CC BY
35
УДК 612.017.1
О.Ю. Леплина, М.А. Тихонова, Ю.П. Козлов, В.В. Ступак,
А.А. Останин, Е.Р. Черных
ХАРАКТЕРИСТИКА ^а-ИНДУЦИРОВАННЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК У БОЛЬНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ ГЛИОМАМИ ГОЛОВНОГО МОЗГА
ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН,
ФГУ Новосибирский НИИ травматологам и ортопедии Росздрава, Новосибирск
В работе проведено сравнительное исследование фенотипических свойств ДК, генерируемы) в присутствии GM-CSF и IFN-a (IFN-ДК) у здоровых доноров и больных злокачественнымр глиомами головного мозга (ЗОГМ), а также анализ их функциональной активности, в ton числе способности активировать Th 1 и Th2 ответ. Показано, что IFN-ДК больных характери зуются рядом фенотипических особенностей, свидетельствующих об определенной задержю их дифференцировки. Вместе с тем ДК больных характеризуются сохранной аллостимуля торной активностью в смешанной культуре лимфоцитов. Анализ влияния IFN-ДК на функ ции Т-клеток выявил, что ДК обследованных пациентов отличались умеренно повышенно£ ТЬ2-стимуляторной активностью и сниженной способностью стимулировать продукция GM-CSF. Тем не менее ДК больных ЗОГМ эффективно стимулировали Thl ответ, особеннс в культурах примированных Т-лимфоцитов, что обосновывает возможность их использова пия в качестве противоопухолевых ДК-вакцин.
Ключевые слова: дендритные клетки, IFN-a, Thl/Th2 цитокины, смешанная культура лимфоцитов, опухоли мозга
Дендритные клетки (ДК), будучи профессиональными антигенпрезентирующими клетками, обладают уникальной способностью примиро-вать наивные Т-лимфоциты и индуцировать иммунный ответ на различные, в том числе опу-хольассоциированные антигены [1]. Поэтому использование вакцин на основе ДК рассматривается в качестве одного из новых подходов в лечении опухолевых заболеваний. Успехи в развитии технологий получения значительного количества ДК из периферической крови [2] позволили апробировать ДК в лечении меланомы, рака предстательной железы, рака почки, лимфом и некоторых других форм злокачественных новообразований. При этом проведенные клинические испытания показали хорошую переносимость и клиническую эффективность ДК [3, 4]. Возможность генерации специфического иммунного ответа и увеличение продолжительности жизни при использовании вакцин на основе ДК была также продемонстрирована при лечении злокачественных глиом головного мозга (ЗОГМ), характеризующихся крайне неблагоприятным прогнозом и резистентностью к радио- и химиотерапии [5-8].
Традиционно в клинической практике ДК получают путем культивирования прилипающей фракции мононуклеарных клеток с ОМ-СБР и
1Ь-4 в течение 5-7 дней (незрелые ДК) с последующей стимуляцией их созревания в течение 24-48 часов с различными факторами (зрелые ДК) [2]. В то же время в последние годы в литературе активно обсуждается возможность быстрой генерации частично зрелых ДК при замене IЬ-4 на интерферон-а (1Р1ч[-а) [9, 10]. Генерируемые I этом случае ДК (1Р1Ч1-ДК) характеризуются высокой способностью к захвату антигена, миграции и активации ТЫ-ответа за счет экспрессии СС-хемокиновых рецепторов 115 (СС115) и И7 (СС117) [11-13]. Учитывая эти свойства, 1БК-ДК представляют значительный интерес в плане их потенциального использования в клинической практике в качестве противоопухолевых клеточных вакцин.
Проведенные нами ранее исследования показали возможность генерации 1РМ-ДК у больных злокачественными глиомами. ДК больных содержали достоверно меньшее количество С [3831 зрелых клеток, однако обладали способностью стимулировать пролиферацию в смешанной культуре лимфоцитов [14]. Целью настоящего исследования стало более детальное изучение особенностей дифференцировки и созревания 1Р]Ч-ДК у больных злокачественными глиомами и анализ их функциональной активности, в том числе способности активировать ТЬ1 и ТЬ2 ответ.
Материалы и методы
Группа обследованных включала 38 больных ЗОГМ (18 мужчин и 20 женщин), которые были прооперированы и наблюдались в клинике нейрохирургии ФГУ «ННИИ травматологии и ортопедии Росздрава» с 2002 по 2006 гг. Возраст больных варьировал от 16 до 69 лет (в среднем 42,3+3,8). Среди обследованных больных у 42,6% пациентов диагностировалась гистологически верифицированная глиобластома, у 57,4% — астроцитома 3-й степени анаплазии. Обследование всех пациентов проводилось при получении информированного согласия. Группу сравнения составили 32 донора крови, сопоставимых по полу и возрасту.
Мононуклеарные клетки (МНК) из гепари-низированной венозной крови получали центрифугированием в градиенте плотности фикол-ла-верографина. Моноциты выделяли на чашках Петри 33 мм2 (Nunclon, Дания) путем прилипания к пластику МНК (2-5х 106/мл) в присутствии 10% сыворотки крови AB(IV) группы. ДК генерировали путем культивирования прилипающей фракции МНК во флаконах для культивирования (BD Bioscienses Falcon, UK) в течение 3 сут в среде RPMI-1640 (Sigma, США), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10% сыворотки плодов коровы (БиолоТ, Санкт-Петербург), в присутствии GM-CSF (Leucomax, Шеринг-Плау, Швейцария) 1000 Ед/мл и INF-a (Роферон-А, Roche, Швейцария) 1000 Ед/мл с последующим дозреванием в течение 24 ч с липополисаха-ридом (ЛПС Е. coli 0114:В4, Sigma) 10 мкг/мл. Фенотипирование ДК проводили методом одноцветной или двуцветной проточной цитоф-люориметрии (FACS Calibur, Becton Dickinson) с использованием FITC-, АРС- или РЕ-ме-ченных антител (CDla, CDllc, CD14, CD25, CD83, CD123; PharMingen, San Diego, США). Аллостимуляторную активность ДК оценивали в реакции смешанной культуры лимфоцитов (CKJI). В качестве отвечающих клеток использовались МНК доноров (0Дх106/лунку), которые культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI-1640 (как описано выше) с 10% инактивированной сыворотки крови AB(IV) группы при 37 °С в С02-инкубаторе. Стимуляторами служили дендритные клетки в соотношении МНК : ДК = 100:1. Пролиферативный ответ оценивался на 5-е сут. радиометрически по включению 3Н-тимидина (1 мкКю/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования.
Оценку экспрессии внутриклеточных цитоки-нов в популяции Т-клеток, стимулированных ал-
логенными ДК, проводили методом трехцветной проточной цитометрии (FACS Calibur, Becton Dickinson). Для этого МНК, лишенные моноцитов, культивировали в 96-луночных планшетах в полной культуральной среде с 10% сыворотки плодов коровы в присутствии (опыт) и в отсутствие (контроль) ДК в соотношении 10:1 в течение 72 ч. За 18 ч до конца инкубации в культуру добавляли брефелдин 10 мкг/мл (ISN). Затем, клетки отмывали и инкубировали 15 мин при комнатной температуре с АРС-меченными моноклональными анти-СОЗ-антителами (Becton Dickinson, США). Далее проводили пермеабилизацию клеток с помощью 0,2% раствора Твин-20 и инкубировали их с моноклональными FITC-коньюгированными анти-INF-y антителами и PE-меченными анти-IL-4 или РЕ-меченными анти-IL-10-антителами (Becton Dickinson, США). Образцы анализировали на проточном цитометре с использованием программы Cellquest.
Продукцию Thl/Th2 цитокинов (TNF-a, IFN-y, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF) оценивали методом проточной флюориметрии на 2-лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем (определяемый динамический диапазон 2 — 32000 пкг/мл) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Концентрацию цитокинов определяли в 48-часовых супернатантах нервичной и вторичной СКЛ. Для этого МНК, лишенные моноцитов, активировали аллогенными ДК в течение 48 ч (первичная СКЛ), либо культивировали 5 суток с ДК и рестимулировали соответствующими ДК в последующие 48 ч (вторичная СКЛ). Соотношение МНК:ДК в обоих случаях составляло 10:1. При статистической обработке значения цитокинов, выходящие за нижнюю границу чувствительности метода (< 2 пг/мл), принимались за 1 пг/мл.
Математическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с использованием программы «Statistica 5.0».
Результаты и обсуждение
Сравнение эффективности генерации IFN-ДК у здоровых доноров и больных ЗОГМ показало, что в обеих исследуемых группах популяция прилипающих к пластику клеток была представлена в преобладающем большинстве CD 14+моноцитами (82,4±2,8 и 79,9+1,6% соответственно). В результате культивирования моноцитов периферической крови с GM-CSF и IFN-a в течение 3-4 суток клетки теряли способность прилипать к пластику и приобретали типичные морфологические черты дендритных клеток. Жизнеспособность клеток во всех экспериментах была не менее 90% и не разли-
чалась между исследуемыми группами. Выход ДК убольных и доноров был также схожим (0,1 ±0,01 *0,13+0,01 *106 Д К из 1 млн МНК). Тем не менее авализ фенотипических маркеров 1РЫ-ДК позволил выявить ряд особенностей (Таблица 1). Так, убольных отмечалось повышенное содержание меток с фенотипом моноцитов (СО!4^) и незрелых ДК (СБ1а+). В то же время относительное количество клеток с маркером зрелых ДК (С088) было умеренно снижено, и выявлялась тенденция к снижению доли зрелых активированных ДК ((Л)25+). Популяция П:М-ДК у больных ЗОГМ отличалась также более высоким содержанием СОНс* и СБ123* клеток.
Поскольку маркеры С083 и О) 1а характеризуют различные стадии созревания миелоидных ДК, в отдельной серии экспериментов мы исследовали коэкспрессию СБ83 и СТ)1а молекул на ДК (Таблица 2). В отличие от здоровых доноров, у которых большинство С 083 клеток не несли молекулу (Ю1а (маркер незрелых миелоидных клеток), значительная часть 1Б1Ч-ДК больных экспрессировала одновременно СО83 и СШ а молекулы либо только С01а-молекулы. В результате у больных отмечалось увеличение общего количества как незрелых С083 С01а+ДК, так и С083'С01а клеток (ДК промежуточной степени зрелости).
Таблица 1
Фенотипическая характеристика дендритных клеток у здоровых доноров и больных ЗОГМ
Маркеры Доноры Больные ЗОГМ
CD14 8,7±1,4 (32) 17,7±2,6 * (38)
CDla 10,4±2,0 (18) 19,3±4,5 * (9)
CDllc 28,7+2,2(18) 40,8+3,8 * (9)
CD123 24,9±2,64 (18) 34,0+4,6 * (9)
CD83 29,4±2,9 (32) 22,6±1,9 * (38)
CD25 25,1 ±3,5 (32) 19,2+ 2.3 (38)
Примечание: представлены средние значения процентного содержания различных субпопуляций клеток. В скобках количество наблюдений (п). * — Ри<0,05 — достоверность различий по сравнению с донорами (II — критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).
Таблица 2
Субпопуляционный состав дендритных клеток у здоровых доноров и больных ЗОГМ
Маркеры Доноры (n=18) Больные ЗОГМ (n-9)
CD83 'CDla- 20,1±2,0 15,8+2,3 *
CD83 'CDla’ 4,7+1,0 7,4±2,6 *
CD83 CDla1 5,4±1,9 13,5±3,2 *
CDllc *CD123- 17,6+3,7 22,9± 3,1
CDllc *CD123+ 6,7±1,1 17,4±2,9 *
CDllc CD123 14,3±2,3 16,2±3,5 *
Примечание: представлены средние значения процентного содержания различных субпопуляций клеток. В скобках количество наблюдений (п). * — Ри<0,05 — достоверность различий по сравнению с донорами (и — критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).
Одной из особенностей IFN-Д К является наличие на них рецептора к интерлейкину-3 (CD 123). Данный маркер высоко экспрессируется на плаз-мацитоидных ДК и практически отсутствует на ДК, генерируемых в присутствии GM-CSF и IL-4 [13]. Как следует из представленных ранее данных, относительное содержание CD123+ клеток у больных было повышено (Таблица 1). Причем одновременный анализ экспрессии CD 123 и CDllc показал, что у доноров большая часть CD123+ клеток сосредоточена в CDllc~ популяции, тогда как у больных данный маркер распределялся равномерно в популяциях CDllc+ и CDllc клеток. Соответственно, у больных относительное количество CD11+CD123* клеток было повышено более чем в 2 раза (17,4+2,9 против 6,7± 1,1 % у доноров, ри<0,05).
В целом представленные данные свидетельствуют о возможности генерации IFN-ДК из моноцитов периферической крови больных ЗОГМ. При этом ДК больных сходны с таковыми у доноров по количеству и жизнеспособности, но имеют некоторые фенотипические особенности. Как известно, популяция IFN-ДК является гетерогенной в отношении степени зрелости клеток, из которых только 25-30% экспрессируют маркеры зрелых (CD83) и активированных (CD25) ДК [12]. У больных ЗОГМ количество зрелых ДК умеренно снижено, причем большая часть этих клеток коэкспрессирует молекулу CDla, т.е. характеризуется промежуточной степенью зрелости. С другой стороны, отмечается увеличение субпопуляции незрелых миелоидных клеток CD83 CDla*. Таким образом, пациенты со злокачественными глиомами характеризуются некоторой задержкой дифференцировки миелоидных ДК. На это указывает также и более высокое содержание оставшихся в культуре С014+моноцитов. Другая особенность проявляется увеличением у больных субпопуляции ДК с наличием CD123 молекулы. Присутствие CD123 на IFN-ДК может быть связано со способностью IFN-a блокировать снижение экспрессии данной молекулы на поверхности моноцитов по мере их дифференцировки в ДК [15]. Соответственно, в случае задержки дифференцировки ДК у больных CD 123 может сохраняться на большем количестве ДК. Увеличение CDllc*CD123+ клеток может также отражать особенности функциональной активности моноцитов больных, например, увеличение на них экспрессии рецепторов к IFN-a [16]. Кроме того, нельзя исключить наличие среди прилипающих к пластику клеток предшественников плазмаци-тоидных ДК и, соответственно, их увеличение при злокачественных глиомах. Так, увеличение CD123+ плазмацитоидных клеток отмечается ря-
дом авторов при опухолевых заболеваниях, например, при злокачественных опухолях головы и шеи [17], а также при метастазирующих формах рака яичника [18,19]. В этом аспекте важно отметить, что возрастание СО 123 клеток у больных отмечалось не только в популяции С011с+, но и среди СОН клеток, т.е. лишенных маркера ми-елоидных ДК.
Особенности фенотипа ДК у больных могут быть связаны с изменением функциональных свойств моноцитов, которые являются источником генерации ДК. Действительно, показано, что моноциты больных злокачественными глиомами отличаются более низкой экспрессией НРАЛЖ антигенов и наличием супрессорной активности
[20]. В то же время известно, что простагландин Е2 и 1Ь-10, опосредующие супрессорную активность моноцитов, ингибируют дифференциров-ку моноцитов, индуцированную ОМ-СЗБ и ] 1.-4
[21].
Учитывая возможность потенциального использования 1РМ-ДК для терапии злокачественных глиом, наиболее важным представлялось исследовать — насколько они функционально сохранны. Для оценки способности 1РМ-ДК пре-зентировать антигены и активировать Т-клетки была исследована аллостимуляторная активность ДК здоровых доноров (п=34) и больных ЗОГМ (п=21). Оказалось, что ДК доноров и больных обладали выраженной аллостимуляторной активностью и индуцировали эффективный пролиферативный ответ МНК в соотношении 1:100. При этом уровень пролиферации в СКЛ, индуцированный ДК доноров и больных (13278±1130 и 11500+1400 имп/мин соответственно), и индексы стимуляции (19,6±1,6 и 15,6+4,4 соответственно) были сходными и статистически не различались.
Чтобы выяснить, какой тип Т-лимфоцитов активируется в присутствии 1РЫ-ДК, на следующем этапе была исследована способность ДК активировать ТЫ и ТЬ2 ответ. Анализ внутриклеточной продукции Т-клетками 1Р1Ч-у и 1Ь-4 в СКЛ показал, что стимуляция аллогенных МНК дендритными клетками здоровых доноров во всех случаях приводила к четкому усилению внутриклеточной продукции [РМ-у в популяции Т-лимфоцитов
(Таблица 3), что проявлялось в среднем 4-крат-ным возрастанием 1Р^-продуцирующих СОЗТ-клеток. ДК всех анализируемых пациентов также стимулировали внутриклеточную экспрессию №N-7 в популяции СОЗ+ Т-лимфоцитов. Однако увеличение количества I РК'у-позитнвиых С03'Т-клеток было менее выраженным (ръ.<0,05).
Исследование внутриклеточной экспрессии 1Ь-4 показало, что возрастание числа 1Ь-4-про-дуцирующих СОЗ'Т-клеток в присутствии ДК доноров и больных регистрировалось соответственно в 40 и 50% случаев, однако было невыраженным. Поэтому в целом по группе достоверного усиления внутриклеточной продукции 1Ь-4 не выявлялось. При этом даже в тех случаях, когда регистрировалось увеличение 1Ь-4-содержащих Т-клеток, 1Ь-4-стимуляторная активность ДК доноров и больных (2,9±0,97 и 2,23±0,33 соответственно) была ниже, чем индекс стимуляции 1Р1\1-у.
Для более детального изучения влияния 1Р№ ДК на функции Т-клеток, была также исследована продукция ТМ/провоспалительных и ТЬ2/ противовоспалительных цитокинов в супернатантах первичной и вторичной СКЛ (Таблица 4). ДК доноров индуцировали в первичной СКЛ существенную продукцию №N-7, ТКР-а и СМ-С8Р. В отличие от доноров, ДК больных индуцировали менее выраженную продукцию TNF-a и не вызывали усиления продукции ОМ-С^Р. Продукция была умеренно снижена, однако выявленные различия не были статистически значимы. Анализ ТЬ2-цитокинов показал, что ДК доноров в первичной СКЛ практически не индуцировали 1Ь-5 и 1Р-13, но стимулировали продукцию 1Ь-10. По сравнению с донорами ДК больных индуцировали более высокий уровень продукции 1Ъ-5 и 1Ь-13, но менее выраженную продукцию 11.-10.
Концентрация большинства исследуемых цитокинов (1Р1ч[-у, и СМ-СБР, 1Ь-5 и 1Ь-13) в супернатантах вторичной СКЛ, индуцированной ДК доноров, была более высокой по сравнению с таковой в первичной СКЛ, что свидетельствует об активации уже премированных Т-клеток. Т-клетки, рестимулированные в СКЛ дендритными клетками больных, характеризовались эффек-
Таблица 3
Влияние ДК здоровых доноров и больных ЗОГМ на внутриклеточную продукцию Т-клетками 1ПУ-у и 11-4
Источник ДК И-4
МНК(0) МНК(+ДК) ИВ МНК (0) МНК (+ДК) ИВ
Доноры 1,34±0,2 5,0±0,4 4,9+1,0 1,3+0,2 1,6±0,3 1,8+0,6
Больные ЗОГМ 0,94+0,24 2,7+0,5 * 3,5+0,б* 1,7±0,1 2,3+0,36 1,3±0,24
Примечание: представлено относительное содержание СИЗ Т-клеток здоровых доноров с внутриклеточной экспрессией 1РМ-у и 1Ь-4, в культурах МНК, лишенных моноцитов /МНК(0)] и активированных ДК [МНК(+ДК) ] здоровых доноров или больных ЗОГМ в течение 48 ч. * ~Ри <0,05 — достоверность различий при стимуляции ДК доноров и больных; Ри— критерий Вилкоксона-Манна-Уитни
Таблица 4
Влияние ДК доноров и больных ЗОГМ на продукцию Тк1/ТН2 цитокинов в первичной и вторичной СКЛ
Цитокины Периичная СКЛ Вторичная СКЛ
0 + ДК доноров (n=10) ИВ + ДК больных (n = 12) И В 0 + ДК доноров (n=10) И В + ДК больных (n-10) ИВ
IFN-y 28±25 476±109* 39±4,6 292±90* 15±4,5 46± 17 1500±356* 430±78 1116±311* 558±155
TNF-a 116±57 940±293* 14± ,8 241+102*# 8=t2,2 61 ± 19 95±21 23±7 132±27 4±1,4
IL-13 2,0+0,01 15+8,8 8±3,9 179±52*# 89±26# 78±22 314±43* 6± 1,3 744±158*# 15±4,8#
IL-5 2,0±0,01 11± ,9* 6±1,5 170±39*# 85± 19# 92±21 206±33* 4,6± 1,2 911±190*# 13±5,9#
IL-10 26+14 407±81* 19± 1,2 123±56*# 8±2,1 6±0,2 19±3* 3,4±0,5 15,6±5 8±2,4
GM-CSF 2,0±0,01 144±6* 73±13 2,0±0,01* # 1,0±0,1# 2±0,01 249±42* 125+21 28,6± 16* # 14±7,8#
Примечание: представлены средние значения концентрации цитокинов (т/мл) и индексы влияния ДК (ИВ) на продукцию цито-щюе в 48-часовых супернатантах первичной и вторичной СКЛ. Первичная СКЛ: МНК здоровых доноров, лишенные прилипающей фракции, культивировали 48 ч в отсутствие ДК (0) и в присутствии ДК доноров или больных ЗОГМ, после чего в супернатантах определяли концентрацию цитокинов. Вторичная СКЛ: МНК здоровых доноров, лишенные прилипающей фракции, культивировали е присутствии ДК допоров или больных в течение 5 сут, после чего реатшулировали соответствующими ДК в течение последующих 48 ч и определяли концентрацию цитокинов в собранных супернатантах. В качестве контроля оценивалась спонтанная продукция цитокинов, исследуемая в супернатантах МНК, лишенных моноцитов, которые культивировали 5 суток, отмывали и дополнительно культивировали 48 ч. * — Ри <0,05 — достоверность различий по сравнению с уров71ем спонтанной продукции; #Р <0,05 - достоверность различий в присутствии ДК доноров и больных ЗОГМ, Ри — критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.
тивной продукцией IFN-y, низким уровнем GM-CSF и более высоким уровнем продукции IL-5 и IL-13. Из чего следует, что ДК больных способны активировать примированные Т-клетки как к продукции Thl, так и Th2 цитокинов. Тем не менее при сравнении индексов стимуляторной активности способность к индукции IFN-y была на порядок выше, чем к активации Th2 цитокинов.
Согласно данным литературы, IFN-ДК индуцируют in vitro эффективную продукцию IFN-y в СКЛ [13]. Наряду с этим в супернатантах первичной СКЛ обнаруживается продукция Th2 цитокинов (IL-10, IL-4), источником которых, судя по внутриклеточной продукции цитокинов, являются ThO и Th2 [16]. Способность IFN-DC к активации клеточного и гуморального иммунного ответа продемонстрирована также in vivo в модели SCID мышей [10]. С этой точки зрения полученные нами данные о том, что IFN-ДК здоровых доноров активируют Thl и одновременно обладают умеренной ТЬ2-стимулирующей активностью, индуцируя продукцию Th2 цитокинов в СКЛ, согласуются с результатами исследований других авторов. В то же время нами впервые продемонстрировано, что помимо IFN-y, данный тип ДК стимулирует эффективную продукцию GM-CSF и TNF-a — цитокинов, обеспечивающих выживаемость, дифференцировку и созревание ДК.
Как следует из представленных выше данных, IFN-ДК больных также обладали способностью активировать Thl ответ. Однако при этом выявляется ряд особенностей. Во-первых, ДК больных характеризуются умеренно сниженной IFNy-сти-мулирующей активностью в культурах первично активированных Т-клеток, хотя примированные Т-клетки продуцировали такой же уровень IFN-y, как и при стимуляции ДК доноров. Во-вторых, по сравнению с донорами, ДК больных практичес-
ки не индуцировали продукции GM-CSF в первичной СКЛ и слабо стимулировали продукцию этого цитокина в культурах примированных Т-клеток. При сравнении ТЬ2-стимулирующей активности ДК больных и здоровых доноров мы получили разноречивые данные. С одной стороны, содержание IL-4-продуцирующих CD3+ Т-клеток в культурах первичной СКЛ, индуцированной ДК больных и здоровых доноров, не различалось. Более того, Д К больных слабее индуцировали продукцию IL-10 в супернатантах первичной СКЛ. С другой стороны, ДК больных стимулировали более высокий уровень IL-5 и IL-13 в первичной и вторичной СКЛ. Таким образом, при анализе цитокинов в супернатантах СКЛ ДК больных характеризовались повышенной Т1г2-стимулирую1цей активностью. Тем не менее важно отметить, что и в этом случае IFNy-стимулирующая активность была существенно выше, чем способность ДК индуцировать продукцию IL-5 или IL-13. Кроме того, обращал внимание тот факт, что при повторной стимуляции Т-клеток интенсивность индукции IL-5 и IL-13 заметно снижалась.
Моноциты периферической крови представляют собой пул предшественников, способных к быстрой дифференцировке в ДК. В условиях опухолевого роста продукция различных имму-нодепрессивных факторов ингибирует генерацию ДК и приводит к нарушению их функций [22]. Дисфункции ДК являются одним из критических механизмов ускользания опухоли от иммунного ответа. Поэтому восстановление функций ДК или генерация их in vitro и использование в последующем в качестве варианта адьювантной клеточной терапии рассматривается как новый подход в лечении злокачественных новообразований.
В научных исследованиях и клинической практике большое количество ДК обычно полу-
чают путем культивирования моноцитов периферической крови с GM-CSF и IL-4 [2]. Однако является ли данный путь генерации ДК физиологическим, остается спорным вопросом, поскольку продукция большого количества IL-4 в естественных условиях представляется маловероятной. К тому же имеются данные, что полученные в присутствии GM-CSF и IL-4 ДК характеризуются in vivo нарушенной миграционной активностью [23]. С этой точки зрения большой интерес представляют ДК, генерируемые в присутствии GM-CSF и IFN-a. Как известно, помимо антивирусной активности IFN-a обладает выраженным стимулирующим эффектом на клеточный и гуморальный иммунитет и индуцирует быструю дифференцировку моноцитов в ДК с высокой миграционной активностью. Кроме того, IFN-a продуцируется в больших количествах в ответ на стимуляцию инфекционными антигенами и про-воспалительными цитокинами, и, следовательно, активация интерфероновой системы, возможно, отражает ранний и более физиологический путь генерации in vivo ДК в ответ на инфекцию и опухолевый рост [10, 24]
Проведенные нами исследования продемонстрировали возможность генерации IFN-ДК у больных злокачественными глиомами. ДК больных характеризуются признаками некоторой задержки их дифференцировки, но при этом полностью сохраняют свою аллостимуляторную активность. По сравнению с донорами, ДК больных менее активны в плане запуска продукции Т-клетками TNF-a, обладают слабой способностью индуцировать продукцию GM-CSF и проявляют более выраженную Th2 стимулирующую активность. В то же время важно подчеркнуть, что IFN-ДК больных столь же эффективно активируют продукцию IFN-y в культурах примированных Т-клеток и, в целом, запуск ТЫ ответа является доминирующим. Это свидетельствует о сохранной Thl-стимулирующей активности ДК больных и позволяет надеяться, что их клиническое использование позволит индуцировать эффективный противоопухолевый ответ и повысить эффективность лечения злокачественных глиом головного мозга.
CHARACTERISTICS OF IFNa-INDUCED DENDRITIC CELLS IN MALIGNANT GLIOMA PATIENTS
O.Yu. Leplina, M.A. Tikhonova, Yu.P. Kozlov,
V.V. Stupak, A.A. Ostanin, E.R. Chernykh
The comparative analysis of phenotype and functional properties of IFN-a-induced dendritic cells (IFNa-DCs) in healthy donors and malignant glioma patients was performed in present study. It was
shown, that patient’s IFNa-DCs were characterized by some phenotypical peculiarities, indicating there defective differentiation. On the other hand, DCs of patients maintained the normal allostimulatory activity in mixed lymphocytes reaction. The analysis of DC influence on T-cell functions revealed that patient’s IFNa-DCs were characterized-by moderate enhancing of Th2-stimulatory activity and low capacity to induce GM-CSF production. Nevertheless, DCs in malignant glioma patients effectively stimulated Thl response, especially, in primed T-cell cultures that strongly suggest the possibility of IFNa-DC application as a basis for dendritic cell cancer vaccines.
Литература
1. Banchereau, J. Dendritic cells and control of immunity /J. Banchereau, R.M. Steinmann //Nature. — 1998.
- Vol.392. - P. 245-252.
2. Generation of large numbers of fully mature and stable dendritic cells from leukapheresis products for clinical applications / B. Thurner, C. Roder, D. Dieckmann, et al. //J. Immunol. Meth. - 1999. - Vol. 223. - P. 1-15.
3. Dendritic cell based therapy for cervical cancer -use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly / M. Adams, H. Navaba, B. Jasani, et al. // Vaccine. - 2003. - Vol. 21. - P. 787-790.
4. Baar,J. Clinical applications of dendritic cell cancer vaccines / J. Baar // Oncologist. — 1999. — Vol. 4. -P. 140-144.
5. Fenstermaker, R.A. Immunotherapeutic strategies for malignant glioma / R.A. Fenstermaker, M.J. Ciesielski // Cancer control. - 2004. - Vol. 11. - P. 181-190.
6. Soling, A. Dendritic cell therapy of primary brain tumors / A. Soling, G. Rainov // Mol. Med. — 2001. -Vol. 7. - № 10. - P. 659-667.
7. Dendritic cell-based glioma immunotherapy / R. Ya-manaka, N. Yajima, T. Abe, N. Tsuchiya // Int. J. Oncol.
— 2003. — Vol. 23. — P. 5-15.
8. Yu, J.S. Vaccination of malignant glioma patients with peptide-pulsed dendritic cells elicits systemic cytotoxicity and intracranial T-cell infiltration / J.S. Yu, C.J. Wheeler, P.M. Zeltzer // Cancer Res. — 2001. — Vol. 61.
- P. 842-847.
9. Santini, S. Advances in the use of dendritic cells and new adjuvants for the development of the development of therapeutic vaccines / S. Santini, F. Bellardelli // Stem, cells. - 2003. - Vol. 21. - P. 495-505.
10. Type I Interferon as a powerful adjuvant for mono-cyte-derived dendritic cells development and activity in vitro and in HU-PBL-SCID mice / S. Santini, C. Lapenta, M. Logozzi, et al. // J. Exp. Med. — 2000. — Vol. 191. — P. 1777-1788.
11. Differential regulation of human blood dendritic cell subsets by INFs / T. Ito, R. Amakawa, M. Inaba, et al. //J. Immunol. - 2001. - Vol. 166. - P. 2961-2969.
12. Expression of CCR-7, MIP-3b, and Thl chemokines in type I IFN-induced monocyte-derived dendritic cells
— importance for the rapid acquisition of potent migratory
- and functional activities / S. Parlato, S. Santini, C. Lapenta, etal.//Blood. - 2001 - Vol. 98. - P. 3022-3029.
13. A new type 1 IFN-mediated pathway for the rapid differentiation of monocytes into highly active dendritic cells / S. Santini, T. Pucchini, С Lapenta, et al. // Stem.
: cells. - 2003. - Vol. 21. - P. 357-362.
14. Частично-зрелые дендритные клетки как потенциальная основа для индукции противоопухолевого ответа у больных злокачественными глиомами / О.Ю. Леплина, М.А. Тихонова, Ю.П. Козлов, и др. // Мед. иммунология. — 2005. — Т. 7. — № 4. — С. 365-374.
15. Interleukin-3 and interferon-p cooperate to induce differentiation of monocytes into dendritic cells with potent T-cell stimulatory properties / C. Buelens, E.J. Bar-tolome, Z. Amraouzi, et al. // Blood. — 2002. — Vol. 99. -P. 993-998.
16. Functional repertoire of dendritic cells generated in granulocyte macrophage-colony stimulating factor and interferon-a/ S.D. Bella, S. Nicola, A. Riva, et al. //J. Leu-koc. Biol. - 2004. - Vol. 75. - P. 106-116.
17. Plasmacytoid dendritic cells accumulate in cuta-neus lupus erythematosus lesions / L. Parkas, K. Beiske, F. Lund-Johansen, et al. // Am. J. Phathology. — 2001. -Vol. 159.-P. 237-243.
18. Identification and functional analysis of tumor-infil-tration plasmacytoid dendritic cells on head and neck cancer/E. Hartmann, B, Wollenderg, S. Rothenfusser, et al. //
Cancer Research. — 2003. — Vol. 63. — P. 6478-6487.
19. Stromal-derived factor-1 in human tumor recruits and alters the function of plasmacytoid precursor dendritic cells / W. Zou, V. Machelon, V. Colomb-L-Hermin, et al. //Nat. Medicine. - 2001. - Vol. 7. - P. 1339-1346.
20. Характеристика и механизмы иммунных нарушений у больных со злокачественными опухолями головного мозга / Н.А. Хонина, М.И. Центнер, О.Ю. Леп-лина, и др. // Вопр. онкологии. — 2002. — Т. 48. — № 2.
- С. 196-201.
21. Prostaglandin Е2 induces the final maturation of IL-12-deficient CDla+CD83+ dendritic cells: the levels of IL-12 are determined during the final dendritic cell maturation and are resistant to further modulation / P. Kalinski, J.H. Schuitemaker, C.M. Hilkens, M.L. Kapsenberg //j. Immunol. — 1988. — Vol. 161. — P. 2804-2808.
22. Pinzon-Charry, A. Dendritic cell dysfunction in cancer: a mechanism for immunosuppression / A. Pinzon-Charry, T. Maxwell, J.A. Lopez // Immunol. Cell Biol.
- 2005. - Vol. 83. - P. 451-461.
23. Thumher, M. The disabled dendritic cell / M. Thurnher, C. Zelle-Rieser, R. Ramoner // FASEB. — 2001. -Vol. 15. - P. 1054-1061.
24. Brassard, D. Interferon-a as an immunotherapeutic protein / D. Brassard, M. Grace, R.W.J. Bordens //J. Leu-koc. Biol. - 2002. - Vol. 71. - P. 565-581.
t
