CC BY
136
УДК 611.451-612.43-615.036.8
ВЛИЯНИЕ ХРОНИЧЕСКОГО СТРЕССА НА СТРУКТУРУ НАДПОЧЕЧНИКА КРЫС ГИПЕРТЕНЗИВНОЙ ЛИНИИ НИСАГ ПОСЛЕ ПРЕВЕНТИВНОГО ЛЕЧЕНИЯ ТЕРАЗОЗИНОМ
Ирина Ивановна БУЗУЕВА1, Елена Евгеньевна ФИЛЮШИНА1, Михаил Давыдович ШМЕРЛИНГ1, Аркадий Львович МАРКЕЛЬ2, Григорий Семенович ЯКОБСОН1
1НИИ физиологии СО РАМН 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4
Институт цитологии и генетики СО РАН
630090, г. Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 10
Исследование проведено на крысах гипертензивной линии НИСАГ. В раннем периоде постнатального онтогенеза (с 20 по 30 дни жизни) животным экспериментальной группы давали per os блокатор а^адренорецепторов теразозин, а крысам контрольной группы — воду. Взрослых животных обеих групп подвергали воздействию иммобилизационного стресса в течение 10 дней. Показано, что у всех изученных животных хронический стресс приводил к повышению артериального давления (АД), но его уровень у экспериментальных крыс, получивших превентивное лечение теразозином, был существенно ниже, чем в группе «плацебо». Выявленные структурные особенности эндокринных клеток коры и мозгового вещества надпочечников у крыс экспериментальной группы, получавших теразозин, по сравнению с клетками крыс группы «плацебо», свидетельствуют о меньшей выраженности проявлений функционального напряжения органа в условиях хронического стресса. На основании полученных данных можно сделать заключение, что введение теразозина в раннем онтогенезе снижает реакцию АД взрослых крыс на хронический стресс и оказывает протекторное действие на надпочечник гипертензивных животных, причем в большей степени на хромаффинные клетки мозгового вещества и в меньшей — на кору.
Ключевые слова: ультраструктура, надпочечник, хронический стресс, крысы линии НИСАГ, артериальная гипертензия, теразозин.
Известно, что в развитии эссенциальной гипертензии большое значение имеет эмоциональный стресс. На модели эссенциальной гипертензии — крысах линии НИСАГ — показано, что стресс-зависимая гипертония у крыс этой линии обусловлена изменениями функций не только гипофизарно-адренокортикальной, но и симпа-тоадреналовой систем [1]. Это находит выражение в увеличении концентрации адреналина в мозговом слое надпочечников и повышении активности основных ферментов его биосинтеза — тирозингидроксилазы, дофамин-р-гидроксилазы и фенилэтаноламин-К-метилтрансферазы [2, 3]. Морфологическое исследование мозгового вещества надпочечника крыс НИСАГ выявило у них структурные изменения, свидетельствующие о повышенной функциональной активности хро-маффинных клеток уже в препубертатном периоде онтогенеза [4]. В этот возрастной период, когда происходит становление систем регуляции гемодинамики, блокада а1-адренорецепторов может оказать модулирующее влияние на уровень чувствительности к стрессу, а значит, и на раз-
витие артериальной гипертензии у крыс линии НИСАГ. В связи с этим целью исследования являлось изучение влияния превентивного лечения теразозином (высокоселективным блокатором а1-адренорецепторов) крысят гипертензивной линии НИСАГ, проведенного в препубертатном периоде онтогенеза, на характер структурных изменений коры и мозгового вещества надпочечника у взрослых крыс после хронического стресса.
Материал и методы
Работу проводили на гипертензивных крысах линии НИСАГ. Эксперименты выполняли с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского Сообщества (86/609/ЕС). Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 № 755).
Для проведения экспериментов крысу на 3 неделе беременности отсаживали в отдельную клетку. Крысята находились в материнской клетке до
Бузуева И.И. — к.б.н., зав. лабораторией электронной микроскопии, e-mail: [email protected] Филюшина Е.Е. — к.б.н., вед.н.с. лаборатории электронной микроскопии, e-mail: [email protected] Шмерлинг М.Д. — д.м.н., проф., гл.н.с. лаборатории электронной микроскопии, e-mail: [email protected]
Маркель А.Л. — д.б.н., проф., зав. лабораторией эволюционной генетики, e-mail: [email protected] Якобсон Г.С. — академик РАМН, зав. лабораторией патофизиологии, e-mail: [email protected]
28-дневного возраста. После отсадки от матери крысят разделяли по полу и содержали самцов и самок отдельно до окончания экспериментов. Из крысят-самцов были сформированы 3 группы по 5 животных в каждой. Крысятам группы «тера-зозин» с 20 по 30 дни жизни ежедневно давали per os тонко измельченную взвесь гипотензивного препарата теразозина гидрохлорида («Abbott Laboratories», Великобритания) в 0,25—0,50 мл воды в дозе 2 мг/кг. Крысята группы «плацебо» в те же сроки получали воду в том же объеме, но без препарата. У крыс по достижению ими возраста 2, 3, 4, 5 и 6 месяцев измеряли базальное артериальное давление непрямым методом на хвосте (tail-cuff method). В 6-месячном возрасте животных групп «плацебо» и «теразозин» подвергали действию хронического иммобилизационного стресса — ежедневно помещали в узкие пеналы на 60 минут в течение 10 дней. Через сутки после окончания стрессорного воздействия животных выводили из эксперимента. Для сравнительной оценки изменений структуры надпочечника под влиянием хронического стресса была дополнительно взята группа интактных животных, которые не подвергались ни стрессирующим, ни медикаментозным воздействиям (группа «контроль»).
Для морфологического исследования у каждого животного забирали оба надпочечника. Один из них фиксировали по Теллесницкому, обезвоживали, заливали в парафин и резали целиком на серийные срезы (толщиной 5 мкм). На каждом
15-м серийном срезе надпочечника, окрашенном гематоксилин-эозином, с помощью окулярной сетки (289 точек) при увеличении 2,5 х 16 определяли объемы зон коры и мозгового вещества надпочечника, которые вычисляли исходя из массы органа и коэффициента плотности 1,039 [4]. Второй надпочечник фиксировали в охлажденной до 4 °С смеси 2%-ного параформальдегида и 2,5%-ного глутаральдегида на 0,1М фосфатном буфере, затем в 1%-ном растворе четырехокиси осмия, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (70—100 %) и пропиленоксиде, заключали в эпон-аралдит. На полутонких срезах надпочечников, окрашенных толуидиновым синим, в световом микроскопе («Axiostar plus», Германия) при увеличении 100 х 10 определяли площадь поперечного сечения эндокринных клеток. Ультратонкие срезы надпочечника изучали под электронным микроскопом «Jem-1400» (Япония). При исходном увеличении 15 000 с помощью квадратной тестовой решетки (625 точек) на негативах хромаффинных клеток определяли относительный объем и численную плотность митохондрий, хромаффинных гранул разной плотности, гладкой и шероховатой эндоплазматической сети (ЭПС), гликогена. Для количественной характеристики ультраструктур, участвующих в процессах синтеза и экскреции секреторных гранул, анализировали околоядерные и периферические зоны хромаффинных клеток. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «Statistica 6.0», вычисляя
Таблица 1
Морфометрические параметры надпочечника крыс линии НИСАГ
Показатель Интактные «Плацебо» «Теразозин»
Относительная масса надпочечника (мг/100 г веса) 14,5 + 0,5 1З,2 + 0,62* 1З,5 + 0,12*
Объем (мм3): коры надпочечника клубочковой зоны пучковой зоны сетчатой зоны 17,7 + 0,90 3.0 + 0,10 13.0 + 0,86 1,6 + 0,27 19.2 + 0,99* З,1 + 0,24 14.3 + 0,27* 1,7 + 0,20* 20,2 + 0,З0* 3.8 + 0,4З 14,6 + 0,59* 1.8 + 0,24*
мозгового вещества 2,6 + 0,20 1,8 + 0,08* 1,9 + 0,11*
Площадь поперечного сечения эндокринных клеток (мкм2): клубочковой зоны пучковой зоны сетчатой зоны мозгового вещества 131.6 + З,55 15З,9 + З,70 124,2 + 2,8З 185.7 + 4,6З 123.8 + 5,10* 188.8 + 4,40* 89,2 + 2,16* 158,5 + З,8З* 105,З + 2,01# 144.7 + 1,92*# 75,2 + 0,96# 126.8 + 2,82*#
Примечание: здесь и в табл. 2, на рис. 1: * — достоверное (р < 0,05) отличие от соответствующего показателя интактных крыс, # — от показателя крыс группы «плацебо».
Возраст, мес. стресс
Рис. 1. Величины АД у крыс линии НИСАГ, получавших в раннем онтогенезе теразозин или воду (плацебо)
среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего арифметического значения ^), и представляли в виде M ± m. Различия между группами оценивали с помощью критерия Стьюдента, достоверными считались результаты при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Реакция АД на хронический стресс у крыс групп «плацебо» и «теразозин» была различной. У крыс группы «плацебо» через сутки после хронического стресса отчетливо проявлялось повышение АД. Несмотря на то, что базальное АД у этих животных уже находилось на высоком уровне, стрессовое воздействие провоцировало дальнейшее его увеличение до уровня более 200 мм рт. ст. У крыс экспериментальной группы на фоне превентивного введения теразозина хронический стресс также приводил к повышению АД, но, тем не менее, его уровень был существенно ниже ф < 0,05), чем в группе «плацебо» (рис. 1). Подобный эксперимент был проведен Joung с соавторами [5] на крысах линии SHR. По их данным, превентивное лечение антагонистами а1-адренорецепторов
Рис. 2. Скопление гранул липофусцина (стрелка) в адренокортикоците сетчатой зоне коры надпочечника крыс НИСАГ группы «плацебо» в условиях хронического стресса. Увеличение х 15 000
(доксазацином или иохимбином) снижает стресс-реактивность крыс, но существенно не влияет на развитие артериальной гипертензии.
Морфологическое исследование надпочечников показало, что у крыс группы «плацебо» после хронического стрессового воздействия относительная масса органа была меньше, чем у интактных крыс этой линии. Комментируя этот факт, следует отметить, что снижение абсолютной и относительной масс надпочечников при разных видах стресса наблюдали и другие исследователи [6, 7]. Морфометрический анализ выявил разнонаправленные изменения объемных показателей коры и мозгового вещества надпочечников у крыс группы «плацебо»: объем мозгового вещества оказался меньшим, тогда как объем коры, напротив, был увеличен (табл. 1). В коре надпочечников на светооптическом и электронно-микроскопическом уровнях отмечены изменения, имеющие в разных зонах неоднозначный характер. Так, в клубочковой и сетчатой зонах коры надпочечников размеры адренокортикоцитов были уменьшены. Цитоплазма большинства клеток имела повышенную электронную плотность, в ней выявлены скопления гликогена и гранул липофусцина, при этом было снижено содержание гормонпродуцирующих структур (рис. 2). По данным литературы, эти признаки характерны для стадии репаративной регенерации [8]. В то же время в пучковой зоне более половины адренокортикоцитов имели увеличенную площадь поперечного сечения. Электронномикроскопическое исследование выявило в эндокринных клетках этой зоны рост численности стероидогенных ультраструктур, в частности, липидных капель и митохондрий. Совокупность отмеченных изменений указывает на повышение функциональной активности адренокортикоцитов пучковой зоны надпочечника в ответ на хронические стрессорные воздействия.
Рис. 3. Деструкция хромаффинной клетки мозгового вещества надпочечника крыс НИСАГ группы «плацебо» в условиях хронического стресса. Увеличение х 15 000
Наиболее выраженные изменения в надпочечнике у крыс группы «плацебо» выявлены со стороны мозгового вещества. Кроме значительного снижения его объемного показателя (1,8 ± 0,08 мм3 по сравнению с 2,6 ± 0,20 мм3 у интактных животных), обращает на себя внимание тот факт, что среди хромаффинных клеток очень часто наблюдались клетки с выраженными в различной степени признаками внутриклеточного отека и ча-
стичной деструкции (рис. 3). Морфометрический анализ ультраструктуры хромаффинных клеток выявил значительное уменьшение суммарного относительного объема разных типов хромаффинных гранул, особенно в околоядерной зоне (на 43 %), где синтезируется основная часть гормонов. Резко сниженной (на 30 %) оказалась и общая численная плотность хромаффинных гранул (табл. 2). При этом численная плотность осмиофильных гранул
Таблица 2
Морфометрические показатели хромаффинных клеток мозгового вещества надпочечников крыс линии НИСАГ
Показатель Группа крыс Зоны клетки
Периферическая Околоядерная
Относительный объем митохондрий, % Интактные 5,55 і 0,79 9,0З і 1,44
Плацебо, стресс З,69 і 0,99* 8,67 і 2,10
Теразозин, стресс 4,76 і 1,2З 11,1З і 1,55
Численная плотность митохондрий Интактные З і 0,4 5 і 1
Плацебо, стресс 2 і 0,6 З і 0,7
Теразозин, стресс 2 і 0,4 4 і 0,5
Численная плотность хромаффинных гранул (суммарная) Интактные 97 і 5 60 і 5
Плацебо, стресс 67 і 7* 4З і 6*
Теразозин, стресс 78 і 6* 45 і 5*
Численная плотность осмиофильных гранул Интактные 77 і 4 46 і 4
Плацебо, стресс 44 і 5* З1 і 6*
Теразозин, стресс 45 і 5* 26 і 4*
Численная плотность гетерогенных гранул Интактные 12 і 2 7 і 1
Плацебо, стресс 20 і З* 9 і 1*
Теразозин, стресс З0 і З* 15 і 2*
Численная плотность опустошенных гранул Интактные 7 і 1 7 і 1,5
Плацебо, стресс З і 1 З і 0,5
Теразозин, стресс 4 і 0,6 З і 0,4
Относительный объем хромаффинных гранул, % Интактные 27 і 1 15 і 2
Плацебо, стресс 20 і З* 9 і 2*
Теразозин, стресс 26 і 2 12 і 2
Относительный объем гладкой ЭПС, % Интактные 1,2 і 0, 2,5 і 0,49
Плацебо, стресс 0,5 і 0,04* 1,0 і 0,11*
Теразозин, стресс 1,З і 0,40 2,1 і 0,ЗЗ
Относительный объем шероховатой ЭПС, % Интактные 1,З і 0,17 1,9 і 0,З7
Плацебо, стресс 1,6 і 0,19 2,9 і 0,З0*
Теразозин, стресс 1,7 і 0,20 2,5 і 0,24*
Численная плотность гликогена Интактные 287 і 18 З06 і З5
Плацебо, стресс 199 і 27* 109 і 26*
Теразозин, стресс 108 і 18* 1З0 і 15*
уменьшилась на 5 б %. Эти изменения связаны, очевидно, с повышенным экзоцитозом гормонов. В то же время следует отметить, что численная плотность гетерогенных гранул, наоборот, увеличена, что может указывать на несоответствие скорости накопления секрета в гранулах и экскреции гормона при хроническом стрессе. Созревание хромаффинных гранул, по данным Kajihara с соавторами [9], происходит в каналах гладкой ЭПС и комплекса Гольджи. Относительный объем этих структур, а также митохондрий в хромаффиноци-тах крыс группы «плацебо» оказался сниженным (p < 0,05). В то же время отмечено повышение относительного объема шероховатой ЭПС. Разно-направленность изменений объемных показателей шероховатой и гладкой ЭПС свидетельствует об определенном дисбалансе процессов накопления и выброса гормонов.
Комплекс отмеченных структурных изменений в адренокортикоцитах коры и хромаффинных клетках мозгового вещества надпочечника у крыс группы «плацебо» указывает на то, что этот орган в условиях хронического стрессорного воздействия испытывает значительное функциональное напряжение.
У животных, получивших превентивное лечение теразозином, как и в группе «плацебо», после хронического стресса значение относительной массы надпочечника снижено относительно соответствующего показателя у интактных крыс. Размеры адренокортикоцитов были уменьшены во всех зонах коры надпочечника. Признаки внутриклеточного отека и деструкции адренокортикоци-тов отсутствовали.
Показатели объема мозгового вещества надпочечника и средней площади поперечного сечения хромаффинных клеток были ниже, чем у интакт-ных крыс и животных группы «плацебо». По данным стереоморфометрического анализа хромаф-финных клеток, у животных группы «теразозин» изменения показателей численной плотности разных типов секреторных гранул имели ту же направленность, что и у крыс группы «плацебо». Так, была снижена суммарная численная плотность всех секреторных гранул и, в частности, осмио-фильных и опустошенных гранул, а численность гетерогенных гранул была увеличена. Вместе с тем относительный объем секреторных гранул у экспериментальных животных был выше, чем у крыс группы «плацебо» и практически не отличался от соответствующего показателя у интактных животных. Высокий уровень значений имели показатели структур, отражающих активность процессов синтеза секреторных гранул, — шероховатой ЭПС и гликогена. Что касается митохондриального аппарата и гладкой ЭПС, то их объемные показатели практически не отличались от значений интакт-ного контроля. Особо следует отметить, что мы не наблюдали в хромаффинных клетках у животных
группы «теразозин» признаков внутриклеточного отека либо проявлений деструкции органелл.
Отмеченные структурные особенности эндокринных клеток коры и мозгового вещества надпочечников у крыс экспериментальной группы «теразозин» свидетельствуют о меньшей выраженности проявлений функционального напряжения органа в условиях хронического стресса. На основании полученных данных можно сделать заключение, что теразозин оказывает протекторное действие на надпочечник гипертензивных животных, причем в большей степени на хромаффин-ные клетки мозгового вещества, и в меньшей — на кору.
Заключение
Результаты нашего эксперимента на гипертензивных стресс-чувствительных крысах линии НИСАГ свидетельствуют о том, что превентивное применение теразозина — блокатора aj-рецепторов — в критический период раннего онтогенеза не предотвращает возникновение артериальной гипертензии, но, снижая стрессорную реакцию хромаффинных клеток мозгового вещества надпочечника, может, тем самым, замедлять развитие этой патологии.
Список литературы
1. Маркель А.Л., Калашникова Е.В., Горя-кин С. В. и др. Характеристика функциональной активности симпатоадреналовой системы у гипер-тензивных крыс линии НИСАГ // Бюл. экспер. биол. мед. 2006. 141. (3). 244-246.
Market’A.L., Kalashnikova E.V., Goryakin S.V. et al. Functional activity of the sympathoadrenal system in hypertensive NISAG rats // Bul. exper. biol. med. 2006. 141. (3). 244-246.
2. Маханова Н.А., Маркель А.Л., Якобсон Г.С. и др. Онтогенетическая динамика артериального давления и характеристик ЭКГ у крыс линии НИ-САГ с наследственной артериальной гипертензией // Бюл. СО РАМН. 1997. (1). 102-105.
Mahanova N.A., Market’ A.L., Jakobson G.S. et al. Ontogenetic dynamics of blood pressure and ECG in NISAG rats with genetic arterial hypertension // Bul. SO RAMN. 1997. (1). 102-105.
3. Шорин Ю.П., Маркель А.Л., Селятицкая В.Г. и др. Эндокринно-метаболические отношения у крыс с генетически обусловленной артериальной гипертензией // Бюл. экспер. биол. мед. 1990. 109. (6). 575-576.
Shorin Yu.P., Market’ A.L., Seliatitskaya V.G. et al. Endocrine-metabolic relations in rats with genetic arterial hypertension// Bul. exper. biol. med. 1990. 109. (6). 575-576.
4. Бузуева И.И., Филюшина Е.Е., Шмерлинг М.Д. и др. Возрастные особенности структурной организации мозгового вещества надпочечника у крыс гипертензивной линии НИСАГ // Бюл. экспер. биол. мед. 2006. 142. (12). 604-606.
Buzueva I.I., Filyushina E.E., Shmerling M.D. et al. Age-related structural characteristics of the adrenal medulla in hypertensive NISAG rats // Bul. exper. biol. med. 2006. 142. (12). 651-653.
5. Koko V., Djordjeviw J., Cvijw G. et al. Effect of acute heat stress on rat adrenal glands: a morphological and stereological study // J. Exp. Biol. 2004. 207. 4225-42З0.
6. Колдышева Е.В., Лушникова Е.Л. Ультраструктурная реорганизация коры надпочечников крыс после общего перегревания организма // Бюл. экспер. биол. мед. 2008. 145. (5). 591-596.
Koldysheva E.V., Lushnikova E.L. Ultrastruc-tural reorganization of rat adrenal cortex after whole body hyperthermia // Bul. exper. biol. med. 2008. 145.
(5). 650-655.
7. Kajihara S., Sakamoto T., KachiA. A qualitative and quantitative electron microscopic study of dif-
ferences in adrenomedullary adrenaline cells between golden hamsters and rats, with special reference to the Golgi apparatus // Arch. Histol. Cytol. 2007. 70. (3). 147-161.
8. Богданова Т.И. Количественная оценка уль-траструктурных перестроек в коре надпочечных желез крыс при стрессе после предварительной гипофизэктомии // Цитология и генетика. 1987.
(6). 424-429.
Bogdanova T.I. Quantitative assessment of the rat adrenal cortex ultrastructural reconstruction after the prior hypophysectomy // Tsytologiya i genetica. 1987. (6). 424-429.
9. Young R.L., Jonsson J.R., Mano M.T. et al. Influence of alpha 1- and alpha 2-adrenoceptor antagonist therapy on the development of hypertension in spontaneously hypertensive rats // J. Cardiovasc. Pharmacol. 1993. 21. (5). 786-790.
THE CHRONIC STRESS INFLUENCE ON THE ADRENAL GLANDS STRUCTURE IN HYPERTENSIVE ISIAH RATS AFTER PREVENTIVE TREATMENT WITH TERAZOSIN
Irina Ivanovna BUZUEVA1, Elena Evgenievna FILYUSHINA1, Michail Davydovich SHMERLING1, Arkadii L’vovich MARKEL’2, Grigirii Semenovich JACOBSON1
institute of Physiology SB RAMS 630117, Novosibirsk, Timakov st., 4
2Institute of Cytology and Genetics SB RAS 630090, Novosibirsk, Lavrent’ev av., 10
The research has been carried out on the hypertensive line rats ISIAH. In the early period of postnatal ontogeny (from 20 till 30 days of life) the experimental animal group received blocker of aj-adrereceptors — terazosine, while the rats of control group received «placebo» — water. Adult animals of both groups were subjected to the influence of immobilization stress within j0 days. It has been revealed, that the preventive treatment with terazosine of the experimental group rats after the chronic stress resulted in blood pressure level increase, but its level was much lower, than in group «placebo». The revealed structural features of the cortico-medullar adrenal gland endocrine cells of experimental group «obtained terazosine», in comparison with the rats of group «placebo» testify to the smaller intensity of manifestation of organ functional exertion under conditions of chronic stress. On the basis of the received data we can conclude, that terazosine has protective action on hypertensive rat adrenal gland, and to a greater extent on chromaffine cells of medulla, and to lesser extent — on cortex.
Key words: ultrastructure, adrenal gland, chronic stress, arterial hypertension, ISIAH rat, terazosin.
Buzueva I.I. — candidate of biological sciences, head of the laboratory of electron microscopy, e-mail: [email protected]
Filyushina E.E. — candidate of biological sciences, leading scientific researcher, laboratory of electron microscopy, e-mail: [email protected]
Shmerling M.D. — doctor of medical sciences, professor, chief scientific researcher, laboratory of electron microscopy, e-mail: [email protected]
Markel’ A.L. — doctor of biological sciences, professor, head of the laboratory of evolution genetics, e-mail: [email protected]
Jacobson G.S. — academician of RAMS, head of the laboratory of pathophysiology, e-mail: [email protected]
