CC BY
53
УДК 611.453.018:612.887:615.225.2
ОТСРОЧЕННОЕ ВЛИЯНИЕ ГИПОТЕНЗИВНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА СТРУКТУРНУЮ ПЕРЕСТРОЙКУ СЕРДЦА И ПОЧЕК ГИПЕРТЕНЗИВНЫХ КРЫС ЛИНИИ НИСАГ В УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОГО СТРЕССА
Михаил Давыдович ШМЕРЛИНГ1, Валерий Федорович МАКСИМОВ1,
Елена Евгеньевна ФИЛЮШИНА1, Ирина Марковна КОРОСТЫШЕВСКАЯ1, Ирина Ивановна БУЗУЕВА1, Владислав Александрович ЛАЗАРЕВ1,
Аркадий Львович МАРКЕЛЬ2, Григорий Семенович ЯКОБСОН1
1НИИ физиологии СО РАМН 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4
Институт цитологии и генетики СО РАН
630090, г. Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 10
У крыс линии НИСАГ с наследственной стресс-индуцированной артериальной гипертензией введение в раннем периоде онтогенеза антиангиотензиновых препаратов и а1-адреноблокатора оказывало различное отсроченное влияние на уровень артериального давления в покое и при хроническом стрессе. Фармакологические препараты не предотвращали развитие гипертрофии миокарда и начальных проявлений гломерулосклероза в почке, но модулировали эти процессы. Хронический стресс у взрослых гипертензивных животных на фоне превентивной антигипертензивной терапии не оказывал существенного влияния на структуру миокарда и почек.
Ключевые слова: артериальная гипертензия, антигипертензивные препараты, сердце, почка, стресс, морфометрия, ультраструктура.
Получение стойкого гипотензивного эффекта после превентивной антигипертензивной терапии в раннем возрасте представляется очень важной проблемой с точки зрения профилактики наследственных форм артериальной гипертонии. В эксперименте на гипертензивных крысах линии НИСАГ нами показано, что блокада ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) в течение 2-го месяца жизни эналаприлом или лозартаном приводит к длительному снижению артериального давления (АД), сдерживает развитие патологических изменений в гломерулярном аппарате почек [1, 2], но, в то же время, не предотвращает гипертрофию миокарда [3]. Сходные результаты получены и при применении а1-адреноблокатора теразозина, но в том случае, если его введение сдвинуто на более ранние сроки онтогенеза.
Представляется целесообразным оценить профилактический антигипертензивный эффект применяемых в эксперименте лекарств в условиях хронического стресса. С этой целью изучено структурно-функциональное состояние главных
органов-мишеней гипертонии — миокарда и клубочкового аппарата почек — у крыс линии НИСАГ после хронического стресса на фоне превентивного воздействия гипотензивных препаратов.
Материал и методы
В работе были использованы 4 группы крыс линии НИСАГ по 5 самцов в каждой группе. Крысята экспериментальных групп ежедневно получали фармакологические гипотензивные препараты per os в виде тонко измельченной взвеси в 0,25—0,50 мл воды: 1-я группа — блокатор ангиотензин-превращающего фермента эналаприл малеат («KRKA», Чехия) в дозе 25 мг/кг в период с 28 по 58 день после рождения, 2-я — блокатор ангиотензиновых рецепторов 1 типа лозартан калия («E.I. du Pont de Numours Co.», США) в дозе 10 мг/кг в период с 28 по 58 день после рождения, 3-я — блокатор а1-адренорецепторов теразо-зин гидрохлорид («Abbott Lab.», Великобритания) в дозе 2 мг/кг в период с 20 по 30 день жизни, 4-я (контрольная) группа в период с 28 по 58 день после рождения получала воду («плацебо»).
Шмерлинг М.Д. — д.м.н., проф., гл.н.с. лаборатории электронной микроскопии, e-mail: [email protected]
Максимов В.Ф. — д.м.н., гл.н.с. лаборатории микроциркуляции
Филюшина Е.Е. — к.б.н., вед.н.с. лаборатории электронной микроскопии, e-mail: [email protected] Коростышевская И.М. — к.б.н., вед.н.с. лаборатории микроциркуляции, e-mail: [email protected] Бузуева И.И. — к.б.н., зав. лабораторией электронной микроскопии, e-mail: [email protected] Лазарев В.А. — к.б.н., ст.н.с. лаборатории электронной микроскопии, e-mail: [email protected] Маркель А.Л. — д.б.н., проф., зав. лабораторией эволюционной генетики, e-mail: [email protected] Якобсон Г.С. — академик РАМН, зав. лабораторией патофизиологии, e-mail: [email protected]
В возрасте 6 месяцев всех животных подвергали хроническому стрессу, вызванному 60-минутной ежедневной иммобилизацией в тесной клетке на протяжении 10 дней. Систолическое артериальное давление у всех животных измеряли под легким эфирным рауш-наркозом непрямым методом на хвосте в покое и после хронического стрессирования.
Эксперименты выполняли с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского Сообщества (86/609/ЕС). После окончания экспериментов для забоя крыс применяли гильотинирование под эфирным наркозом согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Для морфологических исследований образцы миокарда левого желудочка и коркового вещества почек фиксировали в смеси 2%-ного параформальдегида и 2,5%-ного глютаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере, дофиксировали в 1%-ной четырехо-киси осмия, обезвоживали и заливали в смесь эпона и аралдита. Полутонкие срезы тканей, окрашенные толуидиновым синим, исследовали в световом микроскопе «Axiostar plus» (Германия). В миокарде при увеличении х 700 измеряли диаметры ядросодержащей части кардиомиоцитов с помощью окулярной линейки с шагом 1,54 мкм и определяли стромально-паренхимные отношения при помощи стандартной квадратной тестовой решетки (289 точек). На полутонких срезах почки при увеличении х 640 определяли объемную плотность капилляров в корковом веществе, диаметр, объемную и численную плотность почечных клубочков. Ультратонкие срезы тканей, контрастированные уранилацетатом и цитратом свинца, изучали под электронным микроскопом «JEM-100SX» (Япония). Ультраструктурный стереоморфометрический анализ кардиомиоцитов и почечных клубочков проводили на негативах, полученных при увеличении х 5000 и х 8000, применяя квадратную тестовую решетку (72 точки) с шагом 8 мкм и линейку с ценой деления 0,2 мкм. В кар-диомиоцитах определяли относительные объемы органоидов, подсчитывали численную плотность митохондрий, измеряли толщину миофибрилл. В почечных клубочках оценивали относительные объемы клеточных и неклеточных компонентов, измеряли ширину базальных мембран и длину контактов подоцитов с базальными мембранами.
Полученные данные обрабатывали в пакете программ «Statistica 6.0». Результаты представлены в виде среднего и ошибки среднего (M ± m). Достоверность различий определяли t-критерием Стью-дента для p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Проведенное исследование показало, что у крыс контрольной группы («плацебо») в 6-месячном возрасте базальное АД было значительно повышено и регистрировалось на уровне 190 ± 8 мм рт. ст. (рис. 1). Хронический стресс у этих животных приводил к повышению АД до 205 ± 5 мм рт. ст. У экспериментальных крыс, получавших в раннем
220
плацебо эналаприл лозартан теразозин □ покой □ хронический стресс
Рис. 1. Показатели АД у 6-месячных крыс линии НИСАГ, получавших в раннем периоде онтогенеза гипотензивные препараты, в покое и после хронического стресса
онтогенезе эналаприл, лозартан или теразозин, базальное давление было достоверно ниже контрольного уровня. Реакция на хронический стресс у крыс разных экспериментальных групп была различной. На фоне превентивного введения лозарта-на и теразозина хронический стресс хотя и приводил к существенному повышению АД, но уровень последнего оставался ниже, чем в контроле. Эналаприл полностью блокировал реакцию АД на хронический стресс. Так или иначе, у всех животных, получавших гипотензивные препараты, АД в условиях стресса было ниже, чем у контрольных.
У всех экспериментальных крыс в сердце имелись описанные ранее изменения, характерные для ги-пертензивного статуса и возраста крыс этой линии, а именно: увеличение относительной массы органа, гипертрофия кардиомиоцитов, кардиосклероз, усиленная васкуляризация миокарда, увеличение объема и толщины миофибрилл в кардиомиоцитах [4]. В ответ на хроническое стрессовое воздействие не было обнаружено морфологических признаков острых аль-теративных структурных изменений ни в одной из групп животных, использованных в работе (рис. 2).
Если проанализировать качественную картину и сравнить морфометрические показатели миокарда левого желудочка в разных группах (таблица), то можно отметить, что у животных, получавших ингибиторы ренин-ангиотензиновой системы, они более благоприятные, чем в группе «плацебо». Так, в группе, получавшей эналаприл, выраженная органная гипертрофия сопровождалась обильной ва-скуляризацией миокарда, при этом для крупных кардиомиоцитов характерна вполне пропорциональная внутриклеточная архитектоника: объемное соотношение митохондрий и миофибрилл приближается к единице. В группе, получавшей лозар-тан, внутриклеточные показатели не отличались от контрольных, но тканевая структура миокарда оказалась благополучней, чем в группе «плацебо»: отмечены минимальные размеры миоцитов и наименьшее присутствие стромы между ними.
Таблица
Морфометрические показатели миокарда левого желудочка сердца и клубочкового аппарата почек у 6-месячных крыс НИСАГ после хронического стресса при коррекции гипертензии разными препаратами (М ± т)
Показатель Плацебо (контроль) Эналаприл Лозартан Теразозин
Сердце
Масса сердца/масса тела, мг/г 2,98 ± 0,090 3,58 ± 0,070* 3,10 ± 0,026 3,14 ± 0,042
Диаметр миоцитов, мкм 22,9 ± 0,37 22,4 ± 0,61 21,2 ± 0,44* 24,3 ± 0,48*
Относительный объем стромы, % 23,5 ± 0,52 23,7 ± 0,78 17,8 ± 0,37* 25,2 ± 0,58
Относительный объем миофибрилл, % 56,1 ± 0,63 51,9 ± 0,40* 53,4 ± 0,64* 59,5 ± 0,53*
Относительный объем митохондрий, % 37,9 ± 0,59 42,6 ± 0,42* 40,8 ± 0,63* 34,0 ± 0,50*
Диаметр миофибрилл, мкм 1,41 ± 0,026 1,03 ± 0,020* 1,46 ± 0,024 1,54 ± 0,033*
Отношение объемной доли митохондрий и объемной доли миофибрилл 0,69 ± 0,018 0,93 ± 0,014* 0,79 ± 0,021* 0,58 ± 0,013
Почка
Численная плотность клубочков (на мм2) 6,14 ± 0,64 6,5 ± 0,80 6,42 ± 0,57 6,26 ± 0,48
Относительный объем клубочков, % 6,39 ± 0,66 6,11 ± 0,79 5,81 ± 0,6 6,60 ± 0,7
Диаметр клубочков (мкм) 112,45 ± 2,62 101,22 ± 2,52* 99,09 ± 4,45* 106,31 ± 2,80
Относительный объем капилляров в корковом веществе, % 6,86 ± 0,54 6,93 ± 0,43 7,06 ± 0,35 7,13 ± 0,67
Относительный объем подоцитов, % 35,39 ± 1,58 28,00 ± 1,26* 26,23 ± 1,05* 25,37 ± 1,25*
Относительный объем эндотелиоцитов, % 13,86 ± 0,99 13,29 ± 1,07 11,33 ± 0,72 14,66 ± 1,19
Относительный объем мезангиума, % 9,76 ± 1,18 8,86 ± 0,92 8,16 ± 0,89 7,96 ± 0,97
Относительный объем базальных мембран, % 13,39 ± 0,48 11,49 ± 0,42* 11,56 ± 0,41* 12,21 ± 0,50*
Ширина базальной мембраны (нм) 297,28 ± 13,89 247,13 ± 9,36* 253,36 ± 10,09* 261,54 ± 11,60*
Длина контакта цитоподий с базальной мембраной (нм) 660,09 ± 62,48 575,41 ± 48,22 543,03 ± 44,69 580 ± 47
Примечание: * — отличие от соответствующего показателя в группе «плацебо» достоверны при р < 0,05.
Иная тенденция обнаружена у животных, получавших теразозин. Диаметр кардиомиоцитов оказался больше и содержание стромы в стенке желудочка выше, чем в группе «плацебо». У крыс этой группы в большей степени, чем у всех остальных изученных животных, выражены признаки кардиосклероза. Внутриклеточная композиция гипертрофированных миоцитов свидетельствует о преимущественном накоплении в саркоплазме сократительных белков в виде очень толстых мио-фибрилл. Относительный объем митохондрий в
клетках меньше, чем в группе «плацебо», и явно не пропорционален объему миофибрилл.
Морфологическое исследование почек показало, что хроническое стрессовое воздействие не приводило к значительным структурным нарушениям. Тем не менее, у всех изученных в этом эксперименте крыс, как в группе «плацебо», так и получавших гипотензивные препараты, влияние хронического стресса проявилось в расширении просвета капилляров в корковом веществе почки. У контрольных животных («плацебо»), кроме того,
отмечены признаки деструктивных изменений клубочкового аппарата, затрагивающие главным образом эпителиальные и эндотелиальные клетки. Важно отметить при этом, что хронический стресс не оказывал существенного влияния на морфометрические характеристики клубочкового аппарата почек, характерные для крыс линии НИСАГ в покое [5]. Почечные клубочки гипертрофированы, просвет их капилляров или резко сужен или, наоборот, расширен, увеличен объем мезангия, утолщены базальные мембраны, в подоцитах отмечены гиперплазия мембранных структур, уплощение ци-топодий и увеличение длины участков соприкосновения их с базальной мембраной (рис. 3). Комплекс этих признаков свидетельствует о нарушении гемоциркуляции в почечных клубочках, о повышенном функциональном напряжении подоцитов и о начальных этапах гломерулосклероза.
У экспериментальных крыс, получавших в пре-пубертатном периоде антигипертензивные препараты (эналаприл, лозартан или теразозин), так же, как и у животных группы «плацебо», после хронического стресса в корковом веществе почек отмечено расширение капиллярного русла. При этом деструктивных изменений со стороны почечных клубочков не обнаружено. Обращало на себя внимание то, что в условиях хронического стресса морфометрические характеристики клубочкового аппарата почек, характерные для каждой экспериментальной группы в покое [1], практически не изменялись, а отмеченная ранее тенденция к их нормализации после превентивного лечения сохранялась. Так, у крыс, получавших эналаприл, лозартан и теразозин, диаметр почечных клубочков был меньше, чем у контрольных крыс этой линии. Меньшими оказались и значения показателей длины контактов отростков подоцитов с базальной мембраной, а также относительного
Рис. 2. Электронограмма гипертрофированного
кардиомиоцита с толстыми пучками миофибрилл без признаков альтеративных изменений.
Левый желудочек сердца крысы линии НИСАГ после хронического стресса на фоне превентивного введения лозартана.
Увеличение х I2 ООО
объема и толщины базальных мембран. Отмеченные структурные изменения почечных клубочков, свидетельствующие о снижении признаков нарушения функции гломерулярного фильтра, рассматривались нами как доказательство нефропро-тективного эффекта превентивного применения гипотензивных препаратов. Полученные нами результаты вполне согласуются с данными других исследований. Так, установлено, что воздействие ингибитора РААС олмесартана в условиях стресса не только предотвращает стресс-реакцию, но и снижает признаки склероза и апоптоза в почечных гломерулах [6]. В другой работе показано, что лозартан оказывает непосредственное антиок-сидантное влияние на почку [7], что, по мнению авторов, лежит в основе благотворного антистрессового эффекта препарата.
Оценивая полученные результаты, мы пришли к заключению о том, что у изученных в эксперименте животных выраженность структурных преобразований миокарда и почек в ответ на хронический стресс не одинакова. Мы не обнаружили существенных различий в структуре миокарда при модификации гипертензии фармакологическими препаратами без стресса [3] и после хронического стресса. Отсутствие у крыс линии НИСАГ выраженного ответа со стороны сердечно-сосудистой системы на стрессовое воздействие в эксперименте, по нашему мнению, может быть обусловлено исчерпанностью механизмов реагирования. У крыс этой линии из-за врожденной повышенной чувствительности к стрессу формирование гипертензии и развитие гипертрофии миокарда в онтогенезе происходит в условиях постоянных внешних раздражителей, воспринимаемых животными как стрессовые воздействия. В нашем эксперименте влияние на гипертрофированный миокард часовой иммобилизации в течение 10 дней оказалось несущественным. Вме-
Рис. 3. Электронограмма почечного клубочка
с начальными проявлениями гломерулосклероза: резко суженые капилляры, утолщенные базальные мембраны, в подоцитах наблюдаются признаки гиперплазии органелл, цитоподии подоцитов уплощены. Почка крысы линии НИСАГ группы «плацебо» после хронического стресса. Увеличение х 20 000
сте с тем показано, что применение гипотензивных препаратов на ранних этапах онтогенеза оказывает модулирующее влияние на развитие гипертрофии миокарда, причем не всегда однонаправленное. Так, ингибиторы РААС эналаприл и лозартан хотя и не предотвращают развитие гипертрофии кардио-миоцитов, но поддерживают более благоприятные структурные параметры миокарда. Теразозин, напротив, усугубляет гипертрофию клеток на фоне тканевого и внутриклеточного дисбаланса.
В отличие от миокарда, в почках крыс, не получавших превентивное лечение (группа «плацебо»), хроническое стрессовое воздействие вызывало заметные деструктивные изменения. В то же время у животных экспериментальных групп, получавших в раннем онтогенезе лозартан, эналаприл или теразозин, после хронического стресса сохранялись практически все морфометрические параметры клубочкового аппарата почек и, в частности, основных функциональных компонентов фильтрационного барьера — эндотелиоцитов, подоцитов и базальных мембран, характерные для каждой из опытных серий. Этот факт дает основание полагать, что в условиях хронического стресса отсроченный нефропро-тективный эффект этих препаратов сохраняется.
Заключение
Полученные нами экспериментальные результаты и литературные данные еще раз показали необходимость учета органной специфики и многих других факторов при оценке гипотензивного эффекта различных фармакологических препаратов. Обнаружено, что превентивное введение блокаторов РААС эналаприла и лозартана крысам гипертензивной линии НИСАГ в раннем возрасте не только имеет отсроченный гипотензивный эффект, но и оказывает кардио- и нефропротек-тивное влияние. Что касается а1-адреноблокатора теразозина, то обнаружены лишь его гипотензивное и нефропротективное действия, на миокард он действовал неблагоприятно. Показано, что в данной схеме эксперимента даже препараты сходного механизма действия по-разному влияют на гипертензивную реакцию в условиях хронического стресса: эналаприл ее блокирует, а лозартан -нет. При этом эналаприл лучше поддерживает внутриклеточную композицию кардиомиоцитов, а лозартан — паренхимо-стромальные отношения в миокарде. В ходе проведенного исследования продемонстрирована более высокая чувствительность к повреждающему действию хронического стресса паренхимы почек по сравнению с миокардом. Возможно, выявленные различия структурной реактивности к хроническому стрессу сердца и почек обусловлены тем обстоятельством, что почка, являясь, как и сердце, органом-мишенью, кроме того, непосредственно участвует в регуляции АД и напрямую связана с формированием и поддержанием гипертензивного статуса.
Список литературы
1. Филюшина Е.Е., Шмерлинг М.Д., Лазарев В.А. и др. Отсроченное влияние гипотензивных препаратов на структурные характеристики клубочкового аппарата почек крыс гипертензивной линии НИСАГ // Бюл. экспер. биол. мед. 2007. 143. (6). 695-699.
Filyushina E.E., Shmerling M.D., Lazarev V.A. et al. Delayed effects of hypotensive drugs on structural characteristics of the renal glomerular system in hypertensive NISAG rats // Byul. exper. biol. med. 2007. 143. (6). 749-752.
2. Якобсон Г. С., Шмерлинг М.Д., Филюшина Е.Е. и др. Морфо-физиологические аспекты эффективности превентивного воздействия гипотензивных средств на артериальное давление и органы-мишени у крыс с отягощенной наследственностью. // Бюл. СО РАМН. 2007. (3). 142-147.
Jakobson G.S., Shmerling M.D, Filyushina E.E. et al. Morpho-physiological aspects of effectiveness of preventive action of antihypertensive drugs on arterial pressure and target organs in the rats with inherited hypertension // Byul. SO RAMN. 2007. (3). 142-147.
3. Коростышевская И.М., Максимов В.Ф., Мар-кель А.Л. и др. Состояние сердечно-сосудистой системы у гипертензивных крыс линии НИСАГ после применения в ювенильном возрасте антигипертен-зивных препаратов // Рос. физиол. журн. 2007. 93. (2). 169-179.
Korostyshevskaya I.M., Maksimov V.F., Market’A.L. et al. Cardiovascular peculiarities in hypertensive rats (HSIAH strain) after antihypertensive drug intervention during juvenile period of life // Ros. fiziol. zhurn. 2007. 93. (2). 169-179.
4. Шмерлинг М.Д., Филюшина Е.Е., Коростышевская И.М. и др. Состояние миокарда у крыс новой гипертензивной линии // Бюл. экспер. биол. мед. 1996. 122. (9). 271-273.
Shmerling M.D., Filyushina E.E., Korostyshevska-ia I.M. et al. The state of myocardium in rats of a new hypertensive strain // Byul. exper. biol. med. 1996. 122. (9). 271-273.
5. Шмерлинг М.Д., Филюшина Е.Е., Лазарев В.А. и др. Ультраструктурные особенности почечных телец у крыс с наследственной индуцированной стрессом артериальной гипертензией // Морфология. 2001. 120. (6). 70-74.
Shmerling M.D., Filyushina E.E., Lazarev V.A. et al. Ultrastructural changes of kidney corpuscles in rats with hereditary stress-induced arterial hypertension // Morfologiya. 2001. 120. (6). 70-74.
6. Zhao W., Chen S., Chen Y et al. Kidney fibrosis in hypertensive rats: role of oxidative stress // Am. J. Nephrol. 2008. 28. (4). 548-554.
7. Polizio A., Pena C. Effects of angiotensin II type receptor blockade on the oxidative stress in spontaneously hypertensive rat tissues // Regul. Pept. 2005. 128. (1). 1-5.
DELAYED EFFECT OF HYPOTENSIVE DRUGS
ON STRUCTURAL REORGANIZATION OF THE HEART AND KIDNEY IN HYPERTENSIVE ISIAH RATS DURING CHRONIC STRESS
Michael Davydovich SHMERLING1, Valerii Fedorovich MAKSIMOV1, Elena Evgenievna FILYUSHINA1, Irina Markovna KOROSTYSHEVSKAYA1, Irina Ivanovna BUZUEVA1, Vladislav Alexandrovich LAZAREV1, Arkadii L’vovich MARKEL’2, Grigorii Semenovich JACOBSON1
IInstitute of Physiology SB RAMS 630II7, Novosibirsk, Timakov st., 4
2Institute of Cytology and Genetics SB RAS 630090, Novosibirsk, Lavrent’ev av., I0
Administration of antiangiotensive drugs and aj-adrenoreceptor blocker during early ontogeny had different delayed effects on blood pressure level at rest and during chronic stress in ISIAH rats with inherited stress-induced arterial hypertension. The drugs did not prevent the development of myocardial hypertrophy and beginning events of glomerular sclerosis in kidney but modulated them. Chronic stress on the background of preventive antihypertensive therapy had little effect on myocardial and renal structure in adult hypertensive rats.
Key words: arterial hypertension, antihypertensive drugs, heart, kidney, stress, rat, morphometry, ultrastructure.
Shmerling M.D. — doctor of medical sciences, professor, chief researcher, laboratory of electron microscopy, e-mail: [email protected]
Maksimov V.F. — doctor of medical sciences, chief researcher, laboratory of microcirculation Filyushina E.E. — candidate of biological sciences, leading researcher, laboratory of electron microscopy, e-mail: [email protected]
Korostyshevskaya I.M. — candidate of biological sciences, leading researcher, laboratory of microcirculation, e-mail: [email protected]
Buzueva I.I. — candidate of biological sciences, head of the laboratory of electron microscopy, e-mail: [email protected]
Lazarev V.A. — candidate of biological sciences, senior researcher, laboratory of electron microscopy, e-mail: [email protected]
Markel’ A.L. — doctor of biological sciences, professor, head of the laboratory of evolution genetics, e-mail: [email protected]
Jacobson G.S. — academician of RAMS, head of the laboratory of pathophysiology, e-mail: [email protected]
