CC BY
30
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬН! ТА МОРФОЛОГ1ЧН1
ДОСЛ1ДЖЕННЯ
УДК 599.323.4+591.26+616.379-008.64]:547.461.2-028.77
ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНКИНАЗЫ С НА СОСТОЯНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО СИГНАЛЬНОГО ПУТИ ENOS-ПРОТЕИНКИНАЗА G ТРОМБОЦИТОВ КРЫС ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ
Баринова М.Э., Григорян Х.В., Сулаева О.Н., Хламанова Л.И.
Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького
Целью данной работы стало изучение модулирующих эффектов ингибитора протеинкиназы С на состояние внутриклеточной сигнальной системы eNOS-протеинкиназа G при сахарном диабете у животных с различной исходной резервной мощностью eNOS. На основании оценки эффекта L-аргинина в in vitro тесте, отражающего резервную мощность eNOS, крысы были разделены на нормореактивных (1 группа) и гипореактивных (2-я - без коррекции и 3-я группа - с использованием Рубоксистаурина). Проведенное исследование показало, что ингибирование про-теинкиназы С предотвращает раннее развитие эндотелиальной дисфункции при сахарном диабете у крыс с низкой исходной резервной мощностью eNOS и снижает степень ее выраженности в течение 2 месяцев после моделирования сахарного диабета. Ключевые слова: протеинкиназа, тромбоциты, сахарный диабет
Среди причин альтерации тканей при сахар-
ном диабете (СД) ведущее место занимает нарушение внутриклеточного метаболизма и сигнализации, одним из проявлений которого является активация протеинкиназы С (ПкС) [4, 6]. Последняя играет важную роль в реализации ряда морфогенетических процессов, включая пролиферацию, гипертрофию клеток, их миграцию и реализацию воспалительной реакции [7, 10]. Избыточная активация ПкС на сегодняшних день рассматривается в качестве одного из ведущих патогенетических факторов развития микрососудистых осложнений СД, включая ретинопатию, нефропатию и нейропатию [8, 9]. Патогенетические эффекты высокой активности ПкС связывают с нарушением метаболических процессов в митохондриях, внутриклеточного обмена Са2+, повышением продукции цитокинов, включая ИЛ-6, и развитием инсулиновой резистентности [6, 8]. Одной из системы защиты клеток от действия патогенетических факторов СД является повышение продукции эндотелиально-го фактора - оксида азота за счет активации еЫОЭ [1, 4]. Доказана роль полимфорфизма экспрессии гена данного фермента в детерминации выского риска развития сердечнососудистых заболеваний [5]. В первую очередь это связано с иницацией синдрома эндотели-
альной дисфункции. Однако, современная медицина не располагает исчерпывающей информации относительно взаимосвязи между ПкС и вариабельностью параметров работы сигнальной системой eNOS-протеинкиназа G, что при СД, по сути, определяет риск развития осложнений и их прогноз.
Целью данной работы стало изучение модулирующих эффектов ингибитора ПкС на состояние внутриклеточной сигнальной системы eNOS-Протеинкиназа G при СД у животных с различной исходной резервной мощностью eNOS.
Материал и методы
Работа выполнена на 105 белых крысах-самцах массой 220±25 г, содержащихся в режиме свободного доступа к воде и пище. Моделирование СД 1 типа проводили после 18-часового голодания путем введения аллоксана (16 мк/кг) в хвостовую вену животного. Показателем развития инсулярной недостаточности считали повышение уровня глюкозы в крови в пределах 1224 ммоль/л на 14 сутки эксперимента.
Для оценки состояния внутриклеточной сигнальной системы eNOS-протеинкиназа G использовали тест in vitro с индуцированной агрегацией тромбоцитов (AT). Выбор в качестве
* Работа выполнена в рамках НИР кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ДонНМУ «Вивчити роль внутр1Ш-ньокл/тинних сигнальних систем п\д час реал\зацп запальнево-репаративних процессе в органах, що забезпечують гомео-стаз орган/зму» (№ держреестрацп 010вй01840)
BiCHHK Украгнсъког жедичног стоматологгчног акадежШ
объекта исследования тромбоцитов мотивирован широким спектром рецепторов и высоким уровень экспрессии eNOS, аналогичным таковому в эндотелиальных клетках [2]. В качестве индуктора агрегации использовали АДФ в конечной концентрации бмкМ, вызывающей 50% AT. Для оценки функционирования внутриклеточной системы eNOS-Протеинкиназа G использовали комбинацию АДФ со стимулятором или ингибитором в следующих концентрациях: трифтазин (ТФЗ, ингибитор системы Са2+-кальмодулин) - 2 мкМ, L-аргинин (субстрат, стимулирующий активность eNOS) - 2О0 мкМ; L-NAME (ингибитор eNOS) - 1 мкМ, ODQ (1H-[1,2,4]оксадиазоло[4,3-а]квиноксалин-1 (ингибитор ГЦ) - 10мкМ, теофиллин - (ингибитор фос-фодиэстераз) - 5 мкМ [2]. Определяли степень изменения AT в каждой пробе, выражая ее в процентах относительно показателя при инкубации с АДФ. Эффект L-NAME отражал реальную активность eNOS, тогда как изменение AT при добавлении L-аргинина позволяло судить о резервной мощности фермента. Оценку активности различных звеньев внутриклеточных сигнальных систем проводили у интактных крыс до моделирования диабета, а также через 14 суток, 1 и 2 месяца после введения аллоксана.
На основании анализа in vitro эффекта L-аргинина до начала эксперимента, все подопытные животные были разделены на две группы: с нормальной (1 группа, n=45, индуцированная AT снижалась на 15-20% - нормореактивные животные) и сниженной резервной мощностью eNOS (n=60; индуцированная AT изменялась на 5-8% - гипореактивные животные). Данную популяцию крыс разделили на две группы: 2-ю (n=27, без какой-либо фармакологической коррекции) и 3-ю (n=33, с введением ингибитора ПкС - Рубоксистаурина, который назначали животным в дозе 10мг/кг через 2 недели после введения аллоксана. В исследованиях использованы реактивы фирмы "Sigma" (США). Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием пакета компьютерных прикладных программ [3].
Результаты исследования и их обсуждение
У интактных крыс 1-й группы добавление ТФЗ в инкубационную смесь тромбоцитов, выделенных из крови крыс 1-й группы, приводило к повышению АДФ-индуцированной AT на 16,3±0,6% (р<0,05). Стимуляция и ингибирование eNOS при добавлении L-аргинина и L-NAME сопровождались уменьшением AT соответственно на 18,4±0,8% и 17,9±0,7% (р<0,05). Ингибирование ГЦ вызывало повышение индуцированной AT на 18,3±0,9% (p<0,05), а эффект теофиллина достигал 13,2+0,4% (р<0,05). Модулирующий эффект ингибитора ПкС на AT составлял 7,8+0,15%. У животных 2-й группы выявлен низкий дезагрегационный эффект L-аргинина, который оказался на 61,41% (p<0,001) ниже, чем у
крыс 1-й группы. В условиях низкой резервной мощности еЫОЭ отмечено поддержание относительно высокого базального уровня Са2+-зависимого механизма регуляции активности фермента: эффекты Ь-ЫАМБ и ТФЗ были лишь на 7,26% и 6,78% ниже, чем у крыс 1-й группы (р<0,05). При этом активность ГЦ, ФДЭ и ПкС не имела статистически значимых отличий от таковых у животных 1-й группы.
Оценка состояния сигнальной системы через 14 суток после введения аллоксана у животных 1-й группы продемонстрировала активацию внутриклеточной сигнальной системы еЫОв-Протеинкиназа в. Эффекты ингибиторов еЫОЭ, ТФЗ и ГЦ были на 40,22%, 24,53% и 48,63% выше, чем у интактных крыс (р<0,01), что отражает повышении активности соответствующих ферментов (р<0,01). Отмечено снижение степени корреляции между эффектами ТФЗ и Ь-ЫАМБ до г=+0,683, что может свидетельствовать о включении других модулирующих систем в регуляцию активности еЫОЭ. У гипореактивых крыс 2 группы повышение активности еЫОЭ к 14 суткам оказалось на 17,88% меньше, чем в 1-й группе. Прирост эффекта ТФЗ по сравнению с интактными крысами той же группы составил 19,07% (р<0,05), но тем не менее был на 11,04% ниже, чем в 1-й группе (р<0,05). Эти изменения сопровождались выраженной активацией ГЦ, мало отличающейся от таковой у нормореак-тивных животных. Тем не менее у гипореактив-ных крыс имеет место ограниченная активация Пкв в силу возросшей активности ФДЭ, о чем свидетельствовало усиление эффекта теофиллина на 9,16% (р<0,05) по сравнению с исходным уровнем.
Через 1 месяц после моделирования СД 1 типа у нормореактивных животных эффект ТФЗ оказался на 11,33% выше, чем в предыдущий срок исследования (р<0,05) и на 38,65% превышал таковой у интактных крыс (р<0,01), отражая степень повышения Са2+-зависимой стимуляции еЫОЭ. Однако при этом зафиксировано более выраженное увеличение активности фермента: эффект Ь-ЫАМБ был на 14,74% выше, чем в предыдущий срок исследования (р<0,05), и на 60,89% (р<0,01) отличался от показателя у интактных крыс. При этом коэффициент корреляции между эффектами ТФЗ и Ь-ЫАМБ уменьшился до г=+0,594, отражая снижение эффективности Са2+-зависимого пути стимуляции еЫОЭ. Увеличение активности ГЦ составило 32,8%+2,1% (р<0,01), что было на 79,23% выше, чем у интактных крыс (р<0,01). Однако при этом отмечен параллельный прирост активности ФДЭ. Эффект теофиллина на АТ возрос и на 31,82% превышал таковой у интактных крыс (р<0,01).
В отличие от этого у животных 2-й группы к концу 1 месяца после введения аллоксана отмечено снижение активности еЫОЭ. Проагре-гантный эффект Ь-ЫАМБ снизился на 40,28%
(р<001) по сравнению с предыдущим сроком исследования, и был на 24,09% ниже исходного уровня (р<0,01). Эффект ТФЗ был на 34,81% (р<0,01) ниже, чем в предыдущий срок исследования и на 22,36% (р<0,05) меньше исходного уровня.
Назначение Рубоксистаурина предотвращало снижение активности внутриклеточного сигнального пути еМОЭ-Протеинкиназа в у гипоре-активных крыс через 1 месяц после моделирования аллоксанового диабета. У животных 3-й группы сохранялась повышенная активность еМОЭ: эффект Ь-МДМБ мало отличался от показателя в предыдущий срок исследования, но на 76,19% (р<0,01) превышал показатель у крыс 2-й группы. Тем не менее, сравнение с данными у нормореактивных крыс свидетельствует о дефиците активности еМОЭ у животных 3-й группы, достигавшем 22,92% (р<0,05). Это было в основном связано с особенностями Са2+-зависимой регуляции фермента: эффект ТФЗ у крыс 3-й группы был на 55,93% (р<0,01) выше, чем во 2-й группе, но на 18,58% ниже, чем у нормореактивных животных (р<0,01). Тем не менее, ингибирование активности ПкС оказало позитивное влияние на суммарный внутриклеточный пул цГМФ. Об этом можно судить по изменению баланса между активностью ГЦ и ФДЭ. Так, активность ГЦ превышала показатель во 2-й группе на 39,9% (р<0,01), тогда как эффект теофиллина был на 16,57% ниже (р<0,05). Интересно, что последний показатель оказался на 13,22% меньше (р<0,05), чем у нормореактивных крыс, свидетельствуя о повышении эффективности функционирования конечного звена внутриклеточной сигнальной системы, запускаемой МО - Протеинкиназы в.
Через 2 месяца после введения аллоксана у крыс 1-й группы отмечено развитие декомпенсации внутриклеточной сигнальной системы еМОЭ-Протеинкиназа в. Эффект ТФЗ и ЬМДМБ были на 19,01% и 29,06% ниже такового у ин-тактных крыс (р<0,01). Эффект ингибитора ГЦ снижался на 46,65% (р<0,01) по сравнению с предыдущим сроком исследования и не имел достоверных отличий от показателя у интактных крыс. При этом эффект теофиллина на АДФ-индуцированную АТ оказался на 44,69% выше, чем у здоровых животных (р<0,01). Изменения во 2-й группе свидетельствовали о прогресси-ровании синдрома эндотелиальной дисфункции. К концу 2-го месяца у гипореактивных крыс эффекты ТФЗ и Ь-МДМБ составляли соответственно 9,2+0,11% и 9,7+0,17% (р<0,05), т.е. были практически в 2 раза ниже контрольных значений, что может быть результатом развития ок-сидативного стресса и разобщения фермента в условиях высокого внутриклеточного уровня Са2+ [1, 7]. На этом фоне снижалась активность ГЦ: эффект ингибитора фермента уменьшался на 19,23% по сравнению с таковой в предыдущем сроке исследования и на 6,14% относи-
тельно исходного уровня (р=0,05). Связанное с этим снижение продукции цГМФ усугублялось продолжающимся ростом активности ФДЭ, которая, судя по эффекту теофиллина, на 51,14% превышала исходный показатель (р<0,01).
Применение ингибитора ПкС не предотвращало снижения активности еМОЭ у гипореактивных крыс, но снижало выраженность декомпенсации. Так, эффект ТФЗ и Ь-МДМБ оказались на 32,61% и 38,14% (р<0,01) выше, чем у гипореактивных крыс без фармакологической коррекции и не имели достоверных отличий от соответствующих показателей в 1-й группе. Примечательно, что при этом активность ГЦ у животных 3 группы превышала аналогичный показатель в 1-й и 2-й группах на 6,85% и 11,31% (р<0,05), тогда как активность ФДЭ была на 16,23% и 19,19 % ниже таковых в группах сравнения. Это свидетельствует о том, что, несмотря на снижение активности еМОЭ у крыс рубоксистаурин повышается эффективность работы сигнального пути, запускаемого МО.
Результаты данной работы свидетельствуют о позитивном влиянии ингибитора ПкС на деятельность внутриклеточной сигнальной системы еМОЭ-Протеинкиназа в. Это может быть обусловлено модуляцией как системных параметров гуморальной регуляции, так и непосредственной коррекцией внутриклеточного метаболизма. Известно, что активация ПкС сопровождает реализацию патогенетических эффектов таких регуляторов, как адреналин и норадрена-лин, эндотелин-1 и ангиотензин II [7]. Соответственно, снижение активности фермента может ограничивать ответ клеток-мишеней на действие патогенетических факторов [9]. Это может разрывать порочный круг событий, замедляя развитие инсулярной недостаточности и нарастание дефицита инсулина: выявлена прямая связь между активностью ПкС и степенью инсулярной дисфункции [7]. Кроме того, выявлена роль ПкС в десенситизации рецепторов к инсулину за счет снижения тирозинового фосфори-лирования субстрата инсулинового рецептора, нарушения связи инсулинового рецептора с фосфатидил-инозитол-3-киназой и изменения фосфорилирования ПкВ [8]. Не менее важным механизмом защитного действия ингибитора ПкС может быть оптимизация внутриклеточного метаболизма за счет коррекции обмена Са2+ и работы митохондрий, влияния на ПкА и ПкВ, стимулирующих экспрессию и активность еМОЭ [9]. При этом блок патогенетических эффектов гиперактивации ПкС при СД определяет не только оптимизацию состояния внутриклеточного метаболизма, но также изменяет характер межклеточных взаимоотношений. Так, показано, что ингибирование ПкС сопровождается повышение экспрессии фактора роста сосудистого эндотелия (УБОБ) при снижении продукции таких фиброгенов, как трансформирующий фактор роста (ТвБр) и фактор роста соединительной
BiCHHK Украгнсъког жедичног стожатологгчног акадежШ
ткани (ОТСР) [10]. Механизм данного феномена пока окончательно не выяснен. Результаты данной работы, учитывая известные эффекты ЫО, позволяют предполагать, что, по крайней мере, отчасти это связано с оптимизацией работы внутриклеточной сигнальной системы еЫОЭ-Протеинкиназа в.
Таким образом, ингибирование ПкС предотвращает раннее развитие эндотелиальной дисфункции при СД у крыс с низкой исходной резервной мощностью еЫОЭ и снижает степень ее выраженности в течение 2 месяцев после моделирования СД.
Полученные сведения могут быть использованы для разработки индивидуализированной стратеги коррекции эндотелиальной дисфункции и контроля ее эффективности на основании анализа состояния внутриклеточных сигнальных систем.
Литература
1. Бабак О.Я., Топчий И.И. Окислительный стресс, воспаление и эндотелиальная дисфункция - ключевые звенья патогенеза сердечно-сосудистой патологии при прогрес-
сирующих заболеваниях почек // Укр. тер. журн.- 2004.-№ 4.- С. 10-17.
2. Баринов Э.Ф., Романенко В.Н., Бондаренко Н.Н., Бари-нова М.Э., Ковальчук Н.В., Свистунов И.В. Использование теста агрегации тромбоцитов in vitro для оценки ад-ренореактивности организма // Лабораторная диагностика.- 1999.- № 4.- С. 39-42.
3. Лях Ю.Е. ГурьянВ.Г., Хоменко В.Н., Панченко О.А. Основы компьютерной биостатистики.- Д., 2006..- 211 с.
4. Feletou M., Vanhoutte P.M. Endothelial dysfunction: a multi-faceted disorder // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol.-2006. - Vol. 291, № 3.- P. 985 - 1002.
5. Jones L.C., HingoraniM.B. Genetic regulation of endothelial function // Heart.- 2005.- Vol. 91, № 10.- P. 1275 - 1277.
6. Vita J.A. Endothelial function and clinical outcome // Heart.-2005.- Vol. 91, № 10.- P. 1278 - 1279.
7. Kimura M., Ishizawa M., Miura A., Itaya S. Platelet protein kinase C isoform content in type 2 diabetes complicated with retinopathy and nephropathy // Platelets.- 2001.- Vol. 12, № 3.- P. 138-143.
8. Mingzhang G., Mack H., Ferenc K. Upregulation of PKC genes and isozymes in cardiovascular tissues during early diabetes // Physiol. Genomics.- 2003.- Vol. 12.- P. 139146.
9. Idris I., Richard D. Protein kinase C p inhibition: a novel therapeutic strategy for diabetic microangiopathy // Diabetes Vasc. Dis. Res.- 2006.- Vol. 3, № 3.- P. 172-178.
10. Meier M., King G.L. Protein kinase C activation and its pharmacological inhibition in vascular disease // Vasc. Med.- 2000.- Vol. 5.- P. 173-185.
Реферат
ВПЛИВ 1НГ1Б1ТОРУ ПРОТЕ1НК1НАЗИ С НА СТАН ВНУТР1ШНЬОКЛ1ТИННОГО СИГНАЛЬНОГО ШЛЯХУ eNOS-l~IPOTEIHKIHA3A G ТРОМБОЦИТ1В ЩУР1В ЗАУМОВ ЦУКРОВОГО Д1АБЕТУ Баринова М.Е., Григорян X.B., Сулаева О.М., Хламанова Л.1. Ключов1 слова: протешкшаза, тромбоцити, цукровий д1абет.
Метою даноТ роботи стало вивчення ефект1в ¡нг1б1тору протешкшази С на стан внутр1шньокл1тинноТ сигнальноТ системи eNOS-протеТнк1наза G за умов цукрового д1абету у щур1в з р1зною вих1дною резервною потужнютю eNOS. На п1дстав1 оц1нки ефекту L-apriHiHy в in vitro TecTi, що вщбивас резервну потужнють eNOS, тварини були розд1пен1 на нормореактивних (1 група) i rinopeaK-тивних (2 група - без корекцп i 3 група - з використанням Рубоксютаурина). Проведене дослщження показало, що ¡нг1бування протеТнк1нази С 3ano6irae ранньому розвитку ендотел1альноТ дисфункцп за умов цукрового д1абету в щур1в з низькою вих1дною резервною потужнютю eNOS, а також знижуе ступ1нь и виразност1 протягом 2 мюящв п1сля моделювання цукрового д1абету.
Summary
EFFECT OF PROTEIN KINASE C INHIBITOR ON CONDITION OF eNOS-PROTEIN KINASE SIGNALING PATHWAY OF G THROMBOCYTES IN RATS WITH DIABETES MELLITUS Barynova M.E., Hryhorian K.V., Sulaieva O.N, Khlamanova L.I.
Key words: protein kinase C, eNOS-protein kinase, G thrombocytes, diabetes mellitus, rats.
The present research was aimed to study the modulating effect of protein kinase C inhibitor on condition of eNOS-protein kinase signaling pathway of G thrombocytes under diabetes mellitus in animals with various eNOS initial standby power. On the basis of estimation of L-arginine effect in vitro test reflecting eNOS standby power the rats were divided into normoreactive (1st group) and hyporeactive (2nd group - without correction and 3rd group - with applying of ruboxistaurin). The research has shown the inhibition of protein kinase C prevented the early development of endothelial dysfunction under diabetes mellitus in rats with low initial eNOS standby power and reduced the level of its intensity for 2 months intensity after diabetes mellitus modeling.
