CC BY
82
УДК 631.461:631.445.24
ВЛИЯНИЕ ИНТЕНСИВНОГО ЗЕМЛЕПОЛЬЗОВАНИЯ НА МИКРОБНЫЙ КОМПЛЕКС ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЫ РЯЗАНСКОЙ ОБЛАСТИ
© Н.Ю. Пухова, Н.В. Верховцева, Д.Э. Пухов, Г.Е. Ларина
Ключевые слова: микробный комплекс; ГХ-МС; доминирующий вид; общая численность микроорганизмов; фи-лум.
Представлен анализ реконструированного с помощью молекулярного метода газовой хромато-масс - спектрометрии (ГХ-МС) микробного комплекса дерново-подзолистой почвы Рязанской области с различной антропогенной нагрузкой (целина, залежь, пашня). Показано, что интенсивное землепользование существенно изменяет структуру микробного комплекса и соотношение различных систематических групп прокариот.
ВВЕДЕНИЕ
Почвенные микроорганизмы как часть живого вещества нашей планеты играют существенную роль, а иногда - и единственную, в ряде геохимических процессов и реагируют на изменение условий окружающей среды. Так, неизбежным результатом активного сельскохозяйственного использования почв любого типа является изменение условий обитания микробиоты и, как следствие, изменение структуры почвенного микробного комплекса. Современные методы микробиологии, благодаря чувствительности и информативности, позволяют оценить изменения в почвенном микробном сообществе, происходящие в почве, которые подвержены антропогенному влиянию.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служили реконструированные микробные комплексы верхнего (пахотного) горизонта (0-20 см) дерново-подзолистой почвы (Рязанская область, Спасский район). Почвенные образцы отличались по антропогенной нагрузке: целина (контроль), некошеная залежь и пашня (почва находится под постоянным севооборотом, возделываемая культура на момент отбора образцов - озимая пшеница). В полевых условиях методом «конверта» из 5-7 индивидуальных проб составляли смешанный образец. Отбор
проводили в шахматном порядке почвенным буром диаметром 25 мм, объем каждой пробы составлял 200250 см3 (ГОСТ 28168-89). Смешанный образец подсушивали при комнатной температуре и, поместив в стерильный полиэтиленовый пакет, хранили до анализа в морозильной камере.
В исследуемых почвенных образцах было определено содержание гумуса бихроматным методом [1]. Определение общей численности микроорганизмов в почвенных образцах осуществляли с помощью метода Виноградского-Брида из разведения 10-5 [2]. Методом Коха определяли численность копиотрофных микроорганизмов на мясо-пептонном агаре (МПА) и численность спорообразующих бактерий на сусло-агаре [3]. Молекулярным методом ГХ-МС определяли специфические химические маркеры поверхностных структур микроорганизмов (жирные кислоты, альдегиды, гидро-ксикислоты), по которым был реконструирован родовой (видовой) состав почвенных микробных комплексов [4]. Исследования проводили на хромато-масс -спектрометре АТ 5973 D фирмы Agilent Technologies (США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Полученные в процессе работы значения по содержанию гумуса в верхнем горизонте исследованных почвенных образцов характерны для дерново-подзо-
листых почв, максимальное значение отмечено для целины (4,1 %), немного меньше в верхнем горизонте залежи (3,2 %). Как и следовало ожидать, гумуса меньше всего в почве, подвергающейся постоянной сельскохозяйственной нагрузке, - 2,8 %; это объясняет, почему общая численность микроорганизмов и численность копиотрофов, т. е. микроорганизмов, способных расти при высоком содержании органического вещества в среде, снижается в ряду целина > залежь > пашня (табл. 1, значения N). Так, общая численность микроорганизмов в верхнем горизонте пашни на порядок ниже, чем в целине и примерно в 2,4 ниже, чем в залежи.
Коэффициенты сукцессии, рассчитанные для микробных комплексов верхних горизонтов дерновоподзолистой почвы с различной антропогенной нагрузкой, отличались на порядок между целиной и залежью, а между залежью и пашней - в 3 раза (табл. 1). Таким образом, с учетом спорообразующих бактерий, общая численность микроорганизмов в микробном комплексе целины только примерно в 2 раза превышает численность копиотрофов; при этом для залежи и пашни это соотношение на порядок выше. Данный факт свидетельствует о том, что обеспеченность легкоразлагае-мым органическим веществом микроорганизмов в условиях постоянной сельскохозяйственной нагрузки (пашня) существенно ниже, чем в нетронутой почве (целина). Коэффициент сукцессии для микробного комплекса залежи в 3 раза ниже, чем в пашне и на один порядок выше, чем в целине, т. е. микробный комплекс залежи ближе по этому показателю к пашне, чем к целине.
По микробным маркерам с помощью молекулярного метода ГХ-МС была проведена реконструкция микробных комплексов, результаты представлены в табл. 2.
При рассмотрении микробных комплексов на основе филогенетической системы классификации микроорганизмов отмечено, что в верхних горизонтах дерново-подзолистой почвы Рязанской области присутствуют прокариоты, относящиеся к четырем филумам: В12 РШеоЬас^епа (объединяет морфологически и физиологически разнообразные формы, полифилетическая группа), B13 Firmicutes (преимущественно грамполо-жительные бактерии с низким содержанием Г+Ц в ДНК), B14 ЛсЛтоЬасіегіа (грамположительные бактерии с высоким содержанием Г+Ц в ДНК) и B20 БасЛе-
Таблица 1
Некоторые микробиологические показатели дерново-подзолистой почвы с различной антропогенной нагрузкой
№ п/п Показатель Почвенный образец
целина залежь пашня
1 N1*, Ч 107 38,9 і 0,18 8,0 і 0,17 3,4 і 0,66
2 N2**, Ч 107 33,0 і 0,66 2,5 і 0,62 1,0 і 0,58
3 N3***, Ч 107 11,7 і 0,33 1,8 і 0,13 0,9 і 0,12
4 К~'" ~ 1,83 ~ 11,4 ~ 34,0
Примечание: (*) N1 - общая численность микроорганизмов, в кл/г воздушно-сухой почвы; (**) N2 - численность микроорганизмов на МПА, в КОЕ/г; (***) N3 - численность спорообразующих бактерий, в КОЕ/г; (****) К - коэффициент сукцессии, рассчитанный как рекомендовано в работе [5].
Таблица 2
Видовой состав реконструированного микробного комплекса и численность микроорганизмов верхнего слоя (0-20 см) дерново-подзолистой почвы с различной антропогенной нагрузкой по данным ГХ-МС
№ Вид Численность, Ч106 кл/г
микроорганизмов целина 1 залежь | пашня
PROTEOBACTERIA
1 Acetobacter diazotrophicus 11,38 3,06 1,80
2 Acetobacterium sp. 3,31 1,97 0,41
3 Agrobacterium radiobacter 8,81 2,52 1,02
4 Brevundimonas vesicularis 3,48 0,60 0,53
5 Butyrivibrio sp. 18,65 4,40 1,12
6 Cytophaga sp. 1,46 0,30 0,25
7 Desulfovibrio sp. 2,08 0,73 0,09
8 Eubacterium sp. 0,02 * 0,09
9 Pseudomonas fluorescens 6,49 1,50 1,64
10 P. putida 1,13 0,14 0,08
11 Sphingomonas capsulata 1,84 0,44 0,26
12 Staphylococcus sp. 3,14 0,82 0,54
13 Stenotrophomonas sp. 12,60 0,88 0,53
14 Wolinella sp. 3,08 0,88 0,44
ACTINOBACTERIA
15 Actinomadura roseola 8,01 1,72 0,93
16 Arthrobacter sp. 7,22 2,14 0,94
17 Corynebacterium sp. - 0,89 0,05
18 Mycobacterium sp. - 0,68 -
19 Nocardia carnea - 0,43 0,17
20 Propionibacterium sp. 7,64 4,78 2,22
21 Pseudonocardia sp. 3,58 0,39 0,38
22 Rhodococcus equi 48,04** 8,92 4,98
23 R. terrae 5,08 0,35 0,40
24 Streptomyces sp. 33,00 - 3,45
FIRMICUTES
25 Bacillus subtilis 2,27 0,36 0,25
26 Bacillus sp. 11,01 0,52 1,14
27 Clostridium difficile 0,55 0,36 0,15
28 C. pasteurianum 33,20 9,91 3,56
29 C. perfringens 0,16 0,02 0,02
30 C. propionicum 2,43 0,78 -
31 Ruminococcus sp. 108,42 20,09 1,19
BACTEROIDETES
32 Bacteroides hypermegas 0,25 0,10 0,07
33 B. ruminicola 1,63 0,33 0,21
34 Sphingobacterium spirito-vorum 3,57 0,84 0,44
FUNGI
35 Aspergillus sp. 0,37 0,05 -
36 Грибы (другие виды)*** 34,12 7,25 4,08
Примечание: (*) - данный вид не отмечен в реконструированном микробном комплексе; (**) - полужирным шрифтом выделена численность доминирующих видов в микробных комплексах; (***) - выражено в отн. ед., согласно расчетам, приведенным в статье [6].
roidetes (грамотрицательные микроорганизмы разной морфологии и физиологии), а также представители царства Fungi.
Согласно представленным в табл. 2 данным, в состав микробных сообществ верхних горизонтов дерново-подзолистой почвы с различной антропогенной нагрузкой входят грамположительные и грамотрицатель-ные прокариоты с разными эколого-физиоло-
гическими потребностями к условиям окружающей среды. По отношению к концентрации молекулярного кислорода в микробных комплексах встречаются аэробные, микроаэробные, факультативно анаэробные и строго анаэробные виды. Подавляющее число видов относится к хемоорганотрофам дыхательного или бродильного типа метаболизма. Входящие в микробные комплексы строго анаэробные бактерии Clostridium sp. и Butyrivibrio sp. осуществляют маслянокислое брожение, способны разлагать моно- и полисахариды (например, целлюлозу, крахмал и пектин) с образованием масляной кислоты. Сахаролитические бактерии C. pas-teurianum активно фиксируют молекулярный азот. Другой вид клостридий, отмеченный в микробном комплексе, - C. perfringens разлагает в анаэробных условиях белки до аммония. Анаэробы Ruminococcus sp. разлагают углеводы с образованием смеси кислот, главным образом, уксусной, пропионовой и масляной, а также этанола, СО2 и Н2.
Кроме того, в почвенных образцах отмечены молекулярные маркеры, характеризующие микромицеты, среди которых по специфическим для этого рода маркерам был реконструирован Aspergillus sp. Согласно полученным данным, представители этого рода были отмечены для целины и залежи, в образцах пашни методом хемодиагностики они не были обнаружены.
При сравнении микробных комплексов целины и пашни можно отметить, что как общая численность (табл. 1), так и численность всех отмеченных видов (родов) микроорганизмов снижается в пахотном горизонте пашни по сравнению с верхним горизонтом целины (табл. 2). Тем не менее, имеются виды, которые характерны только для пахотного горизонта, маркеры
которых отсутствуют по данным ГХ-МС в целинном образце; к ним относятся актинобактерии Coryne-bacterium sp. и Nocardia carnea. Данные виды характерны также для микробного комплекса залежи; при этом только для залежи характерно присутствие акти-нобактерии Mycobacterium sp. По экологической стратегии в природных почвенных микробных комплексах актинобактерии относятся к ^"-стратегам, т. е. конкурентоспособны за счет медленного роста, выживающие при наличии невысоких концентраций различных органических веществ в среде, в т. ч. способны использовать в качестве органического субстрата гумусовые вещества почвы.
Анализируя состав и численность (табл. 2), а также долю актинобактерий (рассчитывается как отношение численности актинобактерий к общей численности, выраженную в % (рис. 1)) в микробных комплексах дерново-подзолистой почвы с различной антропогенной нагрузкой, по данным метода ГХ-МС, можно заключить следующее. Во-первых, в залежи и пашне видовое разнообразие актинобактерий (по 9 видов) выше, чем в целине (7 видов). Во-вторых, несмотря на меньшее видовое разнообразие актинобактерий в верхнем горизонте целины, численность представителей данной группы микроорганизмов в целинной почве гораздо выше, чем в залежи и пашне (табл. 2). Тем не менее, в почве, подвергающейся постоянной сельскохозяйственной нагрузке, доля актинобактерий в микробном комплексе существенно выше и составляет 41 % по сравнению с целиной и залежью: доля актино-бактерий в этих почвенных образцах составляет 29 и 26 % соответственно (рис. 1).
Некоторые представители актинобактерий являются доминантами (численность доминирующего вида составляет не менее 10 % от общей численности микроорганизмов) в исследуемых микробных комплексах дерново-подзолистой почвы (табл. 2). Например, акти-нобактерия Rhodococcus equi является доминирующим
Fungi
9%
целина
Bacteroidetes 1%
Firmicutes 41%
Fungi
залежь
Proteobacteria
23%
Actinobacteria 26%
Рис. 1. Структура микробных комплексов дерново-подзолистой почвы в зависимости от антропогенной нагрузки
видом во всех исследованных почвенных образцах, несмотря на их различную сельскохозяйственную нагрузку. Кроме того, актинобактерия Streptomyces sp., маркеры которой не обнаружены в почве залежи, является доминирующим видом для пахотного горизонта (доля 10,3 %) и близка к доминирующему виду в составе микробного комплекса целины (~ 8,5 %).
По-видимому, в результате присутствия сразу двух доминирующих видов актинобактерий Rhodococcus equi и Streptomyces sp. в микробном комплексе почвы, находящейся в условиях интенсивного землепользования, общая доля актинобактерий в пахотном горизонте существенно выше по сравнению с примерно одинаковыми долями актинобактерий в целинной почве и в залежи.
Бактерии Ruminococcus sp. являются доминантами в верхнем горизонте почвы, не подверженной сельскохозяйственной нагрузке, и в залежи. Доля этого вида в целинном образце составляет 27,9 %, а в залежи -25,4 %. В почве пашни доля Ruminococcus sp. в микробном комплексе составляет всего 3,4 %. По-видимому, за счет руминококков представительство прокариот филума Firmicutes в почве целины (41 %) и залежи (40 %) приблизительно в два раза выше, чем в пашне (19 %). Кроме того, принадлежащая к этой же группе прокариот, анаэробная бактерия C. pasteurianum входит в число доминирующих видов в верхнем горизонте залежи и пашни, ее доля в микробных комплексах составляет 12,5 и 10,6 % соответственно. Этот вид не является доминирующим в верхнем горизонте целины, но очень близок к этому статусу (8,6 %).
По структуре микробные комплексы верхних почвенных горизонтов залежи и целины очень близки (рис. 1). Интенсивное землепользование исследуемой нами дерново-подзолистой почвы приводит к увеличению процентной доли почвенных грибов. Так, в почве целины и залежи грибы составляют около 9 %, в пашне -12 %. Известно, что увеличение численности микроми-цетов и накопление в почве их метаболитов в условиях постоянной сельскохозяйственной нагрузки может привести к почвоутомлению, приводящему, в свою очередь, к снижению почвенного плодородия [5].
Сравнение образцов дерново-подзолистой почвы с различной сельскохозяйственной нагрузкой в отношении других филумов прокариот показало, что доля бактерий, относящихся к филуму B20 Bacteroidetes, в микробных комплексах остается на невысоком уровне: в целинном образце всего 1 %, а в залежи и пашне немного выше - 2 %. Кроме того, в почве, подвергающейся постоянной сельскохозяйственной обработке, доля протеобактерий несколько выше (26 %), чем в целине (20 %) и залежи (23 %). Необходимо отметить, что среди бактерий этого филума не отмечено ни одного доминирующего вида, только протеобактерии Ace-tobacter diazotrophicus и Pseudomonas fluorescens в пахотном горизонте имеют существенную долю в микробном комплексе, но не доходят до статуса доминирующих - 5,4 и 4,9 % соответственно.
ВЫВОДЫ
Таким образом, на основании полученных результатов были сделаны следующие выводы.
1. Общая численность микроорганизмов и численность копиотрофов в дерново-подзолистой почве (Рязанской обл.) зависела от антропогенного использования: снижалась в ряду целина > залежь > пашня.
2. Доля копиотрофных видов в микробном комплексе целины была на порядок выше, чем в залежи и в пашне, преобладали микроорганизмы с К-страте-гией.
3. Доминирующей ассоциацией в целинной дерново-подзолистой почве является аэробно-анаэробная ассоциация двух видов Яиттососсиз 8р. и КЬойосос-ст вдш. В пахотном горизонте происходило замещение руминококков на два других доминирующих вида прокариот - Streptomyces 8р. и С. pasteu-папит. По доминирующим видам микробный комплекс залежи занимает промежуточное положение между целиной и пашней, он включает: Киттососст 8р. и КкоЗососсж вдш (как в целине), а также С. раз-teurianum (как в пашне).
4. Интенсивное землепользование приводило к изменению структуры микробных комплексов: в пашне по сравнению с целиной возрастала процентная доля актинобактерий, представителей филумов В12 РШео-ЬаМепа и B20 Bacteroidetes, а также почвенных грибов; в то же время в пахотном горизонте доля бактерий филума B13 Firmicutes снижалась в 2 раза по сравнению с целиной.
5. По структуре микробные комплексы верхних почвенных горизонтов залежи и целины очень близки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Минеев В.Г., Сычев В.Г., Амельянчик О.А. [и др.]. Практикум по агрохимии: учеб. пособие / под ред. проф. В.Г. Минеева. М.: Изд-во МГУ, 2001. 689 с.
2. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М., [и др.]. Практикум по микробиологии: учеб. пособие / под ред. проф. А. И. Нетрусо-ва. М.: Академия, 2005. 608 с.
3. Лысак Л.В., Добровольская Т.Г., Скворцова И.Н. Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий: учеб. пособие. М.: МАКС Пресс, 2003. 120 с.
4. Осипов Г.А. Способ определения родового (видового) состава ассоциации микроорганизмов: патент на изобретение № 2086642 от 10.08.97. 12 с.
5. Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв: учебник. 3-е изд., испр. и доп. М.: Изд-во МГУ, 2005. 445 с.
6. Верховцева Н. В., Осипов Г. А. Метод газовой хроматографии-масс-спектрометрии в изучении микробных сообществ агроценоза // Проблемы агрохимии и экологии. 2008. № 1. С. 51-54.
Поступила в редакцию 20 сентября 2012 г.
Pukhova N.Y., Verkhovtseva N.V., Pukhov D.E., Larina G.E. INFLUENCE OF INTENSIVE AGRICULTURAL LAND USE ON MICROBIAL COMPLEX OF TURF-PODSOLIC SOIL OF RYAZAN AREA
The analysis of gas chromatography-mass spectrometry a microbial complex of turf-podsolic soil (Ryazan area) reconstructed by molecular method at various anthropogenic influences (arable land, long fallow, virgin soil) is presented. It is shown, that intensive agricultural land use essentially changes structure of microbial complex and parity of various systematic groups prokaryotes.
Key words: microbial complex; gas chromatography - mass spectrometry; dominating species; total number of microorganisms; filum.
