CC BY
49
УДК 581.14:58.04
10.18286/1816-4501-2016-3-42-48
ВЛИЯНИЕ ХЛОРИДА КАДМИЯ (II) НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ, МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРОРОСТКОВ ЩИРИЦЫ ЗАПРОКИНУТОЙ И ЛОФАНТА ТИБЕТСКОГО
Слепцов Игорь Витальевич, аспирант
Журавская Алла Николаевна, доктор биологических наук, профессор ФГБУН Институт биологических проблем криолитозоны СО РАН, 677000, г. Якутск, пр. Ленина, 41; 8 (4112) 33 55 79; e-mail: neroxasg@mail.ru
Ключевые слова: Amaranthus retroflexus, Agastache rugosa, кадмий, стресс, антиокси-данты, ферменты, перекисное окисление липидов
Исследовано влияние хлорида кадмия (II) в концентрациях 5, 10, 20, 40 и 80 мкМ на физиологические, морфологические и биохимические характеристики проростков щирицы запрокинутой (Amaranthus retroflexus L.) и лофанта тибетского (Agastache rugosa (Fisch. & C.A.Mey.)), в течение 30 дней наблюдения. Показано, что наряду с известным механизмом токсического действия ионов кадмия на физиологические характеристики, связанного с модификацией сульфгидрильных групп белков, влияющих на клеточное деление апикальных клеток растений, существенный вклад на физиологическое развитие проростков вносит прооксидантное действие Cd+2 и антиоксидантное - низкомолекулярных антиоксидантов.
Введение
В настоящее время одной из актуальных проблем человечества является проблема загрязнения атмосферы, растений, почв и водных ресурсов тяжелыми металлами. По данным Всемирной организации здравоохранения, среди загрязняющих веществ, оказывающих отрицательное действие на человека, первое место занимают пестициды, второе - тяжелые металлы, среди которых основными считаются Hg, РЬ, Cd, As, Zn, N [1]. Тяжелые металлы поступают в атмосферу более 60% от общего количества в результате антропогенной деятельности человека, а РЬ, Cd, N - до 90-99% [2, 3]. Кадмий является одним из самых распространенных загрязнителей почвы и высокотоксичным металлом [4]. ПДК кадмия составляет 1 мкг/ дм3 воды и 0,5-2,0 мг/кг почвы. Ионы кадмия способны аккумулироваться в корнях растений и в надземных органах, таких как семена и плоды [5, 6]. Далее ионы кадмия поступают в организм человека и животных, вызывая интоксикацию. Аккумуляция Cd в тканях растений приводит к нарушению физиологических и биохимических процессов, к снижению их продуктивности и к гибели [7-9].
Ранее не проводились исследования по изучению влияния CdCl2 на физиологические, морфологические и биохимические характеристики проростков щирицы запрокинутой (Amaranthus retroflexus) и лофанта тибетского (Agastache rugosa).
Цель данной работы изучить влияние различных концентраций хлорида кадмия (II) на физиологические, морфологические и биохимические характеристики проростков щирицы запрокинутой (A. retroflexus) и лофанта тибетского (A. rugosa)
Объекты и методы исследований В качестве тест-объекта использовали семена Amaranthus retroflexus L. и Agastache rugosa (Fisch. & C.A.Mey.).
Amaranthus retroflexus - однолетнее дикорастущее травянистое растение, широко распространенное на территории Центральной Якутии. Agastache rugosa - многолетнее дикорастущее травянистое растение, произрастающее в Восточной Азии. Семена A. retroflexus и A. rugosa были собраны на территории Ботанического сада ИБПК СО РАН (Якутск) в конце августа 2014 года.
Семена A.retroflexus и A. rugosa проращивали на стеклянных шариках диаметром 2-3 мм с ватной подложкой, в прозрачных
и
SEIS es »1
Si
р Ü ш SS Hi н ■ i
00 s!
Таблица 1
Физиологические характеристики проростков АтагапЬЬиэ гвЬгоАвхив при интоксикации хлоридом кадмия (II)
Концентрация CdCl2, мкМ Количество проростков с двумя листами, %
7 день 14 день 17 день 21 день 30 день
0 (контроль) 33,0±1,2 39,0±2,5 39,0±2,5 39,0±2,5 39,0±2,5
5 14,7±1,2 15,3±1,2 15,3±1,2 15,3±1,2 15,3±1,2
10 13,0±1,2 13,3±1,2 13,3±1,2 13,3±1,2 13,3±1,2
20 8,7±1,2 10,7±1,2 10,7±1,2 10,7±1,2 10,7±1,2
40 5,3±1,2 6,0±2,0 6,0±2,0 6,0±2,0 6,0±2,0
80 2,7±1,2 2,7±1,2 2,7±1,2 2,7±1,2 2,7±1,2
пластиковых чашках объемом 250 мл, закрытых стеклянной крышкой. Масса стеклянных шариков составляла 400 граммов для каждой чашки, в которые наносили 100 мл водного раствора CdCl2 в концентрациях 5, 10, 20, 40 и 80 мкМ, в качестве контроля использовали дистиллированную воду. Проращивание проводили в условиях климатической камеры BINDER KMF (Германия) при температуре 25°С с длиной светового дня 16 часов и при относительной влажности 60%. Опыт закладывали в четырех повторностях по 50 семян в каждой чашке для каждой концентрации.
Для оценки физиологических параметров использовали количество проростков с двумя, тремя и четырьмя листами, в качестве морфологических - длину корешка и побега. Определение активности фермента супероксиддисмутазы (СОД) проводили по измерению величины молярного коэффициента экстинкции бисформаза-новых комплексов [10], активности перок-сидазы (ПОК) - по стандартной методике окисления о-дианизидина Н2О2 [11]. Определение суммарного содержания низкомолекулярных антиоксидантов (1НМАО) - по методике, основанной на окрашивании о-фенантролином восстановленного FeCl2 [12]. Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли по методике, основанной на реакции между малоновым диальдегидом (МДА) и тиобарбитуровой кислотой [13]. Коэффициент антиоксидант-ной защиты (Каоз) вычисляли как отношение нормированных к контрольному значению величин 1НМАО к [МДА]:
Каоз = 1НМАО / [МДА]
нормированные L 1 1 ■'нормиро-
При определении физиологических и биохимических параметров статистический разброс определяли с использованием доверительного интервала по критерию Стью-дента [14].
Результаты исследований
Изучены физиологические характеристики проростков A. retroflexus и A. rugosa на 7, 14, 17, 21 и 30-й день при интоксикации CdCl2. Во всем интервале исследуемых концентраций CdCl2 количество проростков A. retroflexus с двумя листами уменьшалось на 60-93% по отношению к контролю (табл.1). Это может быть связано с непосредственным действием CdCl2 на процессы деления клеток, что могло вызывать торможение в развитие проростков [15].
На протяжении всего эксперимента количество проростков A. rugosa с двумя листами при интоксикации CdCl2 в концентрациях 5, 10 и 20 мкМ было выше в 1,1-2,2 раза, относительно контроля (табл.2). На 7-й и 14-й дни эксперимента, при интоксикации CdCl2 в концентрации 40 мкМ, количество проростков с двумя листами было выше на 16-31%, а при 80 мкМ - сохранялось на одном уровне с контролем. Начиная с 17-го дня по 30-й день эксперимента, при интоксикации CdCl2 в концентрации 80 мкМ, количество проростков с двумя листами было ниже на 17%, а при 40 мкМ статистически достоверно не отличалось от контроля. Это указывает на то, что CdCl2 при низких концентрациях способен оказывать стимулирующее действие на развитие второго листа [16], а высокие его
Таблица 2
Физиологические характеристики проростков Agastache rugosa при интоксикации хло-
эидом кадмия (II)
Концентрация CdCl2, мкМ Количество проростков, %
7 день 14 день 17 день 21 день 30 день
Количество проростков с двумя листами, %
0 (контроль) 13,0±1,2 25,0±1,2 28,0±1,2 28,0±1,2 28,0±1,2
5 27,0±1,2 36,0±2,5 48,0±2,5 52,0±2,5 52,0±2,5
10 29,0±2,5 41,0±1,2 44,0±2,5 44,0±2,5 45,0±2,5
20 17,0±1,2 31,0±1,2 32,0±2,5 32,0±2,5 32,0±2,5
40 17,0±1,2 29,0±1,2 29,0±1,2 29,0±1,2 29,0±1,2
80 12,0±2,5 22,0±2,0 23,3±1,2 23,3±1,2 23,3±1,2
Количество проростков с тремя листами, %
0 (контроль) 0,0±0,0 19,0±1,2 22,0±2,5 25,0±1,2 27,0±1,2
5 0,0±0,0 2,7±1,2 16,7±1,2 18,0±2,5 35,0±1,2
10 0,0±0,0 2,0±1,2 13,0±1,2 15,0±1,2 25,3±1,2
20 0,0±0,0 2,0±1,2 9,0±1,2 15,0±1,2 22,0±1,2
40 0,0±0,0 1,0±1,2 7,0±1,2 11,0±1,2 11,0±1,2
80 0,0±0,0 0,7±1,2 3,3±1,2 9,0±1,2 9,0±1,2
Количество проростков с четырьмя листами, %
0 (контроль) 0,0±0,0 15,0±1,2 17,0±1,2 22,0±2,5 27,0±1,2
5 0,0±0,0 0,0±0,0 4,0±1,2 12,0±1,2 21,0±1,2
10 0,0±0,0 0,0±0,0 1,0±1,2 6,0±2,0 17,0±1,2
20 0,0±0,0 0,0±0,0 1,0±1,2 5,0±1,2 11,0±1,2
40 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 1,3±1,2 3,3±1,2
80 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,7±1,2 0,7±1,2
концентрации угнетают процессы деления клеток апекса побега [15].
Образование третьего листа у проростков A. rugosa начиналось на 14-й день эксперимента. В период с 14-го по 21-й день наблюдений во всех вариантах исследуемых концентраций CdCl2 количество проростков с тремя листами было ниже на 28-96%, по сравнению с контролем. На 30-й день в варианте [5 мкМ CdCl2] количество проростков с тремя листами увеличилось на 30%; при 20, 40 и 80 мкМ - уменьшалось на 19-67%; при 10 мкМ - сохранилось на уровне контроля. Таким образом, низкие концентрации CdCl2 способствовали увеличению числа проростков с тремя листами на 30-й день наблюдения, но замедлили процессы развития проростков A. rugosa. Торможение в развитие проростков может быть также связано с замедлением клеточных делений вызванных интоксикацией CdCl2 [17].
и
SEIS es »1
Si
Р О Ш и 'ii ■ i
00 s!
Четвертый лист у проростков A. rugosa образовывался на 14-й день эксперимента. На протяжении всего эксперимента при всех исследуемых вариантах концентраций CdCl2 количество проростков с четырьмя листами было ниже на 22-97% относительно контроля, что могло быть связано с нарушением процессов деления апекса побега CdCl2 [15].
Известно, что при действии тяжелых металлов, в том числе и солей кадмия, происходит ингибирование длины корешка и побега [15, 17, 18, 20]. При интоксикации CdCl2 концентрациями 5, 10, 20, 40 и 80 мкМ уменьшилась длина корешка на 30-й день наблюдения у проростков A. retroflexus и A. rugosa на 92,3-98,2% и 90,6-96,7%, соответственно (табл.3). Длина побега на этот же день у проростков A. retroflexus и A. rugosa снизилась на 71,0-89,2% и 50,0-79,1%, соответственно. Такое действие может быть вызвано тем, что происходило замедление ин-
Таблица 3
Морфологические и биохимические характеристики проростков Amaranthus retroflexus и Agastache rugosa при интоксикации CdCI на 30 день
Концентрация CdCl2, мкМ Длина корешка, мм Длина побега, мм НМАО, мг-экв кверцетина/г 1 ^ сырой массы ПОЛ нмоль/г . сырой массы
Amaranthus retroflexus
0 60,95±7,31 22,70±3,41 0,56±0,02 52,8±6,6
5 4,67±0,33 6,59±0,40 0,46±0,01 114,5±4,0
10 3,00±0,18 4,60±0,37 0,39±0,03 115,5±8,2
20 1,79±0,16 4,00±0,28 0,41±0,04 138,1±5,8
40 1,39±0,07 3,27±0,16 0,26±0,01 158,6±6,7
80 1,08±0,06 2,46±0,25 0,27±0,02 154,2±7,5
Agastache rugosa
0 74,86±8,98 5,52±0,66 3,19±0,02 162,24±7,07
5 7,04±0,49 2,76±0,17 2,51±0,04 243,76±13,61
10 6,12±0,37 2,44±0,20 2,48±0,04 267,55±7,07
20 5,00±0,45 2,13±0,15 1,95±0,08 266,59±3,47
40 3,88±0,19 1,41±0,07 2,01±0,10 300,13±4,87
80 2,50±0,15 1,16±0,12 1,99±0,02 411,29±15,03
тенсивности клеточных делений, связанное со сродством ионов кадмия к сульфгидриль-ным группам белков, которые являются ответственными за прохождение митоза [17].
Также нами были исследованы биохимические показатели в сырой массе проростков A. retroflexus и A. rugosa: концентрация МДА, 1НМАО, активность ферментов СОД, ПОК (см. табл. 3). В клетках проростков A.retroflexus с увеличением концентрации CdCl2 содержание МДА повысилось в 2,23,0 раза, на фоне снижения 1НМАО на 17,651,5%, относительно контроля. Похожая ответная реакция наблюдалась и у проростков A. rugosa - с увеличением концентрации CdCl2 количество МДА повышалось в 1,5-2,6 раз с одновременным снижением суммарного содержания НМАО на 21,3-37,6% (см. табл.3). Таким образом, установлено, что при действии всех изученных концентраций CdCl2 повышается концентрация МДА и уменьшается содержание 1НМАО. Это может быть связано с тем, что ионы Cd+2 усиливают образование свободных радикалов, которые в свою очередь индуцировали процессы перекисного окисления липидов [13]. Вследствие этого происходит уменьшение количества 1НМАО, которые участвовали в инактивации свободных радикалов, а не-
которые из них могли образовать с тяжелыми металлами нерастворимые соединения [21].
Одними из важнейших составляющих антиоксидантной системы являются ферменты: ПОК и СОД. В клетках проростков A. retroflexus с увеличением концентрации CdCl2 происходило увеличение активности ПОК и СОД в 1,7-3,9 и 2,0-11,6 раз, соответственно (рис.1). Для проростков A. rugosa наблюдалась похожая картина - увеличение концентрации CdCl2 способствовало повышению активности ПОК и СОД в 2,2-3,2 и 1,7-4,1 раза, соответственно (рис.2). Таким образом, в проростках A. retroflexus и A. rugosa при действии всех исследуемых концентраций CdCl2 активировались СОД и ПОК. Возможно, это связано с увеличением количества супероксид радикала и перекисей, вызванного интоксикацией хлоридом кадмия (II), которые в свою очередь могли привести к повышению активности СОД и ПОК [18,19]. Следует отметить, что повышение активности СОД и ПОК совершенно не коррелировало с изменением физиологических показателей проростков A. retroflexus и A. rugosa при увеличении концентрации CdCl2 (сравнить рис. 1 и 2 с табл. 1 -3). Можно предположить, что повышение концентра-
Рис. 1 - Активность супероксиддисмутазы и пе-роксидазы в проростках Amaranthus retroflexus при интоксикации CdCl2
характеристиками. Похожая тенденция наблюдалась для проростков A. rugosa (рис.4), где также происходило снижение Каоз на 48-75% с увеличением концентрации CdCl2, на фоне уменьшения физиологических и морфологических характеристик (см.рис. 4). Коэффициент корреляции (r) Каоз к физиологическим и морфологическим характеристикам для всех видов выше 0,88.
r К = 0.97; r
длины корешка и Коаз ' длины по-
б К =0,98; r ,
бега и Коаз ' ' количества проростков с 2 листами и
К =0,99.
Коаз
г К = 0.95; г
длины корешка и Коаз ' длины по-
„ =0,99; г
бега и Коаз ' ' количества проростков с 4 листами и
К =0,88.
Коаз
Рис. 2 - Активность супероксиддисмутазы и пе-роксидазы в проростках Agastache rugosa при интоксикации CdCl2
ций супероксид радикала и перекисей при прооксидантном действии ионов Cd+2 не является основным токсическим фактором по отношению к проросткам A. retroflexus и A. rugosa.
Вычисленный коэффициент антиокси-дантной защиты (Каоз), являющийся показателем вклада 1НМАО в антиоксидантно-прооксидантные процессы, имеет высокие положительные коэффициенты корреляции с физиологическими характеристиками проростков обоих изученных видов (рис. 3 и 4). На рис.3 показано, что Каоз для проростков A.retroflexus снижается на 62-83% при увеличении концентрации CdCl2 синхронно с физиологическими и морфологическими
Выводы
Изучено влияние хлорида кадмия (II) разных концентраций на физиологические характеристики проростков в течение 30-ти дней наблюдения. Установлено, что ионы кадмия оказывают угнетающее действие на развитие второго, третьего и четвертого листа у проростков A.retroflexus и A. rugosa. Показано, что при интоксикации CdCl2 во всем диапазоне исследованных концентраций происходило уменьшение длины корешка и побега у проростков A. retroflexus и A. rugosa. Интоксикация CdCl2 происходила на фоне увеличения концентрации МДА, активности СОД, ПОК и уменьшения суммарного содержания низкомолекулярных антиок-сидантов в клетках проростков A. retroflexus и A. rugosa.
На основе полученных результатов предположено, что наряду с известным механизмом токсического действия ионов кадмия на физиологические и морфологические характеристики, связанного с модификацией сульфгидрильных групп белков, принимающих участие в процессах клеточного деления растущих апикальных клеток растения (корень, проросток) [15, 17], существенный вклад вносит прооксидантное действие Cd+2 и антиоксидантное (в первую
очередь за счет низкомолекулярных антиоксидантов). Высокий уровень 1НМАО даже позволяет проростку при низких концентрациях ионов Cd+2 (5 мкМ) на стадиях «второй, третий лист» повышать их выживаемость. Хотя модификационное действие ионов Cd+2 на сульфгидриль-ные группы белков, принимающих участие в митозе, т.е. на уменьшении таких физиологических характеристик как длина корешка и побега, это не сказывается. Также показано, что активация ПОК и СОД в клетках проростков A. retroflexus и A. rugosa, которая была вызвана увеличением концентраций супероксид радикала и перекисей (водорода и органических), по-видимому, не являются основным токсическим фактором при интоксикации CdCl2, так как эти параметры не коррелировали с изменением физиологических и морфологических характеристик. Выявлено, что два различных вида, такие как Amaranthus retroflexus и Agastache rugosa проявили схожую ответную реакцию на интоксикацию хлоридом кадмия (II).
Работа выполнена в рамках НИР VI.56.1.5. «Физиолого-биохими-ческие механизмы формирования адаптивного потенциала, устойчивости и продуктивности растительных компонентов экосистем Южной и Центральной Якутии» (№ госрегистрации - 01201282194).
Рис. 3 - Нормированные значения физиологических, морфологических и биохимических характеристик проростков Amaranthus retroflexus при интоксикации CdCl2
Рис. 4 - Нормированные значения физиологических, морфологических и биохимических характеристик проростков Agastache rugosa при интоксикации CdCl
Библиографический список
1. Ревич, Б.А. Методические рекомендации по оценке степени загрязнения атмосферного воздуха населенных пунктов металлами по их содержанию в снежном покрове и почве / Б.А. Ревич, Ю.Е. Сает, Р.С. Смирнова.- М.: ИМГРЭ, 1990. - 9 с.
2. Рассеянные элементы в бореальных лесах / В. В.Никонов, Н. В.Лукина, В. С. Без-ель [и др.]; отв. ред. А. С. Исаев. - М.: Наука, 2004. - 616 с.
3. Кулагин, А.А. Древесные растения и биологическая консервация ромышленных загрязнителей / А. А.Кулагин, Ю.А. Шагиева. - М.: Наука, 2005. - 190 с.
4. Серегин, И. В. Фитохелатины и их роль в детоксикации кадмия у высших растений / И. В. Серегин //Успехи биологической химии. - 2001. - Том 41. - С. 283-300.
5. Накопление кадмия и его распределение по органам у растений ячменя разного возраста / Ю. В.Батова, А. Ф.Титов, Н.М. Каз-нина, Г.Ф. Лайдинен // Труды Карельского научного центра РАН. - 2012. - Том 2. - С. 32-37.
6. Dualities in plant tolerance to pollutants and their uptake and translocation to upper plant parts / J. A. C. Verkleij, A. Golan"Goldhirsh, D.M. Antosiewisz [et al.] // Environ. Exp. Bot. - 2009. - Vol. 67. - P. 10-22.
7. Серегин, И. В.Физиологические аспекты токсического действия кадмия и свинца на высшие растения / И. В.Серегин,
B. Б.Иванов // Физиология растений. - 2001.
- Том 48, № 4. - С. 606-630.
8. Устойчивость растений к тяжелым металлам / А. Ф.Титов, В.В. Таланова, Н.М. Казнина, Г.Ф. Лайдинен.- Петрозаводск: Карельский НЦ РАН, 2007. - 170 с.
9. Clemens, S. Toxic metal accumulation, responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants / S. Clemens // Biochimie. -2006. - Vol. 88. - P. 1707-1719.
10. Giannopolitis, C.N. Superoxide Dis-mutases: I. Occurrence in Higher Plants /
C.N.Giannopolitis, S.K. Ries // Plant Physiol. -1977. - Vol. 59, № 2. - P. 309-314.
11. Рогожин, В.В. Методы биохимических исследований: учебное пособие / В.В. Рогожин. - Якутск, 1999. - 93 с.
12. Ермаков, А.И. Методы биохимического исследования растений / А.И. Ермаков. -Л.: Агропромиздат, 1987. - 430 с.
13. Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А.Владимиров, А.И. Арчаков. -М.: Наука, 1972. - 252 с.
14. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин.
- М.: Высшая школа. 1980. - 456 с.
15. Титов, А.Ф. Устойчивость растений к кадмию / А.Ф.Титов, Н.М.Казнина, В.В. Таланова . - Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2012. - 54 c.
16. Hochachka, P. W. Biochemical adaptation / P. W.Hochachka, G. N. Somero. - New Jersey: Princeton University Press, 1984. - 537 p.
17. Титов, А. Ф. Физиологические основы устойчивости растений к тяжелым металлам / А. Ф.Титов, В.В.Таланова, Н.М. Каз-нина. - Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2011. - 77 c.
18. Влияние малых концентраций ионов свинца и кадмия на развитие проростков ромашки лекарственной (Matricaria chamomilla L.) / Э.В.Филиппов, А.А.Шеин, И.А.Прокопьев, Г.В.Филиппова // Наука и образование. - 2014. - №3. - C. 95-99.
19. Chen, L.M. Copper Toxicity in Rice Seedlings: Changes in Antioxidative Enzyme Activities, H2O2 Level, and Cell Wall Peroxidase Activity in Roots / L.M.Chen, C.C.Lin, C.H. Kao // Bot. Bull. Acad. Sinica. - 2000. - V. 41. - P. 99103.
20. Прокопьев, И.А. Влияние техногенного загрязнения пылью, содержащей тяжелые металлы, на семенное потомство лебеды раскидистой / И.А.Прокопьев, Г.В.Филиппова, А.А.Шеин // Физиология растений. - 2012. - Том 59. - С. 238-243.
21. Michalak, A. Phenolic Compounds and Their Antioxidant Activity in Plants Growing under Heavy Metal Stress / A. Michalak // Pol. J. Environ. Stud. - 2006. - V. 15. - P. 523-530.
