Таксономическая структура микробных сообществ в почвах различных типов по данным высокопроизводительного секвенирования библиотек гена 16S-рРНК Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2013, № 3

УДК 631.417.2:579.64:579.8:577.21.06

ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ В ПОЧВАХ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ПО ДАННЫМ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ БИБЛИОТЕК ГЕНА 168-рРНК*

Е.Л. ЧИРАК1, Е.В. ПЕРШИНА1, А.С. ДОЛЬНИК2, О.В. КУТОВАЯ3,

Е.С. ВАСИЛЕНКО3, Б.М. КОГУТ3, Я.В. МЕРЗЛЯКОВА1, Е.Е. АНДРОНОВ1

Особенности почвенного микробиома могут послужить универсальным и очень чувствительным индикатором состояния почвы, в том числе при оптимизации и биологизации систем земледелия. Однако для применения такого подхода необходимо предварительно изучить состав микробиомов, приуроченных к различным типам почв. Ранее подобные таксономические исследования представляли собой трудновыполнимую задачу и требовали больших материальных и временных затрат. С внедрением в молекулярную экологию методов секвенирования нового поколения стало возможным увеличить число не только выявляемых видов микроорганизмов, но и исследуемых местообитаний. Мы выполнили первичный анализ микробных сообществ с использованием пиросеквенирования почвенного метагенома. Для проведения исследования была создана коллекция почв, отобранных в различных регионах России (20 образов), а также в Крыму (Украина, 1 образец). В микробном сообществе доминировали бактерии из фил Proteobacteria (до 59,3 %), Actinobacteria (до 55,4 %), Acidobacteria (до 26,5 %), Verrucomicrobia (до 13,6 %), Bacteroidetes (до 10,5 %), Firmicutes (до 8,2 %), Gemmatimonadetes (до 6,9 %), Chloroflexi (до 5,7 %) и археи из филы Crenarchaeota. Сравнение таксономической структуры микробных сообществ указывает на то, что физико-химические факторы, такие как кислотность/щелочность и увлажненность территории, влияют на биоразнообразие прокариот в большей степени, чем другие (например, тип почвы или место отбора проб). Так, в почвах южных регионов, характеризующихся более низким гидротермическим коэффициентом (ГТК), отмечено преобладание актинобактерий, в то время как в северных почвах с высоким ГТК превалировали протеобактерии. Для почв с низким рН характерно увеличение доли ацидобактерий.

Ключевые слова: почва, ампликонные библиотеки, 168-рРНК, микробиом, таксономия.

Keywords: soil, amplicon library, 168 rRNA, microbiome, taxonomy.

До самых недавних пор определение таксономического состава микробного сообщества представляло собой трудноразрешимую задачу, требующую больших материальных и временных затрат. Трудоемкость процедур клонирования и последующего секвенирования нуклеотидных последовательностей ограничивала число не только выявляемых видов микроорганизмов, но и исследуемых местообитаний (1). Ситуация существенно изменилась с внедрением в молекулярную экологию методов нового поколения, в частности технологии пиросеквенирования (2, 3). Применение этих подходов повысило производительность секвенирования с сотен (метод Сэнджера) до нескольких тысяч нуклеотидных последовательностей, что способствовало максимально точному описанию даже таких сложных многокомпонентных систем, как почвенное микробное сообщество. В настоящее время реализуется несколько международных проектов, направленных на характеристику глобального микробного сообщества Земли. Один из них — Earth Microbiome Project (http://www.earthmicrobio-me.org/), в рамках которого уже собрана информация о таксономической структуре микробиомов различных экологических ниш, полученная с использованием сек-венаторов нового поколения. В рамках указанного проекта к настоящему времени проанализировано более 9000 образцов, или свыше 800 млн нук-

* Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ, ГК № 16.512.11.2132, Программы поддержки фундаментальных исследований по приоритетным направлениям Санкт-Петербургского государственного университета и РФФИ 12-04-01371-а.

леотидных последовательностей. Однако по России в упомянутой базе данных имеется лишь около десятка образцов, относящихся к вечной мерзлоте. Настоящая работа призвана восполнить существующий пробел. Поставленная задача особенно важна в связи с тем, что на территории России представлено фактически все известное почвенное разнообразие, и в этом отношении она может считаться одной из самых интересных экспериментальных площадок планеты. Кроме того, исследование почвенных микро-биомов с использованием современных приемов секвенирования весьма перспективно с практической точки зрения, так как открывает возможности для создания совершенно новых подходов к оптимизации технологий земледелия. Основой таких подходов может стать использование особенно -стей почвенного микробиома как универсального и очень чувствительного индикатора состояния почвы.

Реализация подобных проектов должна начинаться с обзорного исследования почвенных микробиомов, приуроченных к различным типам почв. Именно эта цель была поставлена в нашем исследовании.

Методика. Для проведения экспериментов создали коллекцию проб, представляющих наиболее распространенные почвенные типы (всего 20 образцов). Пробы почвы отбирали в разных регионах России и в Украине в сентябре 2011 года, после чего образцы транспортировали в лабораторию, где хранили при -70 °С.

ДНК выделяли из 0,5 г замороженной почвы после механического разрушения с использованием стеклянных шариков в экстрагирующем буфере, состоящем из следующих компонентов: 350 мкл раствора А (натрий-фосфатный буфер — 200 мМ; изотиоцианат гуанидина — 240 мМ; pH 7,0), 350 мкл раствора Б (Трис-HCl — 500 мМ; SDS — 1 % по массе к объему; pH 7,0) и 400 мкл смеси фенола с хлороформом (1:1). Разрушение образца проводили в течение 1 мин при максимальной мощности на приборе FastPrep 24 («MP Medicals», США). Полученный препарат центрифугировали при максимальной скорости в течение 5 мин. Водную фазу отбирали и повторно экстрагировали хлороформом. ДНК осаждали, добавляя равный объем изопропилового спирта. После центрифугирования осадок промывали 70 % этанолом и растворяли в воде при 65 °С в течении 5-10 мин. Очистку ДНК проводили с помощью электрофореза в 1 % агарозном геле с последующим выделением ДНК из геля методом сорбции на оксиде кремния (4, 5).

При конструировании и секвенировании ампликонных библиотек очищенный препарат ДНК (по 10-15 нг) использовался в качестве матрицы в реакции ПЦР (температурный профиль: 95 °С — 30 с, 50 °С — 30 с, 72 °С — 30 с; всего 30 циклов) с добавлением полимеразы Encyclo («Евроген», Россия) и универсальных праймеров к вариабельному участку V4 гена ^S-рРНК — F515 (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA) и R806 (GGACT-ACVSGGGTATCTAAT) (6). Кроме того, в праймеры вводили олигонуклео-тидные идентификаторы для каждой пробы (20 идентификаторов) и служебные последовательности, необходимые для пиросеквенирования по протоколу фирмы «Roche» (Швейцария). Подготовку проб и секвенирова-ние выполняли на приборе GS Junior («Roche», Швейцария) согласно рекомендациям производителя.

Таксономический анализ нуклеотидных последовательностей ам-пликонных библиотек осуществляли с помощью программы QIIME (7). В процессе анализа выполнялись следующие действия: разделение библиотек по идентификаторам, проверка качества секвенирования и фильтрация

нуклеотидных последовательностей, объединение последовательностей в операционные таксономические единицы (ОТЕ) с использованием 97 % порога сходства, выравнивание нуклеотидных последовательностей методом Uclust, построение матрицы генетических дистанций и филогенетического древа по методу Fasttree. Таксономическую идентификацию ОТЕ проводили с использованием банка данных RDP (http://rdp.cme.msu.edu/). На основе результатов анализа представленности ОТЕ в пробах рассчитывали индексы биоразнообразия Шеннона и ChaoI: H = -Ept lnp (pi — доля i-го вида в сообществе), Sest(ChaoI) = Sobs + a2/2b (Sest — оцениваемое число ОТЕ, SobS — наблюдаемое число ОТЕ, a — число ОТЕ, выявленных один раз, b — число ОТЕ, выявленных ровно два раза). Кроме того, выполняли тест Rarefaction, характеризующий динамику накопления ОТЕ в зависимости от числа секвенированных последовательностей, а также кластерный анализ образцов с применением метода UPGMA и определением значимости кластеров по алгоритму Bootstrap.

Результаты. Образцы почвы имели разное происхождение (табл. 1).

1. Коллекционное описание почвенных образцов, отобранных в разных географических точках (Россия, Украина; время отбора — сентябрь 2011 года)

Организация Место отбора № пробы Обозна- чение Почвенный таксон Биогеоценоз Координаты GPS

Прикаспийский Астраханская 19 BURSOL19 Бурая солонцева-Целина N 47°88'7.49"

НИИАЗ, г. Астрахань обл. тая E 46°12'2.94"

Прикаспийский Астраханская 37 SOLONC37 Солонец мелкий Целина N 47°88'5.07"

НИИАЗ, г. Астрахань обл. солончаковый E 46°12'6.01"

Воронежский НИИСХ Воронежская 59 CHERNZ59 Чернозем типич- Залежь косимая N 51°09'16.24'

обл. ный E 40°47'09.08"

Воронежский НИИСХ Воронежская 86 CHERNZ86 Лутово- Залежь с 1892 тодаN 51°09'16.24"

обл. черноземная E 40°47'09.08"

Центральный музей Ленинград- 108 PODZOLIO8 Подзол Залежь N 60°32'33.45'

почвоведения ская обл. E 33°9'6.75"

им. В.В. Докучаева,

г. Санкт-Петербург

ВНИИМЗ, г. Тверь, Тверская обл. 124 PODZOL124 Дерново- Луг у леса N 56°46'25.38'

агроландшафтный подзолистая E 36°04'50.61"

стационар «Губино»

Ставропольский НИИСХ,Ставрополь- 187 CHERNZ187 Чернозем обык- Целина N 56°25'24.40"

г. Михайловск ский край новенный E 59°06'40.25"

Татарский НИИСХ, Республика 195 SERLES195 Серая лесная Залежь N 55°40' 15"

г. Казань Татарстан E 52°08'28"

Богдинская НИАГЛОС, Астраханская 202 POJMEN202 Пойменная аллю- Целина N 47°24'20.38"

Харабалинский р-н обл. виально-слоистая E 47°14'50.47"

Новосильская опытная Орловская 235 SERLES235 Серая лесная Луг N 53°17'

станция, г. Мценск обл. E 33°33'

ВНИИОУиУТ, Судо- Владимир- 253 PODZOL253 Дерново-сильно- Смешанный лес N 56°03'7''

годский р-н ская обл. подзолистая E 40°29'52"

ВНИИЗиЗПЭ, Курская обл. 279 CHERNZ279 Чернозем типич- Центрально-Черно- N 51°34'27.8"

г. Курск ный земный заповедик E 36°05'67.2"

им. В.В. Алехина

Клетский опытно- Волгоград- 294 KASHTM294 Темно- Целина N 49°13'29"

овражный опорный ская обл. каштановая E 42°56'32"

пункт ВНИАЛМИ

ВНИАЛМИ, Волгоград- 312 KASHSV312 Светло- Залежь N 48о38'49"

г. Волгоград ская обл. каштановая E 44о22'57"

Калмыцкая научно-ис- Республика 326 KASHSV326 Светло- Целина N 46°17'09"

следовательская лесная Калмыкия каштановая со- E 44°15'11"

опытная станция лонцеватая

ФГУП Котласское Архангель- 345 SUGLSV345 Дерновая сутли- Залежь N 61°8'50"

ская обл. нистая E 46°32'55"

ФГУП Холмогорское Архангель- 357 ALLDER357 Аллювиальная Пойма, сенокос N 63°45'17"

ская обл. дерновая Е 41°56' 19"

ФГУП Архангельское Архангель- 384 ALLDER384 Аллювиальная Центральная пой- N 64°30'13.0"

ская обл. дерновая ма, залежь, сенокос E 40°26'45.1"

КИАПП, Крым, Крым 399 KRASZM399 Чернозем южный Целина N 45°32'21.74"

пос. Клепинино E 34°12'6.24"

Орловский ГАУ Орловская 404 SERLES404 Темно-серая Залежь N 52°59'34.94'

обл. лесная E 36°0'29.92''

Продолжение таблицы 1

Примечание. НИИАЗ — НИИ аридного земледелия, НИИСХ — НИИ сельского хозяйства, ВНИ-ИМЗ — Всероссийский НИИ сельскохозяйственного использования мелиорированных земель, НИА-ГЛОС — Научно-исследовательская агролесомелиоративная опытная станция, ВНИИОУиТ — Всероссийский НИИ органических удобрений и торфа, ВНИИЗиЗПЭ — Всероссийский НИИ земледелия и защиты почв от эрозии, ВНИАЛМИ — Всероссийский НИИ агролесомелиорации, КИАПП — Крымский институт агропромышленного производства, ГАУ — государственный аграрный университет.

Анализ нуклеотидных последовательностей. Используемые в работе праймеры были сконструированы на основе последовательностей гена 16Б-рРНК как бактерий, так и архей, что позволяет проводить комплексный анализ прокариотного сообщества. 2. Число секвенированных последовательностей гена 168-рРНК, операционных таксономических единиц (ОТЕ) и рассчитанные индексы биоразнообразия Шеннона и СИао1 для почвенных образцов из разных географических точек (Россия, Украина)

Образец Индекс Шеннона (И) Индекс СЬаоІ Число ОТЕ Секвенировано последовательностей

БиК80Ь19 8,48 1841 740,8 3857

80Ю^37 8,70 2068 824,2 4435

СИЕКЖ59 8,61 2365 830,0 4594

СИЕКЖ86 8,37 1927 759,2 4433

Р0Б70Ь108 7,45 1193 513,6 4101

Р0Б70Ь124 8,87 1926 857,9 2011

СИЕЯЖШ 8,28 1662 697,3 2181

8ЕЯЬЕ8195 8,50 1775 735,9 3952

Р0ЖЕШ02 8,09 1735 681,1 3877

8ЕЯЬЕ8235 8,84 2289 844,6 4113

Р0Б70Ь253 8,15 1681 693,6 4113

СИЕКЖ279 8,12 1696 733,6 5010

КЛ8ИТМ294 8,29 1954 725,7 4209

КЛ8ШУ312 6,42 848 469,6 5029

КЛ8ШУ326 8,25 2034 729,6 3935

8иОЬ8У345 9,18 3422 1010,3 5704

ЛЬЬБЕК357 8,68 2210 815,4 4124

ЛЬЬБЕК384 7,77 1139 565,5 2783

КИЛ87М399 7,47 1370 535,9 3218

8ЕЯЬЕ8404 8,62 2287 837,7 5089

Примечание. Число ОТЕ указано в расчете на 2011 сиквенсов.

Всего было секвенировано 100 589 последовательностей, из которых после процедуры проверки качества (РЛЬІТУ > 25) и фильтрации для дальнейшего анализа отобрали 62 977 последовательностей длиной 270 нуклеотидов. Число последовательностей в каждой пробе варьировало от 2011 до 5704 (в среднем 4059,5) (табл. 2). Общее число ОТЕ (последовательности гена 16Б-рРНК, имеющие 97 % сходства, что примерно соответствует таксономической категории вида) в пробах составило 10 891. Их объединили в 42 филы (рис. 1, А, см. табл. 2) и 350 семейств (см. рис. 1, Б, табл. 2). Таксономическую принадлежность значительной части последовательностей не удалось установить как на уровне вида и рода, так и на более высоких таксономических уровнях, включая филы. Наличие неатрибутируемых (НА) последовательностей обусловлено неполнотой имеющихся баз данных и характерно для метагеномных исследований.

На уровне доменов преобладали бактерии (93,3-99,9 %), доля архей оказалась значительно ниже (от 0,01 % в пробе Р0Б20Ь253 до 6,7 % — в КЛ8И8У326). В ряде образцов имелись нуклеотидные последовательности, не атрибутируемые на уровне домена. Качественный состав бактериальных и археотных фил был сходным для всех рассматриваемых образцов. Положение доминирующих групп бактерий занимали представители фил РгоівоЬасівгіа (до 59,3 %), ЛсіїпоЬа^вгіа (до 26,5 %), УєггисотісгоЬіа (до 13,6 %), Bactвroidвtвs (до 10,5 %), Firmicutвs (до 8,2 %), Оєттаіітопайвів8

Рис. 1. Представленность фил (А) и семейств (Б) микроорганизмов (по данным секвенирова-ния последовательностей гена 16Б-рРНК) в почвенных образцах из разных географических точек (Россия, Украина; отмечены соответственно преобладающие филы и семейства).

(до 6,9 %), СЫого/1ех1 (до 5,7 %). Археи были представлены филой Сгепаг-скаео1а. Подобное распределение весьма характерно для почвенных сообществ (8, 9). Решающую роль при сравнении таксономической структуры микробного сообщества в почвенных образцах играет соотношение бактериальных фил. Так, представители филы ЛсИпоЬас1епа заметно увеличивали численность в образцах ККЛБ2М399, 80Ь0МС37, КЛБШУ326, Р0ЖЕШ02, СИЕКК286, КЛ5ИТМ294 и КЛ5И8У326. Все эти образцы были отобраны на территории южных регионов России и в Крыму (см. табл. 1, рис. 2), которые характеризуются наличием длительного засушливого периода. Поэтому доминирование актинобактерий в указанных образцах вполне объяснимо и может быть связано с их повышенной устойчивостью к низкому содержанию влаги в среде. Интересно, что в упомянутый список не попали еще два «южных» образца — КЛ8ИБУ312 и СИЕЯМ2279 (см. табл. 1, рис. 2), в которых актинобактерии оказались в значительной степени

3. Представленность фил и семейств микроорганизмов в совокупном метагеноме (по данным секвенирования последовательностей гена 16Б-рРНК) в почвенных образцах из разных географических точек (Россия, Украина)

вытесненными из состава сообщества представителями филы Рго1еоЬас1епа (см. рис. 1, А). Если исключить названные образцы из рассмотрения, то при анализе таксономической структуры можно обнаружить тенденцию к преобладанию филы Лс-НпоЬаМепа в южных и Рго1еоЬас1епа — в северных регионах. Стоит отметить, что в южных регионах возрастает и численность представителей филы Fiгmicutes (КЛ8И8У326 и Р01МЕ№02). Ярко выраженную тенденцию в изменении численности демонстрируют бактерии из филы ЛаёоЬа^епа, которые распространены в основном в дерново-подзолистых почвах (Р0Б20Ь108, Р0Б20Ь124, ЛЬЬБЕЯ384, Р0Б20Ь253; см. рис. 1, А). Такое распределение, скорее всего, связано с низкими значениями рИ подзолистых почв, поскольку высокая кислотность среды создает оптимальные условия для развития аци-добактерий (10). Полученные нами данные служат прекрасной иллюстрацией и дополнением к недавно проведенным экспериментам по изучению распространения бактериальных фил в зависимости от физико-химических факторов среды, в которых было показано, что наиболее сильное влияние на почвенное сообщество оказывают влажность и кислотность/щелочность (11).

На уровне семейств мы наблюдали крайне сложную структуру сообщества с отсутствием четко выраженных доминирующих групп бактерий. Такие группы появлялись лишь в ряде образцов: например, в образце КЛБИБУ 312 значительно увеличилась численность семейств ЕШегоЬа^еп-асеа и Рзеийотопайасеа (соответственно 26,43 % и 15,11 %), в образцах Р0Б20Ь124 и ЛЬЬБЕЯ 384 возрастала доля не атрибутируемых на уровне семейства ацидобактерий, в образце ККЛБ2М399 отмечалось повышение численности не атрибутируемых на уровне семейства бактерий из класса ЛсНпоЬа^епа (см. рис. 1, Б). И в то же время значительное число се-

Таксономическая группа Доля, % Таксономическая группа Доля, %

Филы

ЛсНпоЬа^епа 39,0 Euгyaгchaeota 0,0

РМеоЬа^епа 27,8 СЫогоЫ 0,0

ЛсШоЬа^епа 7,6 ЕшоЬа^епа 0,0

УеггисотсгоЫа 3,8 Spiгochaetes 0,0

Chloгoflexi 3,6 ТепепсШе5 0,0

Gemmatimonadetes 3,6 Theгmi 0,0

ЕгтсШе^ 3,2 7В2 0,0

Неидентифицированная фила 2,9 DefeггiЬacteгes 0,0

Bacteгoidetes 2,8 СаШшпса 0,0

Cгenaгchaeota 2,4 Spiгochaetes 0,0

Planctomycetes 1,8 Chгysiogenetes 0,0

Шгозргае 0,2 Theгmotogae 0,0

БРЛМ 0,2 Лquificae 0,0

Неидетифицированный домен 0,1 Syneгgistetes 0,0

ЛБ3 0,1 Dictyoglomi 0,0

Лгmatimonadetes 0,1 Е^ШкгоЫа 0,0

ССМ11Ь 0,1 0Р11 0,0

Chlamydiae 0,1 ЕШгоЬа^ее 0,0

СуапоЬа^епа 0,1 Lentisphaeгae 0,0

Е^ШсгоЫа 0,1 TheгmodesulfoЬacteгia 0,0

0,1 SR1 0,0

WS3 0,1

Семейства

HyphomicгoЬiaceae 3,3 КопЬаЫегасеае 0,6

SpaгtoЬacteгiaceae 2,9 Geodeгmatophilaceae 0,6

Е^егоЬа^епасеае 2,8 ЛсеШЬа^егасеае 0,6

Nitгososphaeгaceae 2,4 ЛКШ874 0,5

5оНгиЬгоЬа^егасеае 2,2 Haliangiaceae 0,5

Sphingomonadaceae 2,1 Intгaspoгangiaceae 0,4

,^оНЬа^егасеае 1,9 ЫсгоЬа^епасеае 0,4

Gemmatimonadaceae 1,9 Micгomonospoгaceae 0,4

BгadyгhizoЬiaceae 1,8 MycoЬacteгiaceae 0,4

Шса^юШасеае 1,7 Р5еМопоса^асеае 0,4

Pseudomonadaceae 1,6 ЕкхШа^егасеае 0,4

ЯиЬгоЬа^егасеае 1,5 ВасШасеае 0,4

РаШИЬа^егасеае 1,2 СаШоЬа^егасеае 0,4

Bhodospmllaceae 1,1 ОхаЬЬа^егасеае 0,4

ЕВ1017 1,0 СЬ500-29 0,3

SyntгophoЬacteгaceae 1,0 Iamiaceae 0,3

,^шоЬа^егасеае 0,9 РаешЬасШасеае 0,3

ЛсШоЬа^епасеае 0,8 ВшШоШепасеае 0,3

Stгeptomycetaceae 0,8 Comamonadaceae 0,3

Xanthomonadaceae 0,8 ГгапЫасеае 0,2

Мсгососсасеае 0,7 ЕЕСИ4570 0,2

Gemmataceae 0,7

мейств бактерий были достаточно равномерно представлены во всех типах почв — прежде всего, это не атрибутируемые на уровне семейства бактерии из порядка МС47 (ЛсНпоЬа^епа), семейства SoliгuЬгoЬacteгiaceae, Ра-

ШНЬа^егасеае из порядка SoliгuЬгoЬacteгiales (Лс^по-ЬасЛепа), различные семейства протеобактерий из порядков RhizoЬiales и Sphin-gomonadales, а также семейства S0GA31 (СЫотА’exi) и Gemmatmonadaceae (Gem-matmonadetes) (см. рис. 1, Б). Интересно, что похожий набор бактериальных семейств мы наблюдали при изучении засоленных почв Казахстана (12), о присутствии бактерий из ряда вышеупомянутых семейств в различных почвах также сообщают другие авторы (8). Описанная тенденция характерна и для архей: так, во всех почвах доминировали археи из семейства Ж-tгososphaeгaceae. Повсеместное присутствие микроорганизмов этой группы можно объяснить их активным участием в первых стадиях процесса нитрификации (13). Наличие таких бактериальных и археотных космополитов свидетельствует о присутствии в почве корового и аксессорного компонентов почвенного микробиома (по аналогии с коровым и аксессорным компонентами геномов микроорганизмов). Присутствие корового компонента еще раз указывает на высокую степень экологической пластичности почвенного сообщества, связанной как с адаптивными возможностями отдельных микроорганизмов, так и с «генетическим потенциалом» самой почвы, основанным, в частности, на поддержании в ней огромного пула внеклеточной ДНК (14).

Анализ а-разнообразия. Все изученные образцы подразделялись на три группы (рис. 3), причем в первую входил только один обра-

Рис. 3. Данные анализа а-разнообразия (по числу выявленных видов микроорганизмов) на основании результатов секвенирования последо-АЫЛ}ЕЮ84 вательностей гена 168-рРНК в поч-К^АзгмЗЭЭ венных образцах из разных геогра-РОвгОЫ08 фических точек (России, Украина). КА8Н8У312

зец SUGLSV345 с наибольшим разнообразием по всем критериям, в среднюю — почти все оставшиеся образцы, в том числе все серые лесные почвы и все черноземы (в основном представлены необрабатываемые

Рис. 2. Положение точек отбора изученных почвенных образцов в разных географических зонах (Россия, Украина).

0,2

0.1

-0,1

-0,2

-0,3

-0.4

[ Группа <• 14)1)701.» Группа «SERI.ES*

і ‘ ▼

' 1 \ > \ У **

О О о\ \>/ «3

А

а ,

О вивЕЗУ о РОШЕК о АББОЕИ

■роигоь о ВШЮОІ, • СНЕІСЧ/ < КА8Н8У А50ШЫС ► SERI.ES

▼ кялэгм

♦КА8НТМ

-0,4 -0,3 -0,2 -0,1

о

0.1

0,2 0,3

Рис. 4. Данные анализа р-разнообразия (на основании результатов секвенирования последовательностей гена 16Б-рРНК) (А — дендрограмма родства, 1 — кластер 1; Б — двумерный график) в почвенных образцах из разных географических точек (Россия, Украина).

почвы, индекс Шеннона от 8,08 до 8,87) (см. табл. 2), и последнюю представляли образцы ЛЬЬББК384, ККАБ2М399, Р0Б20Ь108 и КЛ8ШУ312, в которых наблюдался сдвиг биоразнообразия в пользу одной из фил. В образцах ЛЬЬББЯ384 и Р0Б20Ь108 преобладали ацидобактерии, что, скорее всего, связано с повышенной кислотностью почвы. В образце ККАБ2М399 было выявлено максимальное число актинобактерий (70,48 % от общего числа бактерий). Образец КЛ8И8У312 характеризовался наименьшим биоразнообразием: особенность этой почвы заключается в абсо-

Б

лютном преобладании в ней бактерий из филы Proteobacteria (см. рис. 1, А). Существует мнение, что доминирование протеобактерий типично для на-рушенныж почвенных местообитаний (15).

Анализ ß-разнообразия. Часть образцов группировались друг с другом в соответствии с типом почвы (PODZOL и SERLES) (рис. 4. Б), также сильной была тенденция в образовании кластеров в соответствии с определенными физико-химическими параметрами почвы, такими, например, как значения pH (см. рис. 4, А). В этой связи представляет интерес группа CHERNZ, в которой образцы с близким географическим положением (№ 59 и № 86) имели различную структуру микробиома (находились в разных кластерах), а два других образца, отобранных соответственно в южной и западной части страны (№ 59 и № 187), кластеризовались вместе (см. рис. 2, рис. 4, А). Вероятной причиной, определяющей в этом случае сходство или различие в структуре микробиомов, могут быть показатели рН — сходные (для образцов № 59 и № 187 рН соответственно 7,64 и 7,34) или, наоборот, различающиеся (для образцов № 59 и № 86 рН соответственно 7,64 и 6,22). Из приведенных фактов можно заключить, что на структуру микробиома оказывает воздействие не только (и не столько) тип почвы, сколько значения физико-химических показателей среды, в частности ее кислотность/щелочность. Полученный результат хорошо согласуется с данными ряда исследований, в которых авторам удалось показать, что pH среды — наиболее сильный, а иногда и единственный фактор, определяющий таксономический состав микробиома (16).

Таким образом, появление методов проточного секвенирования произвело существенный сдвиг в понимании истинныгх масштабов природного генетического разнообразия микробных сообществ и поставило перед почвенной микробиологией ряд принципиально новых научных проблем. В частности, по результатам проведенного нами исследования выявлена связь между абиотическими факторами (рН и увлажненность территории) и таксономическим составом микробного сообщества. Безусловно, для подтверждения обнаруженных закономерностей, а также включения в анализ всего спектра экологических факторов должны быть изучены несколько сотен образцов. Однако, как показали наши эксперименты, в состав почвенного микробиома входят сотни и даже тысячи видов, что затрудняет его анализ с использованием традиционных экологических подходов, а при большом числе тестируемыгх образцов делает его практически невозможным. Поэтому вместе с увеличением объемов выборки необходима разработка качественно новых методов анализа данных высокопроизводительного секве-нирования, что позволило бы перейти от описательной экологии к функциональной. Очевидно, что требуется внедрение принципиально новых интегральных подходов, когда микробное сообщество рассматривается как некое функциональное единство, которое, с одной стороны, полностью зависит от условий среды, с другой — выступает основным фактором ее формирования.

ЛИТЕРАТУРА

1. Wo o le y J.C., Ye Y. Metagenomics: Facts and artifacts, and computational challenges. Journal of Computer Science and Technology, 2010, 1(25): 71-81.

2. Mardis E.R. Next-generation DNA sequencing methods. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet., 2008, 9: 211-219.

3. Ronaghi M. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysisю Methods Mol Biol., 2004, 255: 211-219.

4. Malferrati G., Monferinin P., De Blasio P. et al. High-quality genomic DNA from human whole blood and mononuclear cells. Bio Techniques, 2002, 33(6): 1228-1230.

5. Андронов Е.Е., Петрова С.Н., Чижевская Е.П., Коростик Е.В., Ахтемо-ва Г.А., Пинаев А.Г. Влияние внесения генетически модифицированного штамма Si-norhizobium meliloti Ach_5 на структуру почвенного сообщества микроорганизмов. Микробиология, 2009, 78(4): 525-534.

6. Bates S.T., Berg-Lyons J.G., Caporaso W.A. et al. Examining the global distribution of dominant archaeal populations in soil. ISME J., 2010, 5: 908-917.

7. Caporaso J.G., Kuczynski J., Stombaugh J. et al. QIIME allows analysis of highthroughput community sequencing data. Naturemethods, 2010, 7(5): 335-336.

8. Fie re r N., Jackson R.B. The diversity and biogeography of soil bacterial communities. PNAS USA, 2006, 103: 626-631.

9. Nemergut D.R., Costello E.K., Hamady M. Global patterns in the biogeography of bacterial taxa. Environ. Microbiol. J., 2010, 1(10): 53-63.

10. R o u s k J., B a a t h E., Brookes P.C. et al. Soil bacterial and fungal communities across a pH gradient in an arable soil. ISME J., 2010, 5: 1-12.

11. Lauber C.L., Strickland M.S., B r a d f o r d M.A., Fierer N. The influence of soil properties on the structure of bacterial and fungal communities across land-use types. Soil Biol. Biochem., 2008, 40: 2407-2415.

12. Дольник А.С., Тамазян Г.С., Першина Е.В., Вяткина К.В., Порозов Ю.Б., Пинаев А.Г., Андронов Е.Е. Концепция универсальной таксономической системы бактерий: эволюционное пространство гена WS-рРНК v. 1.0. Сельскохозяйственная биология, 2012, 5: 55-67.

13. П и н е в и ч А.В. Микробиология. СПб, 2007.

14. Levy -Booth D.J., Campbell R.G., Gulden R.H., Hart a M.M., Po wellc J.R., Klironomos J.N., Pauls K.P., S w a nt o n C.J., Trevorsa J.T., D u nfie l dd K.E. Cycling of extracellular DNA in the soil environment. Soil Biol. Biochem., 2007, 39: 2977-2991.

15. Spain A.M., Krumholz L.R., Elshahed M.S. Abundance, composition, diversity and novelty of soil Proteobacteria. ISME J., 2009, 3: 992-1000.

16. Lauber C.L., Hamady M., Knight R., Fierer N. Pyrosequencing-based assessment of soil pH as a predictor of soil bacterial community structure at the continental scale. Appl. Environ. Microbiol., 200975(15): 5111-5120. doi: 10.1128/AEM.00335-09.

1ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной Поступила в редакцию

микробиологии Россельхозакадемии, 9 августа 2012 года

196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3, e-mail: [email protected];

2Санкт-Петербургский государственный университет,

199034 г. Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский просп., 28, e-mail: [email protected];

3Почвенный институт им. В.В. Докучаева Россельхозакадемии,

119017 г. Москва, Пыжевский пер., 7, e-mail: [email protected].

TAXONOMIC STRUCTURE OF MICROBIAL ASSOCIATION IN DIFFERENT SOILS INVESTIGATED BY HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING OF 16S-rRNA GENE LIBRARY

E.L. Chirak1, E.V. Pershina1, A.S. Dol’nik2, O.V. Kutovaya3, E.S. Vasilenko3,

B.M. Kogut3, Ya.V. Merzlyakova1, E.E. Andronov1

S u m m a r y

The features of soil microbiome may be an universal and very sensitive indicator of soil state used for optimization and biologization of agriculture systems. However, this approach to the matter requires a preliminary analysis of microbiomes composition in different types of soils. An analogical taxonomic investigations presented difficult task formerly and took considerable material and time expenditures. The introduction to molecular ecology of the new progeny methods of sequencing permits to increase both a number of revealed microorganism species and analyzed ecotops. The authors made the primary analysis of microbial associations with the use of pyrosequencing of soil metagenome. For the study, the collection of soils from different regions of Russia (19 samples) and also from the Crimea (Ukraine, 1 sample) was created. The bacteria from phylas of Proteobacteria (up 59.3 %), Actinobacteria (up 55.4 %), Acidobacteria (up 26.5 %), Verrucomicrobia (up 13.6 %), Bacteroidetes (up 10.5 %), Firmicutes (up 8.2 %), Gemmatimonadetes (up 6.9 %), Chloroflexi (up 5.7 %) and archaea from Crenarchaeota phyla were dominating in microbial associations. The comparison of taxonomic structure of microbial associations indicates that physiochemical factors (acidity and moisture of soil) have a more influence on prokaryote biodiversity than other factors (for example, type of soil or sampling point). So the soils from south regions with lesser moisture contain more the actinobacteria, when the moister north soils contain mainly the proteobacteria. The soils with low pH are characterized by a raise of acidobacteria percent.