CC BY
89
УДК 502.662.2+631.472.74:502.7 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРИ РЕКУЛЬТИВАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ КОНСОРЦИУМА УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ, НАЙДЕННОГО В ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН А.Я. Хидиятуллина, кандидат с.-х. наук ГНУ Татарский НИИАХП Россельхозакадемии
UDC 502.662.2+631.472.74:502.7 USE AT OIL-CONTAMINATED SOIL RESULTIVATION OF HYDROCARBON-OXIDIZING MICROORGANISMS CONSORTIUM FOUND IN VIVO IN THE REPUBLIC OF TATARSTAN
Hidiyatullina A.Ya., Cand. Agr. Sci. Tatar Scientific Research Institute of Agricultural Chemistry and Soil Sciences or Russian Academy of Agricultural Sciences kindness2006@mail.ru
В результате исследований из почв Республики Татарстан выделено 15 консорциумов микроорганизмов-
деструкторов, способных утилизировать углеводороды в концентрациях от 5 до 12 %. Консорциумы А и Б активно развиваются в присутствии дизельного топлива, мазута, вакуумной газоли, гексана, толуола. В условиях вегетационного опыта определена эффективность этих консорциумов на типичном черноземе с яровой пшеницей сорта Экада-66. Максимальное ускорение процесса деградации дизельного топлива в почве и снижение его токсического действия на микробиоту (базальное дыхание, численность углеводородокисляющих микроорганизмов) наблюдается при внесении консорциума Б. Ключевые слова: загрязнение, углеводороды, рекультивация, типичный чернозем, углеводородокисляющие
As a result of studies of the soil in the Republic of Tatarstan are allocated 15 consortia of destructor microorganisms, capable to utilize hydrocarbons at concentrations ranging from 5 to 12%. Consortia A and B are actively developing in the presence of diesel fuel, fuel oil, vacuum Gasol, hexane, toluene. In the context of the growing experience it is defined the effectiveness of these consortia on a typical chernozem with spring wheat varieties Ekada-66. The maximum acceleration of the degradation of diesel fuel in the soil and reducing its toxic effect on the microbiota (basal respiration, the number of hydrocarbon-oxidizing microorganisms) is observed with the introduction of consortium B.
Keywords: pollution, hydrocarbons, recultivation, typical chernozem, hydrocarbon-oxidizing microorganisms.
микроорганизмы.
Введение. Наиболее перспективным методом очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами признан биологический метод, основным преимуществом которого является использование природных углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ). Целью настоящей работы являлось выделение и оценка эффективности аборигенных консорциумов микроорганизмов-деструкторов углеводородов, найденных в естественных условиях Республики Татарстан (РТ).
Материалы и методы. Выделение УОМ осуществляли по модифицированной методике [1, 2]. Количественный учет УОМ проводили на среде Ворошиловой-Диановой [1]. В качестве единственного источника углерода и энергии в среду вносили дизельное топливо (ДТ). Микроорганизмы-деструкторы выделяли из черноземной и серой лесной почв РТ. Почвенную суспензию вносили в среду
Ворошиловой-Диановой с различными концентрациями дизельного топлива - 1, 3, 5, 7, 10, 12%. В качестве контроля использовали контрольную пробу c 5% ДТ без микроорганизмов. В течение 30 сут следили за появлением пленки из микроорганизмов, по степени разложения которой судили об активности УОМ. Через каждые 30 сут проводили пересев на свежеприготовленную среду. Определение спектра утилизируемых углеводородов микроорганизмами-деструкторами (дизельное топливо, мазут, вакуумная газоль, гексан, фенол, толуол) проверяли при помощи метода реплик. Выделение чистых культур УОМ осуществляли по методу Коха на мясо-пептонной среде и поддерживали на косяках с мясо-пептонным агаром (МПА) при комнатной температуре [1]. Видовую идентификацию УОМ осуществляли методами молекулярной биологии: секвенирование фрагмента последовательности гена 16S рРНК и мультисубстратное тестирование с помощью системы GENIII Microplate (BioLog).
Вегетационный опыт по определению эффективности выделенных консорциумов микроорганизмов-деструкторов углеводородов проводили на типичном черноземе с яровой пшеницей сорта Экада-66 в теплице с естественным освещением в летний период в 6-кг сосудах. Почву загрязняли дизельным топливом в концентрации 5%. На основании проведенных экспериментов были использованы активные консорциумы микроорганизмов-деструкторов А и Б (титр 2,51012 КОЕ/см3). Схема опыта: 1) контроль (незагрязненная почва); 2) почва + дизельное топливо (ДТ) (5%); 3) почва + ДТ (5%) + мочевина; 4) почва + Дт (5%) + растения; 5) почва + ДТ (5%) + консорциум А; 6) почва + ДТ (5%) + консорциум Б; 7) почва + ДТ (5%) + мочевина + консорциум А; 8) почва + ДТ (5%) + мочевина + консорциум Б; 9) почва + ДТ (5%) + растения + консорциум А; 10) почва + ДТ (5%) + растения + консорциум Б. В ходе эксперимента, который длился 90 суток, растения поливали деминерализованной водой, поддерживая влажность почвы на уровне 60% предельной полевой влагоемкости. После прореживания в каждом сосуде оставляли по 15 растений. Пробы почв отбирали в динамике на 0, 10, 20, 30, 45, 60, 90 сут.
Определение численности углеводородокисляющих
микроорганизмов проводили по общепринятым методикам на среде Ворошиловой-Диановой [1, 2]. Респираторную активность почвенного микробного сообщества оценивали путем титриметрического определения количества СО2, выделившегося после поглощения щелочью [3]. Определение концентрации углеводородов в почвенных образцах проводили в соответствии с ПНД Ф 16.1:2.2.22-98 «Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в почвах и донных отложениях методом ИК-спектрометрии» [4]. Все параметры измеряли не менее чем в трехкратной повторности, а статистическую обработку результатов осуществляли с помощью электронных таблиц Excel и программы Origin 4.1.
Результаты и обсуждение. Микроорганизмы-деструкторы были выделены из черноземной и серой лесной почв РТ. При определении видового разнообразия на каждой чашке Петри с МПА выросло несколько колоний, что свидетельствует о том, что это ассоциации.
Для выделения активных консорциумов исследовали варианты с концентрациями дизельного топлива 7, 10, 12%. В дальнейшем проверяли способность 15 активных консорциумов расти на среде с различными углеводородами в концентрации 5% (дизельное топливо, мазут, вакуумная газоль, гексан, фенол, толуол). Наибольшую активность по отношению к вышеперечисленным углеводородам проявили два консорциума - А и Б, при культивировании которых количество ДТ уменьшалось на 7-е сутки более чем на 80 и 85% соответственно.
Эффективность этих консорциумов была определена в условиях вегетационного опыта. В качестве показателя оценки состояния среды и интенсивности процесса очищения почвы от углеводородов использовалась численность углеводородокисляющих микроорганизмов, которая в начале эксперимента составила 0,9-10,0*106 КОЕ/см3 почвы. Из-за высокой токсичности созданной среды активный рост этих микроорганизмов в опытных вариантах наблюдали после 45 сут.
В вариантах (консорциум Б, минеральное удобрение + консорциум Б и яровая пшеница + консорциум Б) численность УОМ превышала контроль в 1,4-5,0 раз на протяжении всего опыта. На 60 сут количество УОМ увеличилось на один-два порядка во всех опытных вариантах (с добавлением исследуемых консорциумов и минерального удобрения), в дальнейшем наступала стабилизация их численности. Максимальное количество этих микроорганизмов отмечено в двух вариантах - при внесении консорциума Б (150 *106 КОЕ/см3) и консорциума А совместно с минеральным удобрением (120*106 КОЕ/см3). При внесении только консорциума А численность УОМ увеличивалась до 60 сут (64*106 КОЕ/см3), после чего наблюдалась стабилизация. По-видимому, увеличение количества УОМ в опытных вариантах связано с адаптацией и активным ростом исследуемых консорциумов.
Изменение численности УОМ может свидетельствовать и о значительном ускорении процесса биодеградации ДТ в почве. В вариантах с высоким количеством УОМ отмечено наибольшее снижение углеводородов к 90 сут: при внесении консорциума Б — на 59,0%, при выращивании пшеницы и внесении консорциума Б — на 61,4%, в то время как с консорциумом А эти показатели составили 44,5%, а в варианте растение + консорциум А - 58,3%. Наиболее эффективное уменьшение углеводородов отмечено при совместном использовании консорциума Б с минеральным удобрением - на 73,1%, в то время как при внесении только мочевины - на 54,3%.
Консорциум Б, который способствует наибольшей деструкции углеводородов, состоит из трех штаммов (Pseudomonas stutzeri Р-1026
под регистрационным номером RCAM02107; Achromobacter insolitus А-102 (RCAM02108); Achromobacter xylosoxidans А-10 (RCAM02109)), каждый из которых способен утилизировать ДТ в концентрации до 10%.
Почвенное дыхание, используемое для характеристики деградации органического вещества при биоремедиации, во всех опытных вариантах возрастало в 2,3-6,8 раз по сравнению с контрольной почвой, а при внесении исследуемых консорциумов практически сразу увеличилось вдвое. При этом консорциум Б был эффективнее (в 1,3-1,5 раз). Внесение минерального удобрения как отдельно, так и с консорциумами способствовало росту базального дыхания в 1,8-6,6 раз. Необходимо отметить, что яровая пшеница не оказала существенного влияния на этот показатель. Рост базального дыхания в начале эксперимента, по-видимому, связан с повышением численности микроорганизмов, а последующее же снижение интенсивности - с уменьшением концентрации углеводородов, являющихся энергетическим субстратом для почвенной микрофлоры.
Таким образом, максимальное ускорение процесса деградации дизельного топлива в почве и снижение его токсического действия на микробиоту (базальное дыхание, численность углеводородокисляющих микроорганизмов) отмечено при внесении консорциума Б.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Колешко О.И. Экология микроорганизмов почвы. Лабораторный практикум / О.И. Колешко // Минск: Высшая школа. - 1981. - 175 с.
2. Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в почвах и донных отложения методом ИК-спектрометрии. ПНД Ф 16.1:2.2.22-98. - М., 1998. - 35 с.
3. Методы почвенной микробиологии и биохимии / под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: МГУ. - 1991. -304 с.
4. Microbiological methods for assessing soil quality / ed. By J. Dloem, D.W. Hopkins, A. Benedetti // CABI Publishing. - 2006. - 307 p.
