CC BY
42
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НА УКИ
УДК 631.417:581.142
ВЛИЯНИЕ НЕФТЕПРОДУКТОВ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ КОНДЕНСАЦИИ НА ГУМИНОВЫЙ КОМПЛЕКС СЕРОЙ ЛЕСНОЙ
ПОЧВЫ И РОСТ РАСТЕНИЙ
А.Н. Шкидченко, Л.И. Ахметов, А.А. Андреев
Биодеградацию нефтепродуктов исследовали в модельной почве с внесёнными штаммами-нефтедеструкторами. Содержание углеводородов с увеличением времени экспозиции во всех вариантах снижалось, с максимальной скоростью с дизельным топливом и с минимальной с мазутом. Отмечено снижение содержания углеводородов в почвенных образцах непосредственно после внесения нефтепродуктов (для дизельного топлива - на 25,6 %, нефти - на 16,0 %, содержание мазута не изменялось). Величина фракции ГВ-2 (гуминовые и фульвиновые кислоты) снижалась на 80-90 % при внесении лёгких нефтепродуктов; в процессе ассимиляции нефти и дизельного топлива оставалась на уровне следовых значений. Количество растворимых гуминовых веществ возрастало (rBsum). В модельной почве дизельное топливо в концентрации более 1,2 % ингибировало рост ячменя, при 2% - полностью подавляло рост проростков.
Ключевые слова: серая лесная почва, гуминовый комплекс, углеводороды нефти, микроорганизмы-деструкторы, ячмень
Введение
Нефть и нефтепродукты являются одним из мощных и крупномасштабных загрязнителей окружающей среды. Наибольшую опасность для организмов, включая растения, представляет загрязнение почв, т.к. вредные вещества могут накапливаться в ней в больших количествах вследствие адсорбирующей способности почвы.
Нефть - это смесь нескольких сотен органических соединений различной степени окисленности, причем 35 % приходится на жидкие углеводороды, до 35 % - на слабополимеризованные жидкие углеводороды, а остальное - на высокополимеризованную фракцию углеводородов. Негативное воздействие углеводородов связывают с нарушением водно-воздушного режима почвы [1]. Токсичными свойствами по отношению к почвенной биоте обладает легколетучая фракция нефти. Так, Лапинскене с соавт. [2] путем измерения дыхания почвенных микроорганизмов, а также активности почвенных дегидрогеназ показали, что дизельное топливо имеет токсичные свойства при концентрациях выше 3 % (вес / вес). Загрязненные образцы почвы (40 г дизельного топлива на кг почвы) оказали токсическое действие на прорастание семян, рост проростков, а почвенные водные вытяжки - на выживание дафний [3]. Бензин в концентрации 10 мл/кг почвы снижал урожайность ярового рапса на 73 %, дизельное топливо - на 99 % [4].
В то же время легколетучая фракция нефти обычно полностью ассимилируется микроорганизмами-деструкторами в жидкой среде [5]. Следовательно, ингибирование биоты в почве связано не с токсичностью легкой фракции нефти. Основным резервуаром питательных веществ в почве является ее гуминовый комплекс, представляющий собой высокомолекулярные соединения, молекулы которых содержат хроматические кольца с высокой степенью замещения, азотсодержащие гетероциклы, боковые аминокислотные и углеродные цепи. Известно, что гуматы при контакте с углеводородами нефти способны удерживать определенное их количество даже после их экстракции дихлорметаном [6], что может быть вызвано прочным связыванием легкой фракции углеводородов гуминовыми кислотами.
Целью работы являлось выявление причины ингибирующего воздействия легких фракций углеводородов нефти на почвенную биоту.
Материалы и методы
Объекты исследования. В работе использовали штаммы психротрофных микроорганизмов-нефтедеструкторов из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН, предварительно селекционированные / селектированные в системе проточного трехстадийного культивирования и идентифицированные как Microbacterium liquiefaciens 6, Pseudomonas sp. 22 и Rhodococcus erythropolis 21 [7].
Для модельных почвенных систем использовали серую лесную почву (табл. 1), отобранную в окрестностях г. Пущино (Московская обл.), рН водной вытяжки составила 7,05.
Таблица 1
Физические и химические характеристики ^почвы _
Почва рН Зола, % Cорган., % Nобщ., % ^Робщ., % Ca, % Mg, % Fe, % K, % SiO2, %
Серая лесная 7,05 91,00 2,89 0,25 0,06 0,48 0,14 1,20 2,47 72,5
В почву вносили нефть, мазут и дизельное топливо в строго определенных количествах (1 и 5 % вес./вес.). Нефть и мазут вносили в почву в виде раствора в хлороформе и тщательно гомогенизировали. Хлороформ из почвы удаляли испарением в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение суток с периодическим перемешиванием почвы. Навески подготовленной указанным способом почвы (по 1 кг) помещали в пластиковые емкости слоем 10-12 см. Система была нестерильной, открытой, вносимые углеводороды также не стерилизовали.
Все опыты проводили в трехкратной повторности при 6°С в течение 200 сут с периодическим отбором проб для анализов через 30 сут.
Влажность почвы на протяжении всего опыта поддерживали на уровне 60% полной влагоемкости. Почву инокулировали выращенными в жидкой питательной среде микроорганизмами-нефтедеструкторами. Идентичность культур проверяли по разработанной методике [5].
Количественное определение углеводородов нефти проводили гравиметрическим методом. Для этого 5 г навески почвы заливали 50 мл хлороформа, экстрагировали углеводороды встряхиванием в течение 30 мин и анализировали по описанной методике [8].
Изотопный состав углерода анализировали с помощью масс-спектрометра BREATMATplus («Finnigan MAT GmbH», Германия), имеющего двухканальную систему ввода анализируемых газов и двухколлекторную регистрацию ионных токов. Количество углерода измеряли в исходном субстрате (углеводородах), так и в органическом веществе почвы после экстракции углеводородов. Количественно изотопный состав углерода выражали в относительных единицах 513С% с помощью выражения
где Rs, Rst. - отношения распространенности 13С02, 12С02 в анализируемом образце и международном стандарте PDB, соответственно.
В качестве анализируемого газа использовали С02, полученный при сжигании углеводородов-субстратов, а также полученный при сжигании образцов почвы, из которых данные углеводороды и были ранее экстрагированы.
Определение содержания общего углерода почвенных образцов
проводили методом Тюрина [9]. Определение содержания гумусовых кислот в почвенных образцах осуществляли методом Тюрина в модификации Пономаревой-Плотниковой [10].
Для определения возможной фитотоксичности в почву вносили нефть в концентрации 1, 2 и 3 % и дизельное топливо в концентрации 0,5, 1,2 и 2 % при выращивании ячменя сорта «Звенигородский 321». Семена ячменя высевали в сосуды с почвой (50 шт/сосуд) на равном расстоянии друг от друга на глубину 0,5 см и проращивали при 21-23 0С и круглосуточной освещенности 14000 лк. Полив производили каждые 48 ч, начиная с 3-х суток роста. Энергию прорастания (ЭП) определяли на 3-е и 5-е сут, всхожесть семян - на 14-е сут.
Rst
Результаты и их обсуждение
Титр микроорганизмов-нефтедеструкторов непосредственно после инокуляции нефтезагрязненной почвы составил 108 КОЕ/см3 и численно соответствовал исходному содержанию в этой почве гетеротрофных микроорганизмов. В дальнейшем в ходе эксперимента соотношение интродуцированных нефтедеструкторов и аборигенной гетеротрофной микрофлоры постоянно менялось, несмотря на стабильность внешних условий ^ = 6°С, влажность 60 % от полной влагоемкости) (рис. 1). После 60 сут инкубации численность как интродуцированной, так и аборигенной микрофлоры снижалась, что может служить свидетельством снижения локального содержания легкодоступных источников углерода в неперемешиваемой среде. Некоторое превалирование аборигенной микрофлоры возможно за счет ассимиляции недоокисленных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов-нефтедеструкторов.
6,00Е+08
3 5,00Е+08 а т о
4,00Е+08
Н О
м
3,00Е+08
£ 2,00Е+08
V 1,00Е+08
0,00Е+00
-гетеротрофы
----нефтедеструкторы
50
100
t, сут
150
200
0
Рис. 1. Динамика численности аборигенных гетеротрофов и интродуцированных нефтедеструкторов в модельном почвенном
эксперименте
Содержание углеводородов в почвенных образцах с увеличением времени экспозиции во всех вариантах снижалось (рис. 2). Максимальная скорость ассимиляции наблюдалась в случае дизельного топлива, с несколько меньшей скоростью потреблялись компоненты нефти; минимальная скорость деструкции наблюдалась в варианте почвы, загрязненной мазутом. Полученные данные хорошо коррелируют с опубликованными ранее результатами экспериментов по биодеградации
углеводородов [11, 12]. К 200-м сут. эксперимента ассимиляция углеводородов, внесенных в почвенную систему, замедляется, несмотря на достаточно высокий титр микроорганизмов-нефтедеструкторов.
0 50 100 150 200
Ъ сут
Рис. 2. Динамика концентрации нефтепродуктов в модельном
почвенном эксперименте
При подготовке модельных почвенных экспериментов было отмечено анализируемое снижение содержания углеводородов в почве до инокуляции активных нефтедеструкторов (табл. 2).
Таблица 2
Характеристики образца Количество углеводородов в образце, г/кг почвы
Дизельное топливо Нефть Мазут
Внесено 50 100 % 50 100 % 50 100 %
Определено аналитически после внесения 37,2 74,4% 42,0 84% 50 100%
Потери в результате сорбции почвой 12,8 25,6% 8,0 16% 0 0%
Максимальные «потери» углеводородов наблюдаются для легких фракций (дизельное топливо) и отсутствуют в тяжелых (мазут). По-видимому, легкие фракции углеводородов способны связываться с органическим комплексом почвы и не поддаются экстракции.
Метод масс-спектрометрии в настоящее время является наиболее широко используемым аналитическим подходом при определении распространенности изотопов в природных объектах. Для проверки нашего предположения провели серию модельных экспериментов, загрязняя образцы почвы определенным количеством нефти, мазута и дизельного топлива. Из этих образцов была проведена экстракция углеводородов; экстрагированные углеводороды и почва после экстракции были исследованы масс-спектрометрически (табл. 3).
Таблица 3
Результаты масс-спектрометрического анализа почвы
и нефтепродуктов
№ образца Загрязнитель 513С(%) в образце почвы после экстракции 513С(%) в экстрактах углеводородов
из почвы
1 Нефть, 5 % -27,57 -30,10
2 Нефть, 1 % -27,70 -30,27
3 Мазут, 5 % -27,89 -30,34
4 Мазут, 1 % -27,56 -30,37
5 Дизельное топливо, 5 % -27,59 -30,16
6 Контроль без у/в -27,04 -
Если учесть, что почва до внесения углеводородов имела показатель 513С(%) -27.04, а после экстракции нефтепродуктов (в среднем) -27,6 (табл. 3), то разница как раз соответствует описанным ранее «потерям» нефти при экстракции, составившим 16% от внесенной, а в случае дизельного топлива 25,6 % (табл. 2). Таким образом, полученные данные подтверждают химическое связывание почвой (по-видимому, гуминовым комплексом) легких фракций углеводородов нефти.
В литературе имеются данные, что гуматы, насыщенные сырой нефтью, сохраняли до 23 % внесенной нефти после экстракции дихлорметаном [6].
Одной из функций гуминовых веществ является обеспечения питания микроорганизмов и растений путем изменения окислительно-восстановительных условий в почве и регулирования растворимости минеральных компонентов. Возможно, что максимально негативное
влияние на жизнедеятельность биоты оказывает блокирование отдельных компонентов гуминового комплекса почвы составляющими нефти.
В процессе биоремедиации нефтезагрязнений нами была исследована динамика растворимых фракций гуминовых веществ, выделенных из серой лесной почвы по методу Тюрина в модификации Пономаревой-Плотниковой [10]: ГВ1 - непосредственная щелочная вытяжка гуминовых кислот из почвы, ГВ2 - щелочная вытяжка из декальцинированной серной кислотой почвы; ГВ3 - вытяжка после нагревания образца почвы, использованной для выделения ГВ2, в растворе №ОН в течение 6 ч. Количество гумина (нерастворимые вещества) определяли как разницу между содержанием общего углерода почвы и углерода растворимых фракций гуминовых веществ.
Непосредственно после внесения мазута, нефти и дизельного топлива в почвенные образцы, содержание растворимых фракций гуминовых веществ снижается. В случае мазута величина фракции ГВ1 снижается на 50 %, ГВ2 остается без изменений, ГВ3 снижается на 30%, содержание гумина увеличивается в 4,75 раза. В случае дизельного топлива количество фракции ГВ1 снижается на 30 %, ГВ2 снижается на 80-90 %, ГВ3 - на 40 %, содержание гумина возрастает в 3,5 раза. В случае нефти содержание ГВ1 снижалось на 30%, ГВ2 снижалось на 100 %, ГВЗ снижалось на 30 %, содержание гумина увеличивалось в 4,7 раза.
Полученные экспериментальные данные позволяют предполагать, что легкие фракции углеводородов связываются фракцией ГВ2, как это показано в отношении дизельного топлива и нефти. Содержание нерастворимого гумина, напротив, максимально у мазута и минимально в случае дизельного топлива. Обращает на себя внимание тот факт, что сумма растворимых гуминовых веществ зависит от степени конденсации углеводородов, а именно - чем выше степень конденсации, тем больше количество нерастворимых гуминовых веществ в загрязненном образце.
На рис. 3 представлены данные по динамике гуминовых веществ в почвенных образцах в процессе микробной деградации углеводородов нефти. Все рисунки объединяет одна общая характерная особенность - по мере протекания процесса биодеградации количество растворимых гуминовых веществ в загрязненных нефтепродуктами образцах возрастает. Наблюдаемое явление можно объяснить двумя способами. Вероятно, что микроорганизмы, потребляя углеводороды, химически связывающие растворимые вещества гуминового комплекса, вновь переводят эти вещества в свободную, определяемую форму. Возможен также вариант, что микроорганизмы при потреблении углеводородов нефти выделяют в качестве продуктов своей жизнедеятельности вещества, по свойствам подобные растворимым фракциям гуминовых веществ.
дизельное топливо
^ сут
нефть
1, сут
мазут
1, сут
Рис. 3. Динамика гумусовых веществ в процессе биодеградации
нефтепродуктов
Фракция ГВ2 при ассимиляции углеводородов нефти и дизельного топлива остается на уровне следовых количеств. Количество неэкстрагируемых углеводородов во всех вариантах опыта снижается: в случае мазута - на 20 %, нефти - 30 %, дизельного топлива - 40 %.
Для определения возможной фитотоксичности углеводородов в почву вносили нефть в концентрации 1, 2 и 3 % и дизельное топливо в концентрации 0,5, 1,2 и 2 % при выращивании ячменя сорта «Звенигородский 321» (рис. 4). При концентрации дизельного топлива 2 % растения ячменя не взошли. Высота ростков ячменя снижалась с увеличением концентрации нефтепродуктов, причем в почве с дизельным топливом рост растений был хуже, чем в почве с нефтью, что может объясняться «блокированием» алканами щелочной фракции гуминовых кислот ГВ-2.
га
¡£ 12 и о о.
8
5
5 4
1,0 2,0
С нефти, % (об/вес)
3,0
0,5 1,2 2,0 0 (контр.)
С дизельного топлива, % (об/вес)
Рис. 4. Влияние нефти и дизельного топлива на высоту ростков
ячменя
При анализе извлеченных после опыта невзошедших семян было установлено, что в варианте 2 % дизельного топлива семена проклюнулись, дали зачатки ростков и корней, но дальше не развивались. Визуально структура почвы, влажность были приемлемыми для роста растений: не наблюдали образование корки, семена не были покрыты пленкой нефтепродуктов. Вероятно, остановка роста растений связана не с прямым физическим или химическим действием загрязнителей, а с нарушением (блокировкой) питания прорастающих семян.
Таким образом, снижение плодородия почвы является следствием уменьшения лабильной фракции гумуса в почве, загрязненной нефтепродуктами, и происходит качественное упрощение структуры гумуса. Возможно, именно с этим связана необходимость добавления в почву источников азота и фосфора при внесении в почву микроорганизмов-деструкторов для биоремедиации нефтезагрязнений.
Список литературы
1. Микроорганизмы и охрана почв / Ред. Д.Г. Звягинцев. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1989.
2. Lapinskiene A, Martinkus P, Rebzdaite V. // Environ. Pollut. 2006. V. 142. No3. P. 432-437.
3. Ecotoxicological evaluation of diesel-contaminated soil before and after a bioremediation process / L. Molina-Barahona, L. Vega-Loyo, M. Guerrero [et al]. // Environ. Toxicol. 2005. V. 20. No 1. P. 100-109
4. Wyszkowski M., Ziolkowska A. Role of compost, bentonite and calcium oxide in restricting the effect of soil contamination with petrol and diesel oil on plants. Chemosphere. 2009 V. 74. No 6. P. 860-865. // Chemosphere. 2009. V. 74. No 6. P. 860-865.
5. Мониторинг интродуцированных микроорганизмов-нефте-деструкторов в открытых системах / Е.С. Иванова, Т.З. Есикова, А.Б. Гафаров [и др.] // Биотехнология. 2006. Вып. 3. С. 74-78.
6. Andrus V.E., Nanny M.A., Philp R.P. Humate-enhanced remediation of crude-oil-contaminated surface soils: adsorption studies and microcosm results / Materials of the 225th ACS Nantional meeting, New Orleans, LA, March 23-27 March, 2003.
7. Горизонтальный перенос плазмиды биодеградации нафталина в процессе микробной деструкции дизельного топлива и нефти в открытом проточном биореакторе / Л.И. Ахметов, Е.С. Иванова, И.Ф. Пунтус [и др.] // Биотехнология. 2006. Вып. 4. С. 79-86.
8. Особенности анализа углеводородов в процессах микробной деструкции нефтезагрязнений / А.Н. Шкидченко, В.И. Крупянко, М.У. Аринбасаров [и др.] // Биотехнология. 2007. Вып. 2. С. 40-44.
9. Тюрин И.В. Новое видоизменение объемного метода определения гумуса с помощью хромовой кислоты // Почвоведение. 1931. № 6. С. 36-47.
10. Пономарева В.В., Плотникова Т.А. Гумус и почвообразование. Л.: Изд-во «Наука», 1980. 222 с.
11. Белоусова Н.И., Барышникова Л.М., Шкидченко А.Н. Скрининг психротрофных штаммов и ассоциаций микроорганизмов по способности к деструкции нефти и нефтепродуктов // Прикл. биохим. микробиол. 2002. Т. 38. № 5. С. 513-517.
12. Белоусова Н.И., Шкидченко А.Н. Деструкция нефтепродуктов различной степени конденсации микроорганизмами при пониженных температурах // Прикл. биохим. микробиол. 2004. Т. 40. № 3. С. 312-316.
13. Орлова Е.Е., Бакина Л.Г. Деградация гумуса почв при нефтезагрязнении // Проблемы антропогенного почвообразования. Тез. докл. межд. конф. М., 1997. Т.2 С. 175-176.
Шкидченко Александр Николаевич, канд. биол. наук, стар. науч. сотр., shkidchenkc/agmail. com, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,
Ахметов Ленар Имаметдинович, канд. биол. наук, науч. сотр., akhmetovscienceairambler.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,
Андреев Алексей Алексеевич, канд. биол. наук, старш. науч. сотр., alandreev'amail. ru, Россия, Пущино, Институт биофизики клетки РАН
INFLUENCE OF PETROLEUM PRODUCTS OF DIFFERENT CONDENSATION DEGREE ON HUMIC COMPLEX OF GRA Y FOREST SOIL
AND PLANT GROWTH
A.N. Shkidchenko, L.I. Akhmetov, A.A. Andreev
Biodegradation of different petroleum products (crude oil, black oil, diesel fuel) was investigated in a model experiment with added bacterial degrader strains. With increasing exposure time the hydrocarbons content reduced in all samples, the highest speed being with diesel fuel and the lowest - with black oil. The decrease of oil products content in the soil was detected at once after the hydrocarbons being added; concentration of diesel fuel decreased on 25,6%, the same of crude oil - on 16,0%, the one for black oil did not change. The value of the humic substances fraction 2 (humic and fulvic acids) decreased by 80-90% when adding light hydrocarbons, and remained at the level of trace values during diesel fuel or crude oil oxidation. The content of water soluble humic sunstance (HSsum) increased. In the model soil tests diesel fuel at a concentration of more than 1.2% v/w inhibited the growth of barley, at 2% - completely inhibited the growth of sprouts.
Key words: grey forest soil, humic complex, petroleum hydrocarbons, -degrader bacteria, barley
Shkidchenko Alexander Nikolaevich, candidate of biological sciences, senior research scientist, shkidchenko'gmail. com, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms RAS,
Akhmetov Lenar Imametdinovich, candidate of biological sciences, research scientist, akhmetovscience'rambler.ru, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms RAS,
Andreev Alexey Alexeevich, candidate of biological sciences, senior research scientist, alandreev'mail. ru, Russia, Pushchino, Institute for Cell Biophysics RAS
