CC BY
90
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК: 579.26
СТРУКТУРА И РАЗНООБРАЗИЕ ПОЧВЕННЫХ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ В БУГРИСТЫХ БОЛОТАХ СЕВЕРО-ЗАПАДА БОЛЬШЕ-ЗЕМЕЛЬСКОЙ ТУНДРЫ
Е.М. ЛАПТЕВА *, Ю.А. ВИНОГРАДОВА*, Т.И. ЧЕРНОВ**, В.А. КОВАЛЕВА*, Е.М. ПЕРМИНОВА*
*Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, г. Сыктывкар **Почвенный институт им. ВВ. Докучаева, г. Москва lapteva@ib.komisc.ru
Проведен анализ микробных комплексов мерзлотной торфяной почвы плоскобугристого болота лесотундры. Установлены пределы варьирования в ней суммарной микробной биомассы (1,7 - 15,3 мг/г субстрата). Показано, что в ее формировании основную роль играют споры и мицелий грибов (97,399,8%). Микробная биомасса в профиле торфяной почвы распространена неравномерно. Ее максимальные запасы приурочены к срединной части профиля (10-20 см), что определяется наибольшим содержанием здесь клеток бактерий, спор и мицелия грибов. В мерзлых слоях торфа величина микробной биомассы сопоставима с таковой в сезонно-талых слоях профиля торфяной почвы. Установлено, что в верхней части сезонно-талого слоя (0-30 см) в бактериальном комплексе преобладают по численности «живые» бактерии (клетки бактерий с неповрежденной мембраной). В надмерзлотных горизонтах (30-55 см) и в верхних слоях многолетнемерзлой толщи (55-90 см) основу комплекса составляют бактериальные клетки с поврежденной клеточной мембраной (56-66% от общего числа клеток бактерий). Выявлена специфика таксономического состава прокариот, функционирующих в сезонно-талой и мерзлой толщах торфа. Прокариотный комплекс верхней части мерзлотной торфяной почвы бугристого болота лесотундры представлен преимущественно филумами бактерий Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Planctomycetes, Proteobacteria и Verrucomicrobia, нижней (мерзлой) - Actinobacteria, Firmi-cutes, Bacteroidetes и Proteobacteria. Доминирование спорообразующих бактерий филума Firmicutes косвенно свидетельствует о том, что большая часть микробного комплекса мерзлого торфа состоит из микроорганизмов, способных образовывать устойчивые к низким температурам покоящиеся формы.
Ключевые слова: плоскобугристое болото, торфяные почвы, микробная биомасса, микромицеты, таксономический состав прокариот
E.M. LAPTEVA, YU.A. VINOGRADOVA, T.I. CHERNOV, V.A. KOVALEVA, E.M. PERMINOVA. STRUCTURE AND DIVERSITY OF SOIL MICROBIAL COMMUNITIES IN THE PERMAFROST PEATLANDS IN THE NORTHWEST OF BOLSHEZEMELSKAYA TUNDRA
The analysis of microbial complexes of permafrost peat soil of the forest-tundra flat permafrost peatlands was made. The study object is located in the northwestern part of Bolshezemelskaya tundra, within the above-floodplain terrace of the valley of the lower reaches of the Pechora river (latitude 67° 39'10.7'' North, longitude 53° 23'24.9'' East). Microbial communities were studied by a complex of classical and present-day molecular genetic methods. Molecular genetic studies were performed on the basis of PCR-based diagnostics of amplificated fragments of 16S rRNA genes of bacteria and archaea. As the study result, the limits of variation of total microbial biomass (1.7-15.3 mg / g of substrate) in peat permafrost soil of permafrost peatlands were established. Microbial biomass in the profile of peat soil is distributed unevenly. Its maximum concentration (value) is confined to the middle part of the profile (10-20 cm), which correlates with the maximal content of bacterial cells, spore and mycelium of fungi. In the frozen peat layers, the value of microbial biomass is comparable to that of the active layers of the peat soil profile. The fungal mycelium plays the basic role (97.3-99.8%) in the formation of microbial biomass structure, bacteria account for an insignificant part (0.2-2.7%). In the upper part of the active layer (0-30 cm) bacteria cells with an intact cell membrane (58-84%) prevail, in the supra permafrost horizons (30-55 cm) and the upper layers of the permafrost (55-90%)
bacterial cells with damaged cell membrane (56-66%) dominate. The prokaryotic complex of the active layer of peat soil of the forest-tundra permafrost peat-lands is represented mainly by phyla of bacteria Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Planctomycetes, Proteo-bacteria and Verrucomicrobia, lower (frozen) - Acidobacteria, Firmicutes, Thau-ma-rchaeota. The high representation of the spore-forming bacteria of the phylum Firmicutes indirectly indicates that most part of the microbial complex of the frozen peat is represented by microorganisms capable of forming low tem-perature resistant resting forms.
Keywords: permafrost peatlands, peat soils, microbial biomass, micromyces, taxonomy composition of prokaryotes
Введение
Почвенная микробиота - важнейший компонент наземных экосистем, определяющий скорость и направление протекания большинства биохимических реакций, лежащих в основе биологического круговорота органического вещества, мобилизации элементов питания и их миграции в системе «почва - растение». Разнообразие микробных комплексов, их структура, качественные и количественные параметры определяются спецификой растительных сообществ, а также почвенными и климатическими условиями. Суровые условия Крайнего Севера оказывают существенное влияние на биоразнообразие арктических и субарктических экосистем, однако низкие температуры не являются лимитирующим фактором для распространения и функционирования в почвах микроорганизмов. Совершенствование методических подходов к оценке биоразнообразия микробных сообществ [1, 2] позволило существенно расширить представление об их таксономическом разнообразии в почвах, формирующихся в экстремальных условиях криолито-зоны. В результате проведенных исследований были обнаружены жизнеспособные микроорганизмы не только в различных генетических типах мерзлых отложений [3], но и природных льдах [4].
Характерным компонентом ландшафтов тундры и лесотундры являются бугристые болота. Они занимают депрессии надпойменных террас рек, а также плоские выровненные поверхности водоразделов. Почвенный покров бугристых болот ком-
плексный, представлен торфяными мерзлотны-ми почвами бугров (мерзлота в первом метре профиля) и торфяными олиготрофными почвами межбугровых понижений. Межбугровые понижения (топи, мочажины) могут быть как талыми (южная лесотундра), так и мерзлыми (северная лесотундра, тундра) [5]. Микробные сообщества в почвах торфяных бугров функционируют в двух резко различающихся по экологическим условиям зонах - в пределах сезон-но-талого слоя (СТС), периодически подвергающегося процессам промерзания-оттаивания, и в пределах мерзлой толщи, где в течение длительного промежутка времени сохраняются отрицательные температуры. В настоящее время получена достаточно обширная информация о структуре и филогенетическом разнообразии микробных сообществ в торфяных почвах болот бореальной зоны [6, 7]. Однако микробные сообщества почв мерзлотных крупно- и плоскобугристых болот, широко распространенных на территории Арктики и Субарктики, остаются практически не исследованными.
Цель данной работы заключалась в оценке особенностей формирования структуры и разнообразия микробных сообществ в торфяных почвах мерзлотных бугристых болот лесотундры.
Объекты и методы исследований
Исследования проводили в августе 2015 г. в северо-западной части Большеземельской тундры (БЗТ) на территории Ненецкого автономного округа за пределами Полярного круга (рис. 1). Климат данной территории формируется под влиянием перио-
дического вторжения атлантических воздушных масс, оказывающих смягчающее влияние на погодные условия района исследований, по сравнению с центральной и восточной частью БЗТ. Среднегодовая температура в районе г. Нарьян-Мар - минус 3.1 °С. Зима суровая и продолжительная, период с отрицательными температурами воздуха составляет 220-240 дней. Средняя температура самого холодного месяца (январь) - минус 17.2°С, самого теплого (июль) - плюс 13.5 °С (по данным информационного сайта http://www.meteo-tv.ru). За год выпадает в среднем 503 мм осадков. Основное их поступление приходится на летне-осенний период (64-65%) с максимумом в августе (62-67 мм) и сентябре (52-61 мм) месяце. Низкие температуры воздуха и слабая испаряемость способствуют развитию избыточного увлажнения почв, активному заболачиванию и формированию на плоских террасах и водоразделах различного типа болот.
Согласно почвенно-географическому районированию, район исследования относится к Канино-Печорской провинции тундровых глеевых, болотно-тундровых и болотных мерзлотных почв. В геоморфологическом отношении рассматриваемая территория находится в пределах низменной равнины нижней Печоры, для которой характерно распространение бугристо-мочажинных, бугристо-грядо-во-мочажинных и грядово-мочажинных болот с высотой гряд и бугров от 30 см до 5 м. На территории БЗТ повсеместно распространены многолетне-мерзлые породы (ММП), характер залегания которых (сплошное, прерывистое, массивно-островное, островное) отвечает природно-климатической и геокриологической зональности БЗТ [5]. Территориально район проведения работ приурочен к зоне лесотундры, характеризующейся массивно-островным распространением многолетнемерзлых пород. В рассматриваемом районе глубина залегания ММП в пределах бугристых болот варьирует от 3060 см на торфяных буграх до 140 см и более - в мочажинах (топях).
Непосредственным объектом исследования послужили почвы бугристо-мочажинного болотного комплекса (рис. 2а), расположенного в пределах надпойменной террасы правобережной части долины нижнего течения р. Печора (67°39'10.7'' с.ш.; 53°23'24.9'' в.д.). Основную часть площади болотного комплекса занимают плоские бугры высотой до 1-1.5 м. Их поверхность характеризуется мелкобу-горковатым нанорельефом. Растительный покров бугров представлен кустарничково-мохово-лишай-никовыми сообществами из Betula nana L., Ledum decumbens L., Empetrum hermaphroditum L., Vacci-nium vitis-idaea L. Мохово-лишайниковый ярус составлен преимущественно дикрановыми мхами и лишайниками из родов Cladonia, Cetraria и Flavoce-traria. Соотношение мхов и лишайников на бугорках и в межбугорковых пространствах различно. В напочвенном покрове последних, как правило, преобладают кустистые олиготрофные лишайники. Мочажины заняты пушицево-осоково-сфагновыми сообществами, типичными для обводненных участков (топей) бугристых болот лесотундры [8].
В соответствии с листом Государственной почвенной карты Q-39 "Нарьян-Мар" М 1:1 000 000 [9], в рассматриваемом регионе почвы торфяных бугров в комплексе бугристых болотных экосистем относятся к тундровым остаточно-торфяным мерзлотным, почвы мочажин - болотным верховым мерзлотным. Глубина оттаивания верхних слоев торфа в пределах торфяного бугра на момент проведения исследований (август 2015 г.) составила около 50-55 см (рис. 2б), что потребовало ручной выемки мерзлой толщи торфа до глубины 115 см для возможности отбора образцов из верхней части мерзлых отложений. Морфологическое строение профиля торфяной мерзлотной почвы может быть выражено формулой:
0-4 4-20 20-30 30-47 47-55 55-115
Т1-Т2-Т3-Т4-Т5-Т61--1
4 16 10 17 8 60
Рис. 2. Ландшафт бугристо-мочажинного болота (а) и профиль почвы торфяного бугра (б). Fig. 2. The landscape of the permafrost peatland (a) and the peat soil profile (b).
Образцы торфа из СТС и верхнего слоя ММП отбирали с соблюдением условий, препятствующих биологической контаминации. Отбор проб осуществляли послойно, с учетом изменения в профиле ботанического состава торфа и степени его разложения. Для характеристики почвенного микробного сообщества использовали комплексный подход, включающий как классические, так и современные молекулярно-генетические методы. Содержание и биомассу микроорганизмов (бактерий, спор и мицелия грибов) определяли методом люминесцентной микроскопии [10], потенциальную жизнеспособность бактерий - с использованием флуоресцентного двухкомпонентного красителя L 7012 [2]. Дополнительно численность микроскопических грибов оценивали методом посева почвенных вытяжек на твердые питательные среды (Чапека, Гетчин-сона, Сабуро, сусло-агар) при разных температурах культивирования (4°С, 25°С, 35°С). Молекулярно-ге-нетические исследования (выделение ДНК из почвы, количественный анализ генов 16S pPHK бактерий и архей методом ПЦР в реальном времени и анализ таксономического состава микро-биома при помощи пиросеквенирования гена 16S pPHK) проводили с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ВНИ-ИСХМ и ЦКП «Функции и свойства почв и почвенного покрова» Почвенного института им. В.В. Докучаева в соответствии с методикой, описанной ранее [11]. При обработке полученных данных выполняли проверку качества секвенирования, создание библиотеки сиквенсов, объединение сиквенсов в операционные таксономические единицы (ОТЕ) на основе 97%-ного сходства, удаление синглтонов и генов хлоропластов. Определение таксономического состава прокариот осуществляли по базе данных RDP (Ribosomal Database Project). При обработке данных секвенирования использовали программу QIIME (http://qiime.org) [12].
Количественный химический анализ почв выполняли в ЦКП "Хроматография" экоаналитической лаборатории и лаборатории отдела почвоведения Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Определение физико-химических показателей проводили по общепринятым в почвоведении методам [13]. Массовую долю органического углерода (Собщ.) и общего азота (№бщ.) в образцах торфа измеряли на CNHS-элементном анализаторе ЕА 1110 (Carlo Erba, Италия). Полученные данные обрабатывали стандартными методами статистического анализа с использованием программ Microsoft Excel и Sta-tistika 6.0.
Результаты и обсуждение
Торфяная залежь в пределах рассматриваемого торфяного бугра характеризуется четко выраженной неоднородностью, отражающей различия в экологических условиях ее формирования. Верхний слой СТС (глубина 0-20 см) характеризует современный этап торфообразования и торфонакопле-ния, связанный с развитием мезотрофных дикрано-вых мхов и хорошо минерализующихся после отмирания лишайников. Он отличается темно-корич-
невой окраской, сравнительно высокой степенью разложения, рыхлостью, насыщенностью корнями кустарничков. Ниже (20-47 см) залегает слой сфагнового торфа, свидетельствующий о формировании данной части профиля в условиях бедного питания преимущественно атмосферными водами. Эта часть торфяной залежи характеризуется слабой степенью разложения, остатки сфагновых мхов имеют желтовато-бурый цвет, однако на глубине 20-30 см в них присутствуют включения хорошо разложенного торфа темно-бурого цвета за счет криотурбаций, а в надмерзлотной части СТС (4755 см) торф приобретает более темную окраску. Она может быть обусловлена, с одной стороны, повышением уровня влажности торфа на контакте с водо-упором, которым служит верхняя граница мерзлых пород (рис. 2б), с другой - изменением ботанического состава торфа. Мерзлые слои (55-115 см) - льдистые, темно-бурого цвета с включением желтовато-бурых остатков сфагновых мхов (практически аналогичные по составу торфу с глубины 47-55 см), к низу степень разложения торфа возрастает.
По физико-химическим свойствам торфяные отложения в профиле рассматриваемой почвы отвечают торфам верхового типа. Согласно Н.И. Пьявченко [14], для верховых торфов характерна сильнокислая реакция среды, величина рН солевой вытяжки находится в интервале 2,6-3,4(3,5). Как видно из данных, приведенных в табл. 1, все исследованные нами слои торфа имеют реакцию среды, соответствующую указанным выше параметрам. Максимальной кислотностью - как обменной (величина рНКС|), так и гидролитической (Нг) -отличаются слои сфагнового торфа (глубина 20-47 см). Полученные для них показатели аналогичны свойствам торфяных почв верховых болот таежной зоны [6] и коррелируют с низким содержанием в них обменных оснований (табл. 1). Некоторое возрастание содержания обменных катионов кальция и магния в верхних слоях СТС (0-4 см) и в мерзлой толще (55-115 см), наряду с увеличением в них зольности, позволяет говорить об олиготрофно-мезотрофном характере торфа в этих горизонтах профиля, обусловленном несколько иным ботаническим составом торфяных отложений.
Сравнительно невысокое содержание органического углерода в верхней части СТС (28,8%), по сравнению с нижележащей толщей (42,348,3%), может быть обусловлено эффектом «озем-ления» [15]. В данном случае он, по всей видимости, связан с аэротехногенным поступлением минеральных компонентов на поверхность почв в результате строительства и эксплуатации расположенных вблизи рассматриваемого болотного массива автомобильных дорог с грунтовым покрытием (рис. 1б).
Как показали проведенные микробиологические исследования, суммарная биомасса бактерий, спор и мицелия грибов в пределах СТС и ММП торфяного бугра бугристо-мочажинного комплекса, представленного в долине нижнего течения р. Печора, варьирует от 1,7 до 15,3 мг/г торфа (рис. 3). Эти показатели близки к параметрам микробной биомассы (1,0-17,3 мг/г) в торфяных отложениях
Некоторые физико-химические показатели сезонно-талых и мерзлых слоев почвы
торфяного бугра
Some physical-chemical indicators of peat in the active and permafrost layers of permafrost peatland soil
Таблица 1
Table 1
Горизонт Глубина, см рн Hr* Обменные основания V** Зольность Собщ. Nобщ C/N
Ca2+ | Mg2+
H2O KCl смоль/кг %
Т1 0-4 4,08 3,21 53,8 4,29 3,75 13,0 26,65 28,8 0,88 33
Т2 4-10 4,02 3,12 60,2 2,47 2,11 7,1 14,54 42,3 1,63 26
-"- 10-20 3,8 3,09 64,4 1,99 1,58 5,3 11,21 43,8 1,62 27
Т3 20-30 4,05 3,06 72,1 2,36 1,52 5,1 6,04 48,2 1,90 25
Т4 30-47 3,72 2,95 70,5 3,16 2,45 7,4 4,43 44,1 1,10 40
Т5 47-55 3,85 3,06 68,0 2,41 1,51 5,4 8,40 43,7 1,28 34
Т6± 55-70 4,29 3,3 61,6 3,65 2,49 9,1 8,89 43,7 1,32 33
-"-± 70-95 4,43 3,33 57,5 3,58 2,26 9,2 7,14 44,2 1,40 32
90-115 4,45 3,38 65,5 5,66 3,45 12,2 7,24 42,0 1,04 40
Примечание. Hr* - гидролитическая кислотность; V** - степень насыщенности основаниями. Note: Hr* - hydrolytic acidity; V** - the degree of saturation with bases.
18000 16000
В 14000
s
g 12000
о =5
10000 8000 6000 4000 2000 0
о я
ю §
я
ю о
SP
и
0-4
4-10 10-20 20-30 30-47 47-55 55-70
-2 -
70-90 90-115
Глубина, см
Рис. 3. Профильное изменение величины суммарной микробной биомассы (1) и доли в ней биомассы мицелия (2) и спор (3) грибов в почве торфяного бугра плоскобугристого болота лесотундры.
Fig. 3. The profile change in the value of the total microbial biomass (1) and the proportion of mycelium biomass (2) and spores (3) of microscopic fungi in the peat soil of the forest-tundra flat permafrost peatland.
3
сфагновых болот лесной зоны [16]. Исключением является верхняя часть торфяной залежи сфагнового болота южной тайги (глубина 0-20 см), где суммарная микробная биомасса характеризовалась, по данным А.В. Головченко с соавторами [16], величиной порядка 35,9+10,2 мг/г. Для сравнения, в исследованном нами торфянике показатели суммарной микробной биомассы на глубине 0-20 см варьировали в пределах 1,66-7,77 мг/г (рис. 3), что в 5-22 раза ниже по сравнению с аналогичными слоями торфа верхового болота. Ко второй отличительной черте мерзлотного торфяника лесотундры следует отнести приуроченность максимальной концентрации суммарной микробной биомассы к срединной части профиля (10-20 см), что коррелирует с наибольшим содержанием здесь клеток бактерий, а также спор и мицелия грибов (табл. 2).
Основной вклад в суммарную биомассу микроорганизмов во всех рассмотренных слоях торфяной залежи мерзлотного бугристо-мочажинного комплекса лесотундры вносят микроскопические грибы (табл. 2). На долю спор и мицелия в структуре микробных комплексов различных слоев торфа приходится до 97,399,8% суммарной биомассы микроорганизмов. Близкая картина в соотношении компонентов структуры микробной биомассы отмечена исследователями при изучении торфяных почв верховых болот. Для почв низинных (эвтрофных) болот характерна обратная картина - превалирование бактериальной биомассы над грибной [6, 16].
Распределение микроскопических грибов в профиле почвы торфяного бугра коррелирует с профильным распределением содержания азота общего (коэффициент корреляции г = 0,74), углерода
Таблица 2
Численность и биомасса микроорганизмов в почве торфяного бугра по данным люминесцентной микроскопии (X ± о )*
Table 2
Number and biomass of microorganisms in the peat soil according to luminescence microscopy (X ±о )*
Горизонт Глубина, см Численность Длина мицелия грибов, м/г Биомасса
Бактерии Споры грибов Бактерии Мицелий грибов (беспряжковый) Споры грибов
млрд.кл./г млн.кл./г мкг/г
Т1 0-4 1,57±0,43 65±18 96±136 31,5±8,5 429±607 1858±1215
Т2 4-10 2,25±0,43 84±8 134±27 45,1±4,0 252±51 1360±574
Т2 10-20 5,02±1,16 248±52 1487±798 100,4±23,1 4112±2539 3556±1170
Т3 20-30 1,72±0,84 510±40 1044±227 34,3±16,9 5127±705 10135±1045
Т4 30-47 1,95±1,08 61 ±7 377±533 39,0±21,6 1412±1997 827±428
Т5 47-55 1,25±0,01 149±21 312±74 25,0±0,5 1040±549 2508±525
Т6± 55-70 3,46±0,49 279±106 384±224 69,1±16,3 834±377 3691±734
Т6± 70-90 4,60±0,16 380±34 128±11 92,0±1,1 383±542 4114±800
Т6± 90-115 2,98±0,84 288±43 0 59,7±16,8 0 2323±91
Примечание. * Здесь и далее X - среднее значение; ± о - среднее квадратичное отклонение. Note: * here and further X - mean value; ± о - standard deviation
органических соединений (г = 0,51), суммы обменных оснований (г = -0,50) и величины гидролитической кислотности (г = 0,49). Соотношение биомассы мицелия грибов и их спор в почве торфяного бугра характеризуется преобладанием последних в верхней части СТС (80-82%) и мерзлой толще (8097%). В срединной части профиля, где торфяная залежь представлена сфагновыми мхами с максимальной величиной кислотности, длина грибного мицелия возрастает на один-два порядка по сравнению с верхними слоями торфа (табл. 2). Здесь отмечается некоторое выравнивание между величиной биомассы спор (36-66%) и биомассы грибного мицелия (34-62%) (рис. 3). В мерзлой толще торфа величина биомассы мицелия резко снижается с глубиной. На глубине 95-115 см присутствуют только споры грибов, сохраняющие свою жизнеспособность и поддерживающие запасы «живого» углерода в болотных экосистемах [6].
Присутствие жизнеспособных пропагул микроскопических грибов в мерзлой толще торфяной залежи подтверждается данными учета колоний микромицетов, изолированных из образцов торфа на твердые питательные среды (метод посева). В
толще торфа, оттаивающей в теплый период года, численность микромицетов, в зависимости от используемой среды, варьирует в широких пределах -от единиц до сотен тысяч колонии образующих единиц (КОЕ) на грамм субстрата (табл. 3). Близкий порядок величин для разных сред получен только при исследовании самого верхнего горизонта (Т1) почвы торфяного бугра. В нижележащих горизонтах сохраняется высокая численность учитываемых колоний только при использовании богатых углеводами питательных сред (сусло-агар, среда Сабуро). В мерзлой толще торфа (горизонт Т6±) численность изолятов на один-два порядка ниже, но они стабильно выделялись в образцах торфа из всех слоев мерзлой толщи, особенно на сусло-агаре и среде Гетчинсона (табл. 3).
Считается, что в глубоких слоях торфа верховых болот рост колоний на питательных средах связан с присутствием микромицетов, находящихся в виде спор [16]. Гифы грибов выступают в роли колонии образующих единиц только в верхней части торфяной залежи. Однако в случае исследованного нами торфяника коэффициенты корреляции между числом колоний микромицетов, выросших на
Таблица 3
Численность микроскопических грибов в почве торфяного бугра по данным метода посева
на твердые питательные среды (X ± о )
Table 3
The number of microscopic fungi in the peat soil according to the method of inoculation on solid medium ( X ± о )
Горизонт Глубина, см Численность микромицетов, тыс. КОЕ/г
Среда Чапека Сусло-агар Среда Сабуро Среда Гетчинсона
Т1 0-4 84,2±17,0 76,3±20,9 51,3±27,2 1,3±3,3
Т2 4-10 6,7±5,4 53,8±27,2 39,2±22,4 0,7±1,6
Т2 10-20 6,2±8,1 13,5±11,9 23,8±8,0 0,7±1,6
Т3 20-30 1,2±1,5 104,5±5,7 79,5±23,9 0
Т4 30-47 5,7±8,2 78,7±11,0 60,2±13,3 0
Т5 47-55 38,7±42,8 70,0±16,3 60,7±35,2 0
Т6± 55-70 0 0,2±0,4 0,2±0,4 2,8±4,1
Т6± 70-90 0,3±0,5 3,7±7,6 1,8±4,0 1,7±4,1
Т6± 90-115 0 1,8±3,5 0 0,7±1,6
богатых углеводами средах, и биомассой спор были ниже (0,25-0,27), нежели между численностью мик-ромицетов и биомассой мицелия (0,37-0,47). Возможно, оценка доли «живого» мицелия и «живых» спор при окрашивании препаратов для люминесцентной микроскопии флюоресцеин диацетатом [5] позволила бы провести более корректное сопоставление результатов прямого микроскопирования и учета численности грибов чашечным методом.
Численность бактерий в плоскобугристом торфянике и соответственно их биомасса на один-два порядка ниже по сравнению с торфяными почвами талых верховых болот [17]. В профиле мерзлотной торфяной почвы она варьирует в пределах от 1,25 до 5,02 млрд. кл./г почвы (табл. 2). Распределение прокариот в пределах торфяной толщи неравномерно: четко выделяются две зоны аккумуляции бактериальных клеток и, соответственно, их биомассы. Первая зона (5,02 млрд. кл./г почвы) приурочена к глубине 10-20 см от поверхности почвы, вторая (3,46-4,60 млрд. кл./г почвы) - к глубине 55-90 см. Минимальное количество клеток бактерий (1,57 млрд. кл./г почвы) отмечено в поверхностных слоях торфа (глубина 0-4 см), которые характеризовались на момент отбора проб минимальной влажностью, и в слоях торфа на глубине 20-55 см, представленных остатками сфагнов (1,25-1,95 млрд. кл./г почвы). Низкое содержание бактерий в этой части профиля может быть связано с ингибирующим действием фенольных соединений, накапливающихся в значительном количестве в сфагновом торфе и обладающих бактерицидным действием [6].
В верхней части СТС (0-30 см) основной вклад в структуру биомассы прокариот вносят бактериальные клетки с неповрежденной мембраной (живые клетки). На их долю приходится до 58-84% от общего числа клеток (рис. 4). Полученные нами данные сопоставимы с результатами оценки соотношения живых и мертвых клеток бактерий в верхних слоях торфа (до глубины 0-30 см) в верховых болотах таежной зоны, согласно которым в них на долю бактерий с неповрежденной мембраной приходится до 60-68% от общего числа клеток [6]. В надмерзлотных горизонтах (30-55 см) и в верхних слоях ММП (55-90 см) мерзлотной торфяной почвы преобладают бактериальные клетки с поврежденной клеточной мембраной (мертвые клетки бактерий). Они составляют больше половины общего числа клеток прокариот (56-66%). Профильное распределение численности живых клеток бактерий (рис. 4) коррелирует с их суммарной численностью (табл. 2) и характеризуется минимальными значениями в слоях сфагнового торфа (30-55 см). Наличие достаточно высокого количества живых клеток бактерий в мерзлой толще, сопоставимого по величине с верхними слоями СТС, подтверждает ранее полученные данные о том, что низкие температуры, складывающиеся в нижних слоях торфяных отложений болотных экосистем, не препятствуют сохранению жизнеспособных компонентов микробных комплексов [6, 16].
Результаты молекулярно-генетических исследований свидетельствуют о том, что численность
Численность бактерий, млрд кл./г
Рис. 4. Распределение числа клеток бактерий с неповрежденной (1) и поврежденной (2) мембраной в профиле торфяной мерзлотной почвы плоскобугристого болотного комплекса лесотундры. Fig. 4. Distribution of the bacterial cells with an intact (1) and damaged (2) membrane in the profile of peat permafrost soil of the forest-tundra flat permafrost peatland.
бактерий в торфяных отложениях рассматриваемого плоскобугристого болота на два-три порядка превышает численность архей. Количество 16S рРНК генов в грамме сухого торфа в различных горизонтах СТС составило порядка 109 для бактерий и 105-107 для архей (рис. 5). В мерзлых слоях торфа (55-115 см) содержание генов прокариот заметно ниже. Оно составляет порядка 106 для бактерий и 104 для архей и практически не меняется в пределах исследованной мерзлой толщи профиля. Полученные в результате метагеномного анализа данные не противоречат результатам оценки численности бактерий люминесцентным методом в СТС, и на порядок меньше для мерзлых слоев торфа. Скорее всего, столь низкие значения содержания прокариотных генов в ММП, по данным количественной ПЦР, связаны с низкой экстрагируе-мостью ДНК из мерзлого торфа. По некоторым данным, выбор методики и набора реактивов может сильно влиять на степень экстракции ДНК из мерзлых образцов [18], что может привести к недооценке содержания микробных генов.
Прокариотный комплекс СТС представлен преимущественно филумами бактерий Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Planctomycetes, Proteo-bacteria и Verrucomicrobia (рис. 6). Здесь доминируют Acidobacteria, к которым относятся 30-84% всех проанализированных последовательностей гена 16S рРНК. Преобладание филума Acidobacteria в бактериальных комплексах олиготрофных торфов отмечается и другими исследователями [1, 19, 20].
В мерзлых слоях торфа структура микробио-ма значительно отличается от таковой в СТС. Доля Acidobacteria на глубине 55-115 см не превышает 10% от всего прокариотного комплекса, выявленного в этой части профиля исследованного торфяного бугра. Кроме того, здесь велика численность бактерий филума Firmicutes (21-42%), обнаруживаются археи группы Thaumarchaeota. Не исключено, что большая часть микробного комплекса
Рис. 5. Количество рибосомальных генов бактерий (Bac) и архей (Arc) в грамме сухого торфа различных горизонтов почвы торфяного бугра по данным количественной ПЦР (real-time PCR).
Fig. 5. The number of bacteria (Bac) and archaea (Arc) ribosomal genes per gram of dry peat in different horizons of permafrost peat soil according to quantitative PCR (real-time PCR).
Рис. 6. Изменение структуры прокариотных сообществ в профиле торфяной мерзлотной почвы плоскобугристого торфяника лесотундры. Показаны филумы прокариот представленностью выше 1%. Fig. 6. Changing the structure of prokaryotic communities in profile of permafrost peat soil of the forest-tundra flat permafrost peatland. Phyla of prokaryotes with representativity higher than 1% are shown.
мерзлого торфа в бугристых торфяниках лесотундры состоит из микроорганизмов, способных образовывать устойчивые к низким температурам покоящиеся формы. Этот вывод подтверждает высокая представленность в мерзлых слоях торфа споро-образующих бактерий филума Firmicutes.
.Заключение
Таким образом, в результате проведенных комплексных исследований дана детальная характеристика сообществ почвенных микроорганизмов, функционирующих в сезонно-талых и мерзлых слоях торфяных отложений бугристых экосистем лесотундры. На примере плоскобугристого болотного комплекса, занимающего в долине р. Печора пло-
ские поверхности надпойменной террасы, отмечен неоднородный характер распределения микробной биомассы в границах СТС - ММП, обусловленный как различиями в составе торфа, так и спецификой их физико-химических свойств в различных горизонтах почвенного профиля. Оценены особенности филогенетической структуры прокариотного комплекса, населяющего верхнюю, ежегодно оттаивающую толщу торфяной почвы плоскобугристого болота (в пределах торфяного бугра), и его мерзлой толщи. Показано, что отрицательные температуры верхней части ММП (55-115 см) оказывают существенное влияние на микробные комплексы, обусловливая снижение численности микроскопических грибов, учитываемых на плотных питатель-
ных средах, снижение числа бактерий и архей, определяемых молекулярно-генетическими методами, изменение таксономической структуры прокариот за счет возрастания доли микроорганизмов, способных образовывать устойчивые к низким температурам покоящиеся формы (бактерии филума Firmicutes). В то же время присутствие в мерзлой толще торфяной почвы бактериальных клеток с неповрежденной мембраной, на долю которых приходится до 34-44% общего числа бактерий, учитываемых методом прямого микроскопирования, а также жизнеспособных спор и фрагментов грибного мицелия, обусловливает возможность их активного включения в процессы минерализации почвенного органического вещества (торфа) при изменении экологических условий, связанных как с природными, так и с антропогенными факторами в субарктическом регионе (потепление климата, снижение уровня мерзлоты, изменение температурного и водного режимов торфяных почв болотных экосистем).
Работа выполнена в рамках темы государственного задания Института биологии Коми НЦ УрО РАН «Пространственно-временные закономерности формирования торфяных почв на европейском Северо-Востоке России и их трансформации в условиях меняющегося климата и антропогенного воздействия» (Гр. 115020910065) при частичной финансовой поддержке проекта Комплексной программы УрО РАН №15-15-4-46 ««Взаимосвязь биоразнообразия и биопродукционного потенциала наземных экосистем Европейской Арктики с особенностями формирования мерзлотных почв и динамическими аспектами их трансформации в современных условиях климата» и проекта ПРООН/ГЭФ 00059042.
Литература
1. Оценка бактериального разнообразия почв: эволюция подходов и методов / Т.Г.Добровольская, А.В.Головченко, ТА.Панкратов, Л.ВЛысак, Д.Г.Звягинцев // Почвоведение. 2009. №10. С.1222-1232.
2. Определение физиологического состояния бактерий в почве с помощью люминесцентного красителя L 7012 / Л.В.Лысак, Е.В.Ла-пыгина, И.А.Конова, Д.Г.Звягинцев // Изв. РАН. Сер. биол. 2009. Т.36. №6. С. 750-754.
3. Распределение микроорганизмов в мерзлых грунтах/В.П.Мельников, В.В.Рогов, А.Н.Курчатова, А.В.Брушков, Г.И.Грива // Крио-сфера Земли. 2011. T.XV. №4. С. 86-90.
4. Кондратьева Л.М., Фишер Н.К. Микробиологические исследования льдов рек Амур и Сунгари // Криосфера Земли. 2012. Т. XVI. №1. С.82-93.
5. Осадчая Г.Г., Тумель Н.В. Локальные ландшафты как индикаторы геокриологической зональности (на примере Европейского Северо-Востока) // Криосфера Земли. 2012. Т. XVI. № 3. С. 62-71.
6. Функционирование микробных комплексов в верховых торфяниках - анализ причин мед-
ленной деструкции торфа. М.: Товарищество научных изданий КМК, 2013. 128 с.
7. Кизилова А.К., Сирин АА., Кравченко И.К. Микроорганизмы цикла метана в естественных торфяных почвах и гидрологических элементах осушенных торфяников // Известия Самарского научного центра РАН. 2011. Т.13. №1(5). С. 1204-1207.
8. Алексеева Р.Н. Особенности современных болот бассейна р.Уса//Лесоведение. 2010. №3. С. 53-58.
9. Государственная почвенная карта СССР. Масштаб 1:1000000. Лист Q-39 (Нарьян-Мар) / Под ред. Е.Н. Ивановой, Е.Н. Рудневой, И.В. Забоевой / АН СССР. М.: Почвенный ин-т им. В.В. Докучаева. 1977.
10. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: МГУ, 1991. 304 с.
11. Профильный анализ микробиомов сопряжен-
ных почв солонцового комплекса Прикаспийской низменности/ Т.И.Чернов, М.П.Лебедева, А.К.Тхакахова, О.В.Кутовая // Почвоведение. 2017. № 1. С. 71-76.
12. Caporaso J.G.,KuczynskiJ., Stombaugh J. et al. QIIME allows analysis of high throughput community sequencing data // Nature methods. 2010. Vol. 7(5). P. 335-336.
13. Теория и практика химического анализа почв / Под ред. Л.А. Воробьевой. М.: ГЕОС, 2006. 400 с.
14. Пьявченко Н.И. Торфяные болота, их природное и хозяйственное значение. М.: Наука, 1985. 152 с.
15. Классификация почв России / Л.Л.Шишов, В.Д.Тонконогов, И.И.Лебедева, М.И.Герасимова. М.: Почв. ин-т им. В. В. Докучаева, 2004.
16. Головченко А.В., Тихонова Е.Ю., Звягинцев Д.Г. Численность, биомасса, структура и активность микробных комплексов низинных и верховых торфяников Западной Сибири // Микробиология. 2007. Т.76. №5. С.711-719.
17. Бактериальные комплексы верхового торфя-
ника в условиях различного микрорельефа/ Т.Г.Добровольская, А.В.Головченко, А.В.Якушев, Е.Н.Юрченко, Н.А.Манучарова, И.Ю.Чернов // Почвоведение. 2017. №4. С.483-489.
18. Vishnivetskaya TA., Layton AC, Lau M.C.Y. et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples//FEMS Microbiol. Ecol. Oxford University Press. 2014. 87(1). P. 217-230.
19. Serkebaeva Y. M., Kim Y, Liesack W., Dedysh S. N. Pyrosequencing-Based Assessment of the Bacteria Diversity in Surface and Subsurface Peat Layers of a Northern Wetland, with Focus on Poorly Studied Phyla and Candidate Divisions // PLoS ONE. 2013. Vol. 8. I. 5.
20. Lin X., Green S, Tfaily MM. et al. Microbial community structure and activity linked to contrasting biogeochemical gradients in bog and fen environments of the Glacial Lake Agassiz Peatland // Applied and environmental microbiology. 2012. Vol.78(19). P.7023-7031.
References
1. Ocenka bakterial'nogo raznoobraziya pochv: ehvolyuciya podhodov i metodov [Evaluation of the bacterial diversity of soils: evolution of approaches and methods] / T.G. Dobrovolskaya, A.V.Golovchenko, TA.Pankratov, L.V.Lysak, D.G.Zvyagintsev // Pochvovedenie [Soil science]. 2009. №10. P.1222-1232.
2. Opredelenie fiziologicheskogo sostoyaniya bak-terij v pochve s pomoshch'yu lyuminescent-nogo krasitelya L 7012 [Determination of the physiological state of bacteria in soil by using a fluorescent dye L 7012] / L.V.Lysak, E.V.La-pygina, IA.Konova, D.G.Zvyagintsev // RAS Proc. Series Biology. 2009. Vol. 36. № 6. P. 750-754.
3. Raspredelenie mikroorganizmov v merzlyh gru-ntah [The distribution of microorganisms in frozen ground] / V.P.Mel'nikov, V.V.Rogov, A.N.Kurchatova, A.V.Brushkov, G.I.Griva // Kriosfera Zemli [Cryosphere of the Earth]. 2011. Vol. XV. №4. P. 86-90.
4. Kondratyeva L.M., Fisher N.K. Mikrobiologi-cheskie issledovaniya l'dov rek Amur m Sun-gari [Microbiological studies of the ice of the rivers Amur and Sungari] // Kriosfera Zemli [Cryosphere of the Earth]. 2012. Vol.XVI. №1. P.82-93.
5. Osadchaya G.G., Tumel N.V. Lokal'nye land-shafty kak indikatory geokriologicheskoj zon-al'nosti (na primere Evropejskogo Severo-Vostoka) [Local landscapes as indicators of geocryological zoning (on the example of the European North-East)// Kriosfera Zemli [Cryosphere of the Earth]. 2012. Vol. XVI. № 3. P. 62-71.
6. Funkcionirovanie mikrobnyh kompleksov v ver-hovyh torfyanikah - analiz prichin medlennoj destrukcii torfa [The functioning of microbial complexes in upland peatlands - analysis of the reasons for the slow decomposition of peat. Moscow: Tovarishchestvo nauchnyh iz-danij KMK [Partnership of sci. publications KMK], 2013. 128 p.
7. Kizilova A.K., Sirin AA., Kravchenko I.K. Mi-
kroorganizmy cikla metana v estestvennyh torfyanyh pochvah i gidrologicheskih ehle-mentah osushennyh torfyanikov [Microorganisms of the methane cycle in natural peat soils and hydrolytic elements of drained peatlands] // Proc. of Samara Sci. Centre, RAS. 2011. Vol.13. №1(5). P. 1204-1207.
8. Alekseeva R.N. Osobennosti sovremennyh bolot bassejna r. Usa [The features of the modern marshes of the Usa river basin] // Lesovede-nie [Forest science]. 2010. №3. P. 53-58.
9. Gosudarstvennaya pochvennaya karta SSSR. Masshtab 1:1000000 [State soil map of the USSR. Scale 1 : 1000000]. List Q-39 (Naryan-Mar) / Eds. E.N. Ivanova, E.N. Rudneva, I.V. Zaboeva / USSR Ac. Sci. 1977.
10. Metody pochvennoj mikrobiologii i biohimii [Methods of soil microbiology and biochemistry] / Ed. D.G. Zvyagintseva. Moscow: Moscow State Univ., 1991. 304 p.
11. Profil'nyj analiz mikrobiomov sopryazhennyh pochv soloncovogo kompleksa Prikaspijskoj nizmennosti [Profile analysis of the microbi-omes of conjugate soils of the solonetz complex of the Caspian lowland] / T.I.Chernov, M.P.Lebedeva, A.K.Tkhakakhova, O.V.Kuto-vaya // Pochvovedenie [Soil science]. 2017. №1. P. 71-76.
12. Caporaso J.G., Kuczynski J., Stombaugh J. et al. QIIME allows analysis of high throughput community sequencing data // Nature methods. 2010. Vol. 7 (5). P. 335-336.
13. Teoriya i praktika himicheskogo analiza pochv [Theory and practice of chemical analysis of soils] / Ed. L.A. Vorobyeva. Moscow: GEOS,
2006. 400 p.
14. Pyavchenko N.I. Torfyanye bolota, ih prirodnoe i hozyajstvennoe znachenie [Peatlands, their natural and economic value]. Moscow: Nauka, 1985. 152 p.
15. Klassifikaciya pochv Rossii [Classification of soils of Russia] / L.L.Shishov, V.D.Tonkono-gov, I.I.Lebedeva, M.I.Gerasimova. Moscow: V.V. Dokuchaev Soil Inst., 2004.
16. Golovchenko A.V., Tikhonova E.Yu, Zvyagint-sev D.G. Chislennost', biomassa, struktura i aktivnost' mikrobnyh kompleksov nizinnyh i verhovyh torfyanikov Zapadnoj Sibiri [Abundance, biomass, structure and activity of mi-crobial complexes of lowland and upland peat-lands of Western Siberia] // Microbiology.
2007. Vol. 76. №5. P.711-719.
17. Bakterial'nye kompleksy verhovogo torfyanika v usloviyah razlichnogo mikrorel'efa [Bacterial complexes of upland peatland in different micro-relief] / T.G.Dobrovolskaya, A.V.Golovchenko, A.V.Yakushev, E.N.Yurchenko, NA.Ma-nucharova, I.Yu.Chernov. // Pochvovedenie [Soil science]. 2017. №4. P. 483-489.
18. Vishnivetskaya TA, Layton A.C., Lau M.C.Y et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples//FEMS Microbiol. Ecol. Oxford University Press. 2014. 87(1). P. 217-230.
19. Serkebaeva Y.M., Kim Y., Liesack W., Dedysh S. N. Pyrosequencing-Based Assessment of the Bacteria Diversity in Surface and Subsurface Peat Layers of a Northern Wetland, with Focus on Poorly Studied Phyla and Candidate Divisions // PLoS ONE. 2013. Vol. 8. I. 5.
20. Lin X., Green S., Tfaily M.M. et al. Microbial
community structure and activity linked to contrasting biogeochemical gradients in bog and fen environments of the Glacial Lake Agassiz Peatland, // Applied and environmental microbiology. 2012. Vol. 78(19). P. 70237031.
