрануляции у пациентов с ЧРГ оставались достоверно сниженными по сравнению с таковыми в донорской группе (см. табл. 1). Кроме того, дефицит ответа NK-клеток на стимуляцию IFNa имел постоянный характер и сохранялся вне зависимости от применяемой концентрации цитокина и фазы клинического процесса, причем в фазу ремиссии различие между основной и контрольной группами было еще более выражено, нежели при обострении (рис.1). При исследовании аналогичных параметров во второй возрастной группе (старше 45 лет) достоверных различий не обнаружили (рис. 2).
Анализируя зависимости IFN-стимулированных показателей дегрануляции от используемых концентраций IFNa, мы обратили внимание на то, что у доноров первой возрастной группы (до 45 лет) увеличение показателей дегрануляции при увеличении используемой концентрации IFNa2b от 10 до 1000 Ед/мл (AIFN(1000-10)) составило не менее 4%, что было принято за нижнюю границу нормы для этого показателя. Среди 25 пациентов с ЧРГ этой же возрастной группы выявили 8 (32%) пациентов, у которых данный показатель был меньше 4%. Описанных два типа ответа на стимуляцию IFNa в настоящей работе мы обозначили как тип ответа А для случаев, когда AIFN(1000-10) > 4%, и как тип ответа B для случаев, когда AIFN(1000-10) < 4% (рис. 3). Среди 24 пациентов старше 45 лет у 8 (33%) также имеет место тип ответа B, однако такое же явление наблюдали у 3 (23%) из 13 доноров соответствующей возрастной подгруппы (рис.4).
Влияние IFNa на NK-активность МНК у пациентов с ЧРГ. По данным литературы, показатель NK-активности не является зависимым от возраста. Но в связи с тем, что в настоящей работе выделены две возрастные группы, представляет интерес анализ показателей NK-активности как в группе без разделения по возрасту, так и для каждой из возрастных групп отдельно. В основной группе (без разделения по возрасту) в фазу ремиссии выявили снижение показателей NK-активности МНК по сравнению с таковым в контроле
(р = 0,053). В результате суточной стимуляции IFNa МНК у пациентов с ЧРГ имели также более низкие показатели NK-активности, чем стимулированные МНК у здоровых доноров, причем данное явление отметили при всех трех используемых концентрациях(10, 100 и 1000 Ед/мл). В фазе обострения статистически значимых различий в показателях NK-активности МНК (как нестимулированных МНК, так и стимулированных в течение суток IFNa в концентрации 10, 100 и 1000 Ед/мл) по сравнению с таковыми в группе контроля не обнаружили (табл. 2). При парном сравнении показателей NK-активности МНК у пациентов с ЧРГ в динамике в фазы обострения и ремиссии (п = 18) статистически значимых изменений не выявили (тест Уилкоксона). При анализе аналогичных параметров по возрастным группам установили статистически значимые различия с донорской группой
0 10 100 1000 —Доноры (л=13)
■ ЧРГ, фаза обострения (п=23)
ЧРГ, фаза ремиссии (п=11)
Рис. 2. Влияние суточной стимуляции IFNa2b на уровень дегрануляции NK-клеток у здоровых доноров и пациентов с ЧРГ в фазы обострения и ремиссии второй возрастной группы (старше 45 лет).
- 161 -
ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2013
Влияние суточной стимуляции IFNa2b в концентрации 10, 100 и 1000 Ед/мл на NK-доноров Таблица 2 активность МнК у пациентов с ЧрГ и здоровых
NK-активность МНК
Группа обследованных без стимуляции IFN после суточной стимуляции IFNa2b в концентрации 10 Ед/мл после суточной стимуляции IFNa2b в концентрации 100 Ед/мл после суточной стимуляции IFNa2b в концентрации 1000 Ед/мл
Без разделения на возрастные группы:
ЧРГ, фаза обострения (n = 37) 23,8 (4,2-56,9) 42,7 (6,3-75,1) 52,9 (11,1-80,0) 54,8 (12,1-81,6)
ЧРГ, фаза ремиссии (n = 30) 20,0* (3,3-65) 28,7* (6,6-73,4) 36,1* (10,9-72,3) 36,7* (11,6-77,3)
p = 0,053 p = 0,05 p = 0,014 p = 0,001
здоровые доноры (n = 29) 25,6 (12,1-68,2) 58 (14,5-73,4) 54,8 (28,1-77,8) 55 (28,2-80,8)
Возрастная группа до 45 лет:
ЧРГ, фаза обострения (n = 14) 25,0 (2,6-65,2) 60,9 (4,7-76,4) 60,1 (9,1-85,3) 61 (7,6-93,7)
ЧРГ, фаза ремиссии (n = 20) 21,4 (2,4-63) 25* (4,5-60,2) p = 0,009 36,9 (6,2-70,5) 36,7* (10,7-68,7) p = 0,007
здоровые доноры (n = 18) 25,6 (18,0-72,7) 49,3 (31,5-76,5) 54,5 (34-69,1) 67,8 (38,4-80,7)
Возрастная группа старше 45 лет:
ЧРГ, фаза обострения (n = 20) 21,4 (2,4-63) 25 (4,5-60,2) 36,9 (6,2-70,5) 36,7 (10,7-68,7)
ЧРГ, фаза ремиссии (n = 10) 16,1 (3,3-73,1) 32,7 (6,6-76,7) 34,7 (10,9-84,8) 36,8 (11,8-82,2)
здоровые доноры (n = 13) 24,9 (8,0-61,7) 58,4 (16,2-75,6) 63,4 (26,9-80,8) 66,5 (31,0-83,6)
только по двум из трех IFN-стимулированных показателей NK-активности (при концентрации 10 и 1000 Ед/мл), причем только в фазу ремиссии и только в первой возрастной группе. Достоверного снижения данного показателя NK-активности МНК без стимуляции IFN не выявили ни в одной, ни в другой возрастных группах.
Обсуждение. Дефицит ответа NK-клеток на активацию IFNa может являться одним из значимых нарушений в патогенезе ЧРГ В связи с этим в настоящей работе исследовали влияние IFNa на функционирование NK-клеток при ЧРГ. В качестве критериев для оценки функций NK-клеток, помимо стандартного параметра NK-активности, использовали реакцию дегрануляции, функциональная значимость которой доказана в результате предыдущих исследований [22]. Следует
9 Доноры (л=18) *р<0,05
■ ЧРГ, тип ответа А (л= 17) **р < 0,01
—А— ЧРГ, тип ответа В (л=8) ***р< 0,001
Рис. 3. Влияние суточной стимуляции IFNa2b на уровень дегрануляции NK-клеток у здоровых доноров и пациентов с ЧРГ первой возрастной группы (до 45 лет).
Пациентов разделили на подгруппы по типу ответа NK-клеток на стимуляцию IFN.
отметить, что исходный уровень показателей дегрануляции у пациентов и доноров варьировал в зависимости от возраста, что понятно, поскольку доказано, что с возрастом дегрануляция снижается [23]. Поэтому для более точной оценки в системе IFN-NK-клетка пациентов разделили на две возрастные группы во избежание ситуации, когда различия в дефиците ответа на цитокин обусловливались бы возрастными особенностями, а вовсе не особенностями патогенеза ЧРГ. Выявили, что у пациентов с ЧРГ первой возрастной группы (до 45 лет) NK-клетки имели сниженные IFN-стимулированные показатели дегрануляции по сравнению с таковыми в донорской группе, причем дефицит ответа на IFNa2b имел стойкий характер и не зависел от фазы клинического процесса и используемой концентрации IFN, а в фазу ремиссии различия между паци-
9 ЧРГ, тип ответа В (л=8) ■ Доноры, тип А (л=10)
А ЧРГ, тип ответа А (л=16) ♦ Доноры, тип В (л=3)
Рис. 4. Влияние суточной стимуляции IFNa2b на уровень дегрануляции NK-клеток у здоровых доноров и пациентов с ЧРГ второй возрастной группы (старше 45 лет).
Пациентов и доноров разделили на подгруппы по типу ответа NK-клеток на стимуляцию IFN.
- 162 -
ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
ентами с ЧРГ (основная группа) и донорами (контроль) были еще более выраженными, чем в фазу обострения. Во второй возрастной группе статистически значимых различий по исследуемым параметрам между пациентами с ЧРГ (основная группа) и донорами (контроль) не обнаружили, что объясняется, вероятно, тем, что доноры (здоровые лица) с возрастом также демонстрируют сниженные IFN-стимулированные показатели (см. рис. 1, 2).
IFN-стимулированная NK-активность также была достоверно ниже у пациентов с ЧРГ, чем у доноров, однако данный дефицит функции имел место исключительно в фазу ремиссии. В фазу обострения дефицита IFN-стимулированной NK-активности не наблюдали. Таким образом, фаза ремиссии ЧРГ характеризовалась дефицитом IFN-стимулированных функций по обоим используемым параметрам (дегрануляция и NK-активность).
Представляет интерес зависимость изменения IFN-стимулированных показателей дегрануляции от используемой концентрации IFN. В нашем исследовании четко выделяются пациенты, у которых не происходит увеличения показателей дегрануляции NK-клеток в ответ на повышение используемой концентрации IFN от 10 до 1000 Ед/мл (тип ответа B) и которые имеют достоверно более низкие показатели абсолютного прироста по сравнению с таковыми у доноров. У остальных пациентов имеет место увеличение дегрануляции при повышении концентрации от 10 до 1000 Ед/мл, статистически не отличающееся от аналогичного показателя у доноров (тип ответа А). Это явление, возможно, связано со снижением плотности рецепторов к IFN на поверхности клеток у данной подгруппы пациентов. Механизмы, лежащие в основе типа ответа B, неясны. Возможны следующие предположения: 1 - снижение плотности рецепторов к ИФНа/р на поверхности NK-клеток, что может приводить к насыщению всех имеющихся рецепторов при более низких концентрациях ИФНа; 2 - снижение экспрессии одного или нескольких компонентов сигнального пути рецептора к ИФНа/р, что может приводить к преждевременному «насыщению» сигнального пути. Также нуждаются в изучении и факторы, приводящие к формированию типа ответа B у пациентов с ЧРГ. Можно предположить прямое и непрямое (цитокин-опосредованное) действие ВПГ; в частности, повышение уровня эндогенных ИФН I типа, индуцированное ВПГ, может вести к интернализации рецептора к ИФНа/р на NK-клетках. Менее вероятны конституциональные особенности, учитывая преходящий характер типа ответа B.
Итак, в результате проведенного исследования можно сделать вывод о том, что при ЧРГ имеется дефект ответа NK-клеток на стимуляцию Ш№, причем пациенты с ЧРГ являются гетерогенной по данному изучаемому параметру группой, что целесообразно учитывать при проведении иммунокорригирующей терапии. В стадии ремиссии дефицит функций NK-клеток выражен в большей степени, нежели в стадии обострения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Rong Q., Alexander T.S., Koski G.K. et al. Multiple mechanisms for HSV-1 induction of interferon alpha production by peripheral blood mononuclear cells. Arch. Virol. 2003; 148: 329-44.
2. Lund J., Sato A., Akira S. et al. Toll-like receptor 9-mediated recognition of Herpes simplex virus-2 by plasmacytoid dendritic cells. J. Exp. Med. 2003; 198: 513-20.
3. Rasmussen S.B., S0rensen L.N., Malmgaard L. et al. Type I interferon production during herpes simplex virus infection is controlled by cell-type-specific viral recognition through Toll-like receptor 9, the mitochondrial antiviral signaling protein pathway, and novel recognition systems. J. Virol. 2007; 81: 13 315-24.
4. Kuo Y.C., Lin C.Y. Recurrent herpes simplex virus type 1 infection precipitated by the impaired production of interleukin-2, alpha-interferon, and cell-mediated cytotoxicity. J. Med. Virol. 1990; 31: 183-9.
5. PicaF., VolpiA., GazianoR. et al. Interferon-lambda in immunocompetent individuals with a history of recurrent herpes labialis. Antivir Ther. 2010; 15: 737-43.
6. Tsutsumi H., Bernstein J.M., Riepenhoff-Talty M. et al. Immune response to herpes simplex virus in patients with recurrent herpes labialis. II. Relationship between interferon production and cytotoxic responses. Pediatr. Res. 1986; 20: 905-8.
7. Мезенцева М.В., Наровлянский А.Н., Щербенко В.Э. и др. Оценка интерферонового статуса и цитокинового профиля у больных генитальным герпесом. Russian Journal of Immunology. 2002; 7 (2): 167-74.
8. Casrouge A., Zhang S.Y., Eidenschenk C. et al. Herpes simplex virus encephalitis in human UNC-93B deficiency. Science. 2006; 314 (5797): 308-12.
9. Zhang S.Y., Jouanguy E., Ugolini S. et al. TLR3 deficiency in patients with herpes simplex encephalitis. Science. 2007; 317 (5844): 1522-7.
10. Glezerman M., Lunenfeld E., Cohen V. et al. Placebo-controlled trial of topical interferon in labial and genital herpes. Lancet. 1988; 1 (8578): 150-2.
11. Kuhls T.L., Sacher J., Pineda E. et al. Suppression of recurrent genital herpes simplex virus infection with recombinant alpha 2 interferon. J. Infect. Dis. 1986; 154: 437-42.
12. Ophir J., Brenner S., Bali R. et al. Effect of topical interferon-beta on recurrence rates in genital herpes: a double-blind, placebo-controlled, randomized study. J. Interferon Cytokine Res. 1995; 15: 625-31.
13. Долгих Т.И., Минакова Е.Ю., Запарий Н.С. Клиникоиммунологическая оценка эффективности применения каго-цела при лечении пациентов с рецидивирующей герпетической инфекцией. Герпес. 2010; 1: 15-8.
14. Ершов Ф.И., Кубанова А.А, Шульженко А.Е. Клиническая эффективность и механизм действия Аллокина-альфа у больных рецидивирующим генитальным герпесом. В кн.: Оппортунистические инфекции: проблемы и перспективы. Вып. 2. Омск: Издательство «Полиграфический центр»; 2005: 115-30.
15. Исаков В.А., Ермоленко Д.К., Коваленко А.Л. и др. Использование циклоферона в терапии рецидивирующего простого герпеса. Герпес. 2010; 1: 18-23.
16. Тутушкина Т.В., ШульженкоА.Е., Наровлянский А.Н. и др. Терапия кагоцелом генитальной хронической рецидивирующей герпес-вирусной инфекции. Цитокины и воспаление. 2005; 2.
17. Chee A.V., Roizman B. Herpes simplex virus 1 gene products occlude the interferon signaling pathway at multiple sites. J. Virol. 2004; 78: 4185-96.
18. Johnson K.E., Knipe D.M. Herpes simplex virus-1 infection causes the secretion of a type I interferon-antagonizing protein and inhibits signaling at or before Jak-1 activation. Virology. 2010; 396: 21-9.
19. Melchjorsen J., Siren J., Julkunen I. et al. Induction of cytokine expression by herpes simplex virus in human monocyte-derived macrophages and dendritic cells is dependent on virus replication and is counteracted by ICP27 targeting NF-kappaB and IRF-3. J. Gen. Virol. 2006; 87: 1099-108.
20. Mossman K.L., Saffran H.A., Smiley J.R. Herpes simplex virus ICP0 mutants are hypersensitive to interferon. J. Virol. 2000; 74: 2052-6.
21. Хаитов Р.М., Ярилин А.А., Пинегин Б.В. Иммунология. М.: ГЕОТАР-Медиа; 2011.
22. Vollstedt, Arnold S., Schwerdel C. et al. Interplay between alpha/ beta and gamma interferons with B, T, and natural killer cells in the defense against herpes simplex virus type 1. J. Virol. 2004; 78: 3846-50.
23. Муругин В.В., Зуйкова И.Н., Муругина Н.Е. и соавт. Дефицит дегрануляции NK-клеток у больных хронической рецидивирующей герпес-вирусной инфекцией. Иммунология. 2010; 31 (6): 284-9.
24. Murugin V., Zuikova I., Murugina N. et al. Reduced degranulation of NK cells in patients with frequently recurring herpes. Clin. Vaccine Immunol. 2011; 18 (9): 1410-5.
25. Муругин В.В., Муругина Н.Е., ПащенковМ.В. и соавт. Дегрануляция NK- и T-клеток у лиц пожилого возраста. Иммунология. 2011; 32 (5): 239-43.
Поступила 10.12.12
- 163 -
