CC BY
72
УДК 631.417:581.142
ВЛИЯНИЕ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ ТОРФОВ ТУЛЬСКОЙ ОБЛАСТИ НА РОСТ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЕСТРУКТОРОВ НЕФТИ RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS S67 И RHODOCOCCUS
ER YTHROPOLIS Х5
В.Т. Каримова, Е.Д. Дмитриева, И.А. Нечаева
Проведено биотестирование гуминовых веществ торфов Тульской области на микроорганизмах нефтедеструкторов Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis Х5, отличающихся способностью утилизировать широкий спектр гидрофобных субстратов за счёт наличия ферментных систем и способностью образовывать биологические ПАВ (биосурфактанты). Установлено, что гуминовые вещества не оказывают ингибирующего действия на рост микроорганизмов нефтедеструкторов независимо от их концентрации. Выявлено, что микроорганзимы Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis Х5 способны использовать гуминовые вещества в качестве источников углерода и азота.
Ключевые слова: гуминовые вещества, нефтедеструкторы, детоксицирующие свойства.
Введение
В настоящее время добыча нефти и производство нефтепродуктов играют в нашей жизни огромную роль. Но чем больше масштабы производства, тем выше и масштабы нефтяного загрязнения окружающей среды. Нефть и нефтепродукты признаны приоритетными загрязнителями планеты. В первую очередь процесс добычи нефти отражается на загрязнении почвы. Это приводит к отторжению земель из сельскохозяйственного использования, в связи с чем проблема рекультивации нефтезагряз-ненных почв становится весьма актуальна [1].
Полностью предотвратить загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами невозможно, поскольку объективной необходимостью являются создание и освоение эффективных технологий детоксикации нефтезагрязненных почв и земель. Основой рационального подхода к этому является максимальное использование природных процессов самоочистки в условиях их интенсификации уже проверенными приемами и природосовместимыми веществами. В связи с этим важнейшим элементом успешного решения проблемы детоксикации и восстановления плодородия почв, загрязненных углеводородами нефти и нефтепродуктов, является разработка, освоение и широкое применение новых эффективных технологий, основанных на использовании препаратов, содержащих гуминовые вещества (ГВ) [2].
Увеличение количества ГВ в почве вызывает интенсификацию естественных процессов самоочищения нефтезагрязненных земель. Имея в своем составе гидрофобные и гидрофильные фрагменты структуры, ГВ
хорошо сорбируют нефтепродукты, обеспечивая возможность для дальнейшего их разложения почвенной микрофлорой [2, 3].
В целом, процессы детоксикации нефтезагрязненного грунта близки к процессам компостирования органических отходов и материалов. При этом происходит очистка грунта, улучшаются его свойства и восстанавливаются основные, характерные для почв, биогеохимические процессы [2].
Определяющую роль в процессах самоочищения почв от нефти также играют микроорганизмы. Большинство известных биотехнологических способов очистки основано на использовании чистых и смешанных культур микроорганизмов в сочетании с различными веществами или приемами, стимулирующими их активность. Эти способы зарекомендовали себя как эффективные и наиболее естественные средства охраны природной среды [1].
ГВ являются необходимым звеном в эволюции биосферы, важнейшим фактором устойчивости жизненных процессов. Они выполняют аккумулятивную, транспортную, регуляторную, протекторную и физиологическую функции. Взаимодействуя с живыми организмами, ГВ в малых количествах влияют на рост, подавляя или стимулируя его. Они способны защищать живые клетки от токсического воздействия природных и антропогенных соединений. ГВ не только регулируют процессы питания и развития растений, но и сами могут служить источником питания для микроорганизмов и трансформируются естественными микробными сообществами [4].
В тоже время, существует мнение, что ГВ негативно действуют на функционировании клетки, т.к. нарушают обменные процессы. В связи с этим авторами высказывается гипотеза о коэволюции живых организмов с полимерами нерегулярного строения, при этом для нивелирования негативных (с точки зрения живой клетки) качеств молекул ГВ организмами были выработаны следующие приспособления:
1). химическое строение и пространственная ориентация клеточных стенок позволяет эффективно связывать полимеры нерегулярного строения;
2). клеточные мембраны не пропускают высокомолекулярные полимеры нерегулярного соединения и достаточно устойчивы к природным полимерам-детергентам;
3). гетеротрофное питание осуществляется в результате эндоцитоза. Нерегулярные полимеры могут захватываться либо отдельно - в результате неспецифического эндоцитоза, либо совместно - с биополимерами регулярного строения (белками, нуклеиновыми кислотами и др.) [3].
Однако предполагается, что применение сорбентов на основе ГВ и микроорганизмов нефтедеструкторов для детоксикации и биоремедиации территорий, загрязненных нефтью, позволяет максимально задействовать и использовать все существующие природные механизмы самоочищения.
Внесение препаратов способствует снижению токсичности углеводородов, ускорению процессов их биохимического разложения и восстановлению плодородия почв и растительного покрова на загрязненной территории [2].
Материалы и методы
Гуминовые вещества выделили по методике, описанной ранее в статьях Дмитриевой Е.Д. и др. [5, 13].
Штаммы микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти.
Штаммы бактерий Rhodococcus erythropolis 867 и Rhodococcus erythropolis Х5 входят в состав биопрепарата «МикроБак», который используют для ликвидации последствий нефтяного загрязнения [6]. Данные микроорганизмы способны утилизировать широкий спектр гидрофобных субстратов за счёт наличия ферментных систем и способностью образовывать биологические ПАВ (биосурфактанты).
Питательные среды и условия культивирования.
Микроорганизмы нефтедеструкторы культивировали в полноценной среде Лурия-Бертани [7] и в жидкой минеральной среде Эванса [8]. Готовые среды стерилизовали автоклавированием в течение 30 мин при 120 °С. Инокулирование пробирок проводили суспензией микроорганизмов, выращенной на среде Лурия-Бертани в течение 24 часов. Культивирование микроорганизмов проводили в пробирках на орбитальной качалке (при 26°С, п=180об/мин) в течение 3 суток в присутствии ГВ [9].
Определение роста микробных популяций.
О росте микроорганизмов судили по изменению оптической плотности клеточной суспензии (при 590 нм), которую регистрировали с помощью фотометра «Эксперт-003». Контрольными образцами являлись среда с добавлением концентраций ГВ от 25 до 200 мг/дм3.
Результаты и их обсуждение
В связи с выдвигаемыми гипотезами [3], нами было решено выявить влияние гуминовых веществ торфов на рост микроорганизмов нефтедеструкторов Rhodococcus erythropolis Б67 и Rhodococcus erythropolis Х5.
Согласно литературным данным [10], ГВ вносимые в почвы в присутствии нефтяного загрязнения в диапазоне концентраций от 0,1 до 0,8 г/л обладают стимулирующим эффектом для аборигенной микрофлоры, в диапазоне от 1 до 9 г/дм3 ГВ используют в качестве удобрений, а в диапазоне концентраций от 10-60 г/дм3 в качестве сорбентов.
Ряд авторов [11, 12, 13] описывают стимулирующее действие ГВ на рост микроорганизмов в присутствии различных детергентов в
концентрации 1 мг/л, что соответствует, по мнению Демина В.В. и др., концентрации ГВ, образующей монослой вокруг клетки.
Поэтому биотестирование ГВ с микроорганизмами проводили в диапазоне концентраций 25-200 мг/дм3, что соответствует максимальному содержанию гуминовых веществ в природных водах [13].
На первом этапе работы выявляли диапазон концентраций ГВ, оказывающий ингибирующий эффект на рост микроорганизмов нефтедеструкторов, входящих в запатентованный биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами МикроБак (рис. 1).
И БЕЗ ГВ ИГВ(ЧНТ)
г гв(спт) ■ гв(свт)
5 ГВ(ТНТ)
25
35 50 75
Концентрация ГВ, мг/л
100
Рис. 1. Влияние концентрации ГВ на рост микроорганизмов: а - Rhodococcus erythropolis S67; б - Rhodococcus erythropolis Х5
Эксперимент показал, что ни одна из выбранных концентраций не оказывает ингибирующего действия на рост микроорганизмов. Согласно литературным данным [11], ГВ способны сорбироваться на поверхности
63
клеточн х стенок, но результат экспери ента показали, что это никак не препятствует проникновению питательных веществ через клеточную мембрану.
На втором этапе работы стояла задача выявить, способность микроорганизмы рода Rhodococcus использовать в качестве источника углерода и азота гуминовые вещества торфов.
Микроорганизмы культивировали в жидкой минимальной минеральной среде Эванса в присутствии гуминовых веществ различной концентрации, как единственного источника углевода и энергии (рис. 2).
а)
0,18 0,16
I °'14
н 0,12 о
Ё 0,1 §
Ш 0,08
о о
| 0,06 с 0,04 0,02 0
25
35 50 75
Концентрация ГВ, мг/л
100
200
б)
0,25 -|
0,2 -
л н о О
н
§ 0,15
к -
и о о
0,1
5
£ 0,05
ИБЕЗГВЗд. ■ГВ(ЧНТ) Зд. НГВ(СПТ) Зд. ■ ГВ(СВТ)Зд. НГВ(ТНТ) Зд.
25
35 50 75 100
Концентрация ГВ, мг/л
200
Рис. 2. Диапазон концентраций ГВ влияющий на рост микроорганизмов при культивировании в течение 3 суток: а - Rhodococcus егуШгороШ S67; б - Rhodococcus егу^гороШ Х5
При культивировании в течение 3 суток до концентрации 100 мг/л все ГВ способствовали росту микроорганизмов. На рост микроорганизмов Rhodococcus erythropolis Б67 наилучшим образом повлияли ГВ
черноольхового низинного торфа (ЧНТ) и тростникового низинного торфа (ТНТ) при концентрации 50 мг/дм3. Микроорганизмы [4] способны частично утилизировать молекулу ГВ и, в первую очередь, периферические фрагменты, представленные олигосахаридами и пептидами, тем самым поставляя питательные вещества.
При культивировании микроорганизмов в течение 6 суток в присутствии ГВ, как единственного источника углерода и энергии наблюдаются различия в росте штаммов микроорганизмов нефтедеструкторов (рис. 3).
25
35 50 75
Концентрация ГВ, мг/л
100
Я БЕЗ ГВ бд. ЯГВ(ЧНТ) бд. Ш ГВ(СПТ) бд. ■ ГВ(СВТ) бд. ГВ(ТНТ) бд.
200
б) 0,25
л
Ц °'2
О 0,15
в с
й од и о о
§ 0,05 С
О 0
25
35 50 75 100
Концентрация ГВ, мг/л
200
Ш БЕЗ ГВ бд. ЯГВ(ЧНТ) бд. Ж ГВ(СПТ) бд. ■ ГВ(СВТ) бд. Ш ГВ(ТНТ) бд.
Рис. 3. Выявление концентрации ГВ стшлулируюищй рост микроорганизмов при культивировании в течение 6 суток: а - Rhodococcus егу^гороШ S67; б - Rhodococcus егу^гороШ Х5
Рост микроорганизмов Rhodococcus erythropolis 867 в течение 6 суток сократился примерно на 15 %, по сравнению с культивированием в течение 3 суток, что может быть связано с высокой скоростью потребления
икроорганиз а и в течение перв х 3 суток и дальней ей нехваткой количества ГВ в растворе для полноценного роста микроорганизмов.
На рост микроорганизмов Rhodococcus erythropolis Х5 наилучшим образом повлияли ГВ сфагнового переходного торфа (СПТ) при концентрации 75 мг/дм3.
Изменение оптических характеристик исследуемых образцов под действием микроорганизмов можно объяснить сорбцией ГВ на поверхности клеток, а также высоким потреблением ГВ. За цветность ГВ ответственны сопряженные двойные связи С=С, в том числе и не входящие в ароматические кольца, эти связи могут легко окисляться неспецифическими ферментами микроорганизмов [4].
Христева Л.А. и др. [14] предположили, что физиологические эффекты ГВ обусловлены их влиянием на энергетический метаболизм клетки, заключающийся в активации процессов окислительного и фотосинтетического фосфорилирования и усилении белок синтезирующей системы. Стимулирующее действие физиологически активных ГВ может быть обусловлено активацией процессов синтеза ДНК, РНК и белка, улучшением функционального состояния клеточных органелл и повышением митотической и пролиферативной активности в меристематических тканях. Другие исследователи связывают физиологическую активность ГВ с парамагнитными, электроно-донорно-акцепторными или мембранотропными свойствами этих веществ. Наблюдаемые в результате контакта ГВ с живыми организмами биологические эффекты связаны, с возникающей у клеток возможностью более эффективного использования генерируемой ими энергии, запасаемой в виде АТФ, которая расходуется на регенерацию компонентов клетки, рост и размножение. Если будут сокращены ее затраты, например, на обновление липидов в клеточных мембранах в результате подавление их перекисного окисления (по некоторым оценкам на это расходуется до 30 % энергии), то высвобожденная энергия может быть направлена клеткой на ускорение роста и деления [4, 14].
Было предположено, что в силу химических свойств макромолекул, образующих монослой (способности к комплексообразованию с ионами металлов, гидрофобным взаимодействиям с органическими ксенобиотиками, в том числе и детергентами), этот условный экран может играть роль активного фильтра, связывающего молекулы различных, в том числе и токсичных веществ, присутствующих во внеклеточной жидкости. Соответственно, в зависимости от того, существует ли на поверхности клеток защитный фильтр или нет, реакция клеток на присутствие во внешнем растворе токсикантов будет различаться [2, 9].
Список литературы
1. Станкевич Д. С. Использование углеводородокисляющих бактерий рода Pseudomonas для биоремедиации нефтезагрязненных почв: автореф. дис... канд. биол. наук. М., 2002. 23с.
2. Технология детксикации и рекультивации площадок нефтедобычи, выведенных из промышленного оборота / В.Ф. Мадякин, М.В. Мадякина, И.Г. Ганеев [и др.] // Вестник Казанского технологического университета. 2012. Т. 15. №. 24. С. 118-121.
3. Изосимов А. А. Физико-химические свойства, биологическая активность и детоксицирующая способность гуминовых препаратов, отличающихся генезисом органического сырья: дис....канд. биол. наук. Москва, 2016. 148с.
4. Действие гуминовых кислот на рост бактерий / В.В. Тихонов,
A.В. Якушев, Ю.А. Завгородняя [и др.] // Почвоведение. 2010. № 3. С. 333 - 341.
5. Биологическая активность гуминовых веществ сапропеля реки Упы Тульской области / Е.Д. Дмитриева, К.В. Сюндюкова, Е.В. Акатова [и др.] // Химия растительного сырья. 2016. №. 1. С. 137-144.
6. Патент 2378060 РФ. Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения / А.Е.Филонов [и др.] // Опубл. 10.01.2009. Бюл. №1.
7. Carhart G., Hegeman G. Improved method of selection for mutants of Pseudomonasputida // Appl. Microbiol. 1975. V. 30. Р. 1046-1053.
8. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.B. The continuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a chemostat // MethMicrobiol. 1970. V. 2. P. 277-327.
9. Влияние физиологических особенностей бактерий рода Rhodococcus на деградацию н-гексадекана / И.А. Нечаева, Т.М. Лыонг,
B.Э. Сатина [и др.] // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2016. №. 1. С. 90-98.
10. Салим К. М. Использование гуминовых препаратов для детоксикации и биодеградации нефтяного загрязнения: дис....канд. хим. наук. Москва, 2004. 21с.
11. Демин В.В., Завгородняя Ю.А., Терентьев В.А. Природа биологического действия гуминовых веществ. Часть 1. Основные гипотезы // Доклады по экологическому почвоведению. 2006, Вып. 1. № 1. С. 72-79.
12. Природа биологического действия гуминовых веществ. Часть 2. Локализация биопротекторного действия гуминовых веществ в почвах / Демин В.В., Бирюков М.В., Семенов А.А. [и др.] // Доклады по экологическому почвоведению. 2006. Вып. 1. № 1. С. 80-91.
13. Детоксицирующая способность гуминовых веществ торфов различного происхождения по отношению к ионам тяжелых металлов /
Е.В. Акатова, Е.Д. Дмитриева, К.В. Сюндюкова [и др.] // Химия растительного сырья. 2016. №. 1.С. 119-127.
14. Христева Л.А. Роль гуминовой кислоты в питании высших растений и гуминовые удобрения // Тр. Почв. ин-та им. В.В. Докучаева. 1951. Т. 38. C. 108-184.
Дмитриева Елена Дмитриевна, канд.хим.наук, доц., dmitrieva edarambler.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Каримова Виолетта Тахировна, магистрант, violettal 722aigmail. com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Нечаева Ирина Александровна,канд. биол. наук, доц., nechaeva1902aigmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет
THE EFFECT OF HUMIC SUBSTANCES FROM DIFFERENT ORIGIN PEATS OF THE TULA REGION ON THE GROWTH OF MICROBIAL DEGRADERS OF OIL RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS S67AND RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS X5
V.T. Karimova, E.D. Dmitrieva, I.A. Nechaeva
Biotesting of humic substances from different origin peats of the tula region on microorganisms of oil destructors Rhodococcus erythropolis S67 and Rhodococcus erythropolis X5, characterized by the ability to utilize a wide range of hydrophobic substrates due to the presence of enzyme systems and the ability to produce biological surfactants (biosurfactants). It is established that humic substances don't have inhibitory effect on the growth of microorganisms of oil destructors, regardless of their concentration. It is revealed that the microorganisms Rhodococcus erythropolis S67 and Rhodococcus erythropolis X5 are able to use humic substances as sources of carbon and nitrogen.
Key words: humic substances, oil destructors, detoxifying properties.
Karimova Violetta Tahirovna, master student, violettal 722@gmail. com, Russia, Tula, Tula State University,
Dmitrieva Elena Dmitrievna, candidate of chemical sciences, associate professor, dmitrie va ed arambler. ru, Russia, Tula, Tula State University,
Nechaeva IrinaAleksandrovna, candidate of biological sciences, associate professor, nechae va1902aigmail. com, Russia, Tula, Tula State University
