CC BY
18
BtCHHK Украгнсъког медичног стожатологЬчног академш
Реферат
ПРОГНОЗИРОВАНИЕ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ ОСЛОНЕНИЙ У НОВОРОЖДЕННЫХ С АСФИКСИЕЙ ПУТЕМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ КАК МАРКЕРА ГИПОКСИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ Похилько В.И.
Ключевые слова: асфиксия, новорожденный, лактатдегидрогеназа, шкала нейро-поведенческого розвития новорожденного.
В работе проанализирована прогностическая ценность определения уровня лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови у доношенных новорожденных с перинатальной асфиксией методом расчета коэффициентов соотношения шансов (КСШ) риска развития атипичных и субтипичных ответов по шкале NNNS (Neonatal Intensive Care Unit Network Neurobehavioral Scale). Расчет КСШ показал, что высокие цифры (более 199,2) ЛДГ в сыворотке крови новорожденных на третьи сутки жизни ассоциируются с большим процентом атипичных (КСШ 3,7) и субтипичных (КСШ 2,4) ответов на шестой день жизни и в месячном возрасте (КСШ 2,94 и 2,9 соответственно). Определение уровня ЛДГ на третий день жизни ребенка имеет клиническое и прогностичес-кое значение для предупреждения неврологических осложнений у новородженных с перинатальной асфиксией.
Summary
PREDICTION OF NEUROLOGICAL COMPLICATIONS IN NEWBORNS WITH ASPHEXIA BY DETERMINING LACTADEHYDROGENASE AS HYPOXIA MARKER Pohyl'ko V.I.
Key words: asphyxia, newborn, lactadehydrogenase, neonate neurobehavioral scale.
The present paper focuses on the prognostic value in determining the blood serum lactadehydrogenase (LDH) in term newborns with prenatal asphyxia by calculating coefficient of risk chance correlation (CRCC) in atypical and subtypical responses development according to NNNS (Neonatal Intensive Care Unit Network Neurobehavioral Scale). Calculation of this coefficient shows the high figures (more than 199.2) of LDH in neonates' blood serum in the third day of the life are associated with larger percentage of atypical (CRCC 3.7) and subtypical (CRCC 2.4) responses in the sixth day and at the age of a month (CRCC 2.94 and 2.9 correspondingly). The LDH estimation in the third day of a neonate is of a great clinical and prognostic significance in preventing the neurological complications in neonates with prenatal asphyxia.
УДК 616.33/.342-002.44-005.1-018.73
активность внутриклеточной сигнальной системы enos-протеинкиназа g в динамике заживления язвенного дефекта желудка после кровотечения Сулаева О.Н.
Донецкий государственный медицинский университет им. М.Горького
C целью оценки роли сигнальной системы eNOS-Протеинкиназа G в динамике заживления язв желудка проведен ингибиторный анализ в тесте in vitro с индуцированной агрегацией тромбоцитов 57 пациентов с язвенными кровотечениями. Показано, что развитие язвенного кровотечения происходит на фоне выраженного угнетения всех звеньев внутриклеточной сигнальной системы еNOS-Протеинкиназа G. Это связано с повышение внутриклеточного уровня Са2+, развитием оксидативного стресса и блоком Са2+-зависимого механизма стимуляции eNOS. Восстановление гомеостаза после остановки кровотечения сопровождалось подъемом активности eNOS и ГЦ через 1 сутки, однако дальнейшая динамика состояния систем eNOS-Протеинкиназа G носила индивидуальные особенности, интерпретация которых требует морфо-биохимических сопоставлений.
Ключевые слова язвенный дефект желудка, кровотечение, eNOS-протеинкиназа
Одним из патогенетических факторов развития язвенного кровотечения является эндотели-альная дисфункция. Следствием таковой является нарушение локальных механизмов регуляции тонуса, проницаемости, воспаления и репарации сосудистой стенки [4]. Адекватность локального кровотока в СОЖ зависит от действия системных регуляторов (гормоны, нейромедиа-торы) и локальных модуляторов (NO, гистамин, серотонин, ВИП) [3]. Среди них ведущую роль занимает оксид азота (NO) [2]. Как показали результаты исследований, N6 не только регулирует трофику и секреторную активность СОЖ, но также является мощным защитным фактором, обеспечивающим цитопротекцию при действии ульцерогенов, стимулирует ангиогенез и репарацию всех тканевых компонентов СОЖ [5]. В связи с этим появились факты касательно
значимости дефицита N0 в патогенезе формирования и прогрессирования язв ЖКТ. Более того, дефицит активности eNOS рассматривается как причина нарушения репаративной регенерации СОЖ. В этой связи целесообразно исследовать активность eNOS для прогнозирования течения раневого процесса в СОЖ и использования стимуляторов активности фермента в случае его ингибирования. С нашей точки зрения более полную информацию может дать комплексный анализ всех звеньев NO-зaвиcимoгo сигнального пути, позволяющий оценить не только интенсивность продукции оксида азота, но и эффективность его влияния на клетки-мишени. Целью данного исследования стала оценка состояния внутриклеточной сигнальной системы eNOS-Пpoтeинкинaзa G в динамике заживления язвенного дефекта тела желудка
Актуальн проблеми сучасно! медицини
после кровотечения.
Материал и методы.
Обследовано 57 пациентов в возрасте от 41 до 78 лет с кровотечением из хронических язвенных дефектов желудка. Длительность заболевания в среднем составила 11 ±3,5 года до выполнения эндоскопических манипуляций, через 6 и 12 ч, 1, 3 и 7 суток после эндоскопического инъекционного гемостаза (1% раствор адреналина). Из биоптатов СОЖ маргинальной зоны изучали при окраске гематоксилином и эозином для анализа динамики заживления. Для оценки состояния внутриклеточной сигнальной системы eNOS-Протеинкиназа G использовали тест in vitro с индуцированной агрегацией тромбоцитов (AT). Выбор в качестве объекта исследования тромбоцитов мотивирован широким спектром рецепторов и высоким уровень экспрессии eNOS, аналогичным таковому в эндо-телиальных клетках [2]. В качестве индуктора агрегации использовали АДФ. В пробирки c суспензией тромбоцитов вводили 0,5-8 мкМ АДФ, регистрируя изменение AT спектрофотометри-ческим методом [1]. При этом воспроизводили кривую «доза-ответ» и рассчитывали эффективную концентрацию, вызывающую 50% агрегацию тромбоцитов. Для оценки функционирования внутриклеточной системы eNOs-Протеинкиназа G использовали комбинацию АДФ со стимулятором или ингибитором в следующих концентрациях: трифтазин (ТФЗ, ингибитор системы Са2+-кальмодулин) - 2 мкМ, L-аргинин (субстрат, стимулирующий активность eNOS) - 200 мкМ; L-NAME (ингибитор eNOS) - 1 мкМ, ODQ (1И-[1,2,4]оксадиазоло[4,3-а]квиноксалин-1 (ингибитор ГЦ) - 10мкМ, а также теофиллин - (ингибитор фосфодиэстераз) -5 мкМ [4, 21]. При этом эффект L-NAME отражал реальную активность eNOS, тогда изменение AT при добавлении L-аргинина отражало резервной мощности фермента. Пробы инкубировали при
20°С в течение 8-9 мин, перемешивая со скоростью 1000 об/мин. Определяли степень изменения AT в каждой пробе, выражая ее в процентах относительно АДФ-индуцированной AT [1]. В работе использованы реактивы фирмы «Sigma». В качестве контроля использовали 10 здоровых добровольцев аналогичного возраста. Полученные результаты обрабатывали статистически.
Результаты исследования их обсуждение.
У здоровых людей стимуляция и ингибирова-ние eNOS при добавлении L-аргинина и L-NAME вызывали сходные по амплитуде, но разнонаправленные эффекты: AT соответственно уменьшалась на 17,8±0,5% или возрастала на 16,7±0,6% (р<0,05). Ведущим механизмом стимуляции фермента был Са2+-кальмодулин зависимый путь, поскольку ТФЗ изменял AT на 15,2% (p<0,05). Ингибирование активности ГЦ сопровождалось повышением индуцированной
АТ на 21,3±0,8% (р<0,01), тогда как модулирующий эффект теофиллина достигал 13,2+0,45% (р<0,05). Совместное введение
АДФ+Теофиллина+Ь-аргинина позволяло оценить максимальную мощность работы системы еМОБ-Протеинкиназа С. Стимуляция еМОБ и ингибирование эффекта ТФ привели к снижению АДФ-индуцированной АТ на 22,5+2,5% (р<0,01).
На момент поступления в стационар у больных с язвенным кровотечением выявлено снижение реальной активности и резервной мощности еМОБ. Об этом свидетельствовало снижение эффектов Ь-МАМБ и Ь-аргинина практически в 2 раза по отношению к показателям у здоровых людей (р<0,001). Это было связано со снижением эффективности Са2+-зависимого механизма стимуляции фермента, поскольку амплитуда изменения АТ при добавлении в суспензию ТФЗ составила лишь 6,7+0,2%, что оказалось в 2,3 раза ниже контрольного показателя (р<0,001). Судя по эффекту ингибиторов ГЦ и ФДЭ (оказавшихся соответственно в 1,9 раза (р<0,01) ниже и на 21,2% выше контроля; р<0,05) внутриклеточные системы сигнализации в этот период характеризовались снижением внутриклеточного пула цГМФ и активности конечного звена МО-зависимого пути - Протеин-киназы С. Причем высокая корреляция между активностью еМОБ и ГЦ может свидетельствовать о параллельном снижении продукции про-стагландинов, являющихся как и МО, мощными цитопротекторами.
Через 6 часов после инъекционного гемостаза отмечено дополнительное снижение реальной и резервной активности еМОБ: эффекты Ь-аргинина и Ь-МАМБ оказались на 27,59% и 10,75% ниже, чем до манипуляций. Учитывая, что эффект адреналина реализуется через альфа-адренорецепторы, активация которых сопровождается стимуляцией ФлС и повышением внутриклеточного Са2+, являющегося физиологическим стимулятором еМОБ, логично было бы ожидать повышения активности фермента [3]. Однако в реальности имела место обратная ситуация, что может быть обусловлено усилением оксидативного стресса и диссоциации молекул ферментов. Интересно, что при этом отмечено повышение активности ГЦ (на 18,4%), вероятно, отражающее активацию ЦОГ. Параллельно возрастала активность ФДЭ (на 9,8% по отношению к данным до проведения гемостаза), ограничивающих повышение внутриклеточного пула циклических нуклеотидов. Сходная ситуация отмечалась и через 12 часов после остановки кровотечения. Через 1 сутки ситуация существенно менялась. Это было связано в первую очередь с появлением тенденции к восстановлению активности еМОБ за счет Са2+-зависимого механизма. Если через 6-12 ч эффект ТФЗ составлял лишь 6,4-6,8%, то через 1 сутки он вырос на 63,22%, отражая восстанов-
BÍCHHK Украгнсъког медичног' cm оматолог in ног' академИ'
ление базального уровня внутриклеточного Са2+. Это сопровождалось повышением экспрессии и реальной активности eNOS соответственно на 55,48% и 42,07% по сравнению с предыдущим сроком исследования. Однако данные показатели были на 40,45% и 23,95% ниже контрольных значений. Аналогичным оказался прирост активности ГЦ - на 41,36% по сравнению с предыдущим сроком исследования, хотя активность ФДЭ по-прежнему оставалась высокой (на 31,82% превышая показатель в контроле; р<0,01). Добавление в инкубационную смесь ТФ совместно с Ь-аргинином позволило выяснить реальную ситуацию относительно эффективности действия оксида азота. Де-загрегационный эффект при этом оказался на 49,32% ниже контроля (р<0,01), отражая дефицит не только начального, но и конечного звеньев системы eNOS-Пpoтeинкинaзa G. Следовательно, усиление продукции оксида азота в этот период не сопровождается адекватным ответом клеток-мишеней вследствие ингибирования конечного звена - протеинкиназы G.
Через 3 суток отмечены индивидуальные особенности состояния сигнальной системы eNOS-Протеинкиназа G, характер распределения переменных которой позволил распределить пациентов на две подгруппы. Подгруппу А составили пациенты, у которых было зарегистрировано значимое повышение активности внутриклеточного сигнального пути eNOs-Протеинкиназа G. Эффекты Ь-аргинина и Ь-NAME возросли на 16,04% (р<0,05) и 36,22%, причем последний превысил контрольный показатель (р<0,01). Это во многом было связано с Са2+-зависимой стимуляцией фермента и сопровождалось выраженной активацией ГЦ, активность которой выросла на 11,79% по сравнению с предыдущим сроком и на 20,19% превысила показатель у здоровых людей (р<0,05). Данный факт в сочетании с зафиксированным снижением активности ФДЭ на 20,69% (р<0,05) может свидетельствовать о повышении внутриклеточного уровня цГМФ. При этом совместный эффект ТФ и Ь-аргинина оказался на 38,6% выше контроля (р<0,01), что свидетельствует о стимуляции Протеинкиназы G, лишь частично зависящей от продукции N0, учитывая дезинтеграцию динамики eN0S, ГЦ и П^. Более выраженный подъем активности ГЦ и П^ по сравнению с eN0S и наличие дефицита резервной активности последней, вероятно демонстрируют роль метаболитов арахидоновой кислоты (про-станоидов) в оптимизации внутриклеточного баланса Са2+ и реализации важнейших морфоге-нетических процессов, определяющих репарацию СОЖ [4]. Учитывая, что морфологически данная фаза воспалительно-репаративного процесса соответствует развитию грануляций и
ангиогенеза, а цГМФ играет важную роль в стимуляции пролиферации, зарегистрированные показатели могут использоваться в качестве критериев благоприятного течения репаратив-ной регенерации в СОЖ [3]. В подгруппу Б были включены пациенты, у которых не было отмечено позитивной динамики изученных показателей. У данной категории больных сохранялся дефицит реальной и резервной активности eNOS, низкая активность ГЦ и ПкС при высоких показателях активности ФДЭ. К концу недели после остановки кровотечения отмечено сохранение гетерогенности показателей функционирования внутриклеточной сигнальной системы eNOS-Протеинкиназа G. В подгруппе А ряд эффект ТФЗ существенно вырос и на 8,55% превысил контроль (p<0,05). При этом отмечен выраженный прирост реальной активности eNOS -на 52,76% по сравнению с предыдущим сроком исследования (p<0,01). Данный показатель на 16,17% превысил контрольное значение (P<0,05), отражая усиление продукции оксида азота (P<0,05). При этом сохранялась низкая резервная мощность eNOS: эффект L-аргинина был 28,09% ниже, чем у здоровых индивидуумов (P<0,01). Активность ГЦ оказалась на 20,11% выше контроля (P<0,05). При этом эффект ингибитора ФДЭ, хотя и был ниже показателя в предыдущий срок исследования, но превышал таковой в контроле на 6,84% (р<0,05).
Таким образом, развитие язвенного кровотечения происходит на фоне выраженного угнетения всех звеньев внутриклеточной сигнальной системы eNOS-Протеинкиназа G. Это связано с повышение внутриклеточного уровня Са2+, развитием оксидативного стресса и блоком Са2+-зависимого механизма стимуляции eNOS. Восстановление гомеостаза после остановки кровотечения сопровождалось подъемом активности eNOS и ГЦ через 1 сутки, однако дальнейшая динамика состояния систем eNOS-Протеинкиназа G носила индивидуальные особенности, интерпретация которых требует мор-фо-биохимических сопоставлений.
Литература
1. Баринов Э. Ф. Использование теста агрегации тромбоцитов in vitro для оценки адренореактивности организма // Лабораторная диагностика. - 1999. - № 4. - С. 39-42.
2. Кургалюк H. Н. Оксид азота как фактор адаптационной защиты при гипоксии // Успехи физиол. наук. - 2002. - Т. 33, № 4. - С. 65-79.
3. Белова Е.В., Роль системы "Гормоны-циклазы" в патогенезе эрозивного поражения желудка и двенадцатиперстной кишки // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.- 2004, №5.- С. 23-26.
4. Martin G.R. Gastrointestinal Inflammation: A Central Component of Mucosal Defense and Repair // Exp. Biol. Med.-2006.- Vol. 231.- P. 130-137.
5. Wallace J.L. The cellular and molecular basis of gastric mucosal defense // FASEB J.- 1996.- Vol. 10.- P. 731-740.
Актуальт проблеми сучасно! медицини
Реферат
АКТИВНЮТЬ ВНУТР1ШНЬ0КЛ1ТИНН01 СИГНАЛЬН01 СИСТЕМИ eNOS-nPOTEIHKIHA3A G В ДИНАМ1Ц1 ЗАГОеННЯ ВИРАЗКОВОГО ДЕФЕКТУ ШЛУНКА П1СЛЯ КР0В0ТЕЧ1 Сулаева О.М.
Ключов1 слова: виразковий дефект шлунка, кровотеча, eNOS-протеТнкшаза G
3 метою оцЫки рол1 сигнальноТ системи eNOS-npoTei'HKiHa3a G в динамЩ1 загоення виразки шлунка проведено ¡нпб1торний ана-л1з в TecTi in vitro з ¡ндукованою агрегацию тромбоцитш в 57 пацюнтш з виразковими кровотечами. Показано, що розвиток кро-вотеч1 вщбуваеться на тл1 пригннення ecix ланок внутр1шньокл1тинноТсигнальноТ системи eNOS-npoTei'HKiHa3a G. Це пов'язано з пщвищенням внутр1шньокл1тинного р1вню Са2+, розвитком оксидативного стресу i блоком Са2+-залаженого мехажзму стимуляцп eNOS. Вщновлення гомеостазу пюля зупинки кровотеч1 супроводжувалося пщйомом активност1 eNOS i ГЦ через 1 добу, однак подальша динам1ка стану системи eNOS-npoTeiHKiHa3a G мала ¡ндив1дуальн1 особливост1, ¡нтерпретацт яких потребуе проведения морфо-бюх1мнних сп1вставлень.
Summary
ACTIVITY OF INTRACELLULAR SIGNAL SYSTEM eNOS-PROTEIN KINASE G DURING GASTRIC ULCER HEALING AFTER
BLEEDING
Sulayeva O.N.
Key words: ulcerabive gastric defects, bleeding, eNOS-PROTEIN KINASE G
To estimate the role of intracellular signal system eNOS-Protein kinase G during healing of gastric ulcers the inhibitory analysis with induced platelets aggregation was performed by in vitro test in 57 patients with peptic ulcers bleeding. It was shown that bleeding was associated with inhibition of eNOS-Protein kinase G system. It was due to increase of intracellular Ca + level, oxidative stress and block of Ca2+-dependent mechanisms of eNOS stimulation. Restoration of homeostasis after bleeding was accompanied with activation of eNOS and guanylat cyclase after 1 day, but next dynamic of eNOS-Protein kinase G were individual, and interpretation of these peculiarities need morpho-biochemical relations.
