ВЛИЯНИЕ ГЕРБИЦИДА РАУНДАП IN VITRO НА АКТИВНОСТЬ КАРБОГИДРАЗ МОЛОДИ РЫБ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

5

УДК 597-113: 632.954 + 574.64

Влияние гербицида Payндaп in vitro на активность карбогидраз молоди рыб

Голованова И.Л., Филиппов А.А., Аминов А.И.

Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН. Борок, Ярославская обл.

Исследовано влияние сублетальных концентраций гербицида Раундап 0,1-50,0 мг/л (по глифосату) на активность карбогидраз (амилолитическую активность и активность са-харазы) в слизистой оболочке и содержимом кишечника, а также в целом организме молоди рыб в условиях in vitro (температура 200С, рН 7,4). Установлено, что карбогидразы слизистой оболочки кишечника более чувствительны к токсическому действию Раундапа по сравнению с одноименными ферментами химуса и целого организма. Раундап оказывает больший токсический эффект на активность карбогидраз в тканях реальной жертвы по сравнению с таковыми потенциальной жертвы. Величина и направленность эффектов зависят от концентрации токсиканта, вида рыб и спектра ферментов, участвующих в гидролизе углеводов.

Ключевые слова: гербицид, Раундап, глифосат, молодь рыб, пищеварительные карбогидразы, амилолитическая активность, активность сахаразы

Введение. В настоящее время гербициды применяются не только для уничтожения сорной растительности на посевах сельскохозяйственных культур, но и для борьбы с зарастанием водохранилищ, прудов и каналов. Попадая в воду, а затем в организм гидробионтов, они включаются в метаболизм и могут вызывать нарушения процессов жизнедеятельности и пластического обмена. Payндaп — один из самых известных гербицидов, созданный на основе изопропиламиновой соли глифосата [N-(phosphonomethyl) glycine] - высокотехнологичного системного гербицида широкого спектра действия. В последние годы накоплено большое количество данных о токсичности Payндaпa для водных организмов, в том числе и для рыб [1, 2, 6, 7]. Известно о негативном влиянии Payндaпa на растения и беспозвоночных животных, входящих в состав кормовой базы рыб различных экологических групп [4, 6, 9]. В то же время, влияние гербицида Pay^ían на процессы гидролиза углеводов, играющих важную роль в энергетическом и пластическом обмене, у рыб практически не изучено.

Цель настоящей работы состояла в изучении in vitro влияния гербицида Pay^a^ в сублетальных концентрациях (0,1 —50,0 мг/л) на активность карбогидраз кишечника и целого организма молоди рыб.

Материал и методы исследования. В качестве объектов исследования использована молодь 5 видов рыб, наиболее распространенных в пресных водоемах и служащих объектами питания типичных и факультативных ихтиофагов: тюлька Qupeonella cUltriventris (Nord.) (масса 0,55±0,03 г), щука Esox lucius L. (9,64±0,92 г), плотва Rutilus rutilus (L.) (0,25±0,01 г), карп Cyprinus carpio (L.) (17,00±2,16 г) и окунь Perca fluviatilis L. (0,63±0,05 г). Pbró отлавливали в июле - августе 2009 гг. в прибрежной зоне Pыбинского водохранилища. ^рп выращен на стационаре полевых и экспериментальных работ ИБВВ PAH. Всего исследовано по 50 экз. сеголетков тюльки, плотвы и окуня, и по 12 экз. двухлеток щуки и карпа. После отлова рыб в течение 1-2 ч доставляли в лабораторию (иногда предварительно замораживали и хранили при температуре - 180С не более двух недель).

Для определения ферментативной активности обездвиженных рыб помещали на стекло ледяной бани, изымали кишечник и освобождали его от содержимого (химуса). Слизистую оболочку средней части кишечника снимали пластмассовым скребком и перемешивали. Химус средней части кишечника также тщательно перемешивали. У другой части рыб, которых рассматривали в качестве кормовых объектов, активность ферментов определяли во всем организме. Для этого всю тушку измельчали ножницами, тщательно перемешивали и отбирали аликвоту для приготовления ферментативно-активных препаратов. При помощи стеклянного гомогенизатора готовили суммарные гомогенаты, объединяя навески слизистой оболочки кишечника, химуса или целых тушек от 6-25 экз. каждого вида, с добавлением охлажденного до 2-40С раствора Pингeрa для холоднокровных животных (110 ммоль NaCl, 1.9 ммоль KCl, 1.3 ммоль CaCl2, pH 7.4) в соотношении 1:9. Затем исходный гомогенат дополнительно разводили раствором Pm^a в 2-10 раз. Paстворы субстратов (растворимый крахмал в концентрации 18 г/л и раствор сахарозы в концентрации 50 ммоль/л) готовили на таком же растворе Pингeрa. Инкубацию гомогената и субстрата проводили в течение 30-60 мин при температуре 200С, рH 7.4. Гомогенаты предварительно инкубировали в присутствии растворов Pay^o^a определенной концентрации (в контроль вместо токсиканта добавляли равное количество раствора Pингeрa) в течение 1 часа. ^н^трации Pay^D^a, рассчитанные по содержанию глифосата, составляли 0,1; 1,0; 10,0; 25,0 и 50,0 мг/л.

Для приготовления растворов токсиканта использовали коммерческий препарат гербицида, имеющий торговое название «Payндaп» (произведен и расфасован ЗАО фирма «Август» ^оссня) по лицензии фирмы «Монсанто Европа С. А.» (Бельгия)). Средство представляет собой 36%-ный водный раствор глифосата. Возможные инертные ингредиенты, усиливающие действие активного элемента или облегчающие использование гербицида в аннотации не указаны. Выбор тестируемых концентраций 0,1-50,0 мг/л был обусловлен установленными значениями ПДK для воды рыбохозяйственных водоемов (0,001 мг/л), а также значениями 96 ч LC50 Pay^n^a для рыб (от 86 до 168 мг/л) [7, 8].

Активность карбогидраз: амилолитическую активность (отражающую суммарную активность ферментов (a-амилазы KФ 3.2.1.1, глюкоамилазы KФ 3.2.1.3 и мальтазы KФ 3.2.1.20), ги-дролизующих крахмал, а также активность сахаразы KФ 3.2.1.48, гидролизующей сахарозу, оценивали по приросту гексоз модифицированным методом ^льсона [5]. Активность ферментов в суммарных пробах гомогената определяли в 5 повторностях и выражали в микромолях продуктов реакции, образующихся за 1 мин инкубации в расчете на 1 г влажной массы ткани (мкмоль/г мин). Peзyльтaты представлены в виде средних и их ошибок (Mim). Достоверность различий оценивали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA, LSD тест), р < 0,05.

Результаты и обсуждение. Payндaп в диапазоне исследованных концентраций достоверно снижает амилолитическую активность слизистой оболочки кишечника исследованных видов рыб на 11-28% от контроля, в большей степени у карпа, в меньшей у окуня (табл. 1). Активность сахаразы в слизистой оболочке кишечника плотвы достоверно повышается на 43-62% в диапазоне концентраций Payндaпa 10-50 мг/л, у окуня - на 37-92% в более широком диапазоне концентраций (1-50 мг/л). У тюльки и карпа достоверные эффекты отсутствуют. Paзнонaпрaв-ленные эффекты Payндaпa на активность ферментов, гидролизующих полисахарид крахмал и дисахарид сахарозу, по всей вероятности, обусловлены большим влиянием гербицида на активность панкреатической a-амилазы по сравнению с мембранными ферментами (глюкоа-милаза, мальтаза и сахараза).

Активность карбогидраз химуса в присутствии Payндaпa изменяется лишь у карпа: ами-лолитическая активность снижается на 14-26% (величина тормозящего эффекта возрастает по мере увеличения концентрации гербицида), в то время как активность сахаразы возрастает на 12-17% от контроля в присутствии Payндaпa в концентрации 10-50 мг (табл. 2). У других

исследованных видов рыб достоверные эффекты отсутствуют, что хорошо согласуется с данными об устойчивости ферментов в тканях рачкового зоопланктона, которым питается молодь большинства видов рыб, к токсическому действию Раундапа [1]. Необходимо отметить, что активность карбогидраз в слизистой оболочке кишечника обусловлена преимущественно мембранными ферментами (мальтаза, сахараза) и частично адсорбированной из полости кишечника панкреатической а-амилазой. Активность карбогидраз химуса отражает активность ферментов, синтезируемых поджелудочной железой рыб и энтеральной микробиотой, а также ферментов, привносимых тканями жертвы. Активность ферментов целого организма отражает не только активность ферментов пищеварительного тракта, но и многочисленных лизосомаль-ных гидролаз всех органов и тканей.

При действии Раундапа на амилолитическую активность в целом организме молоди рыб достоверное повышение ферментативной активности отмечено лишь у плотвы (на 19-26%) и щуки (на 37-46% от контроля) при более высоких концентрациях гербицида 10-50 мг/л (табл. 3). Активность сахаразы достоверно повышается на 39-45% от контроля лишь у плотвы при концентрациях Раундапа 25 и 50 мг/л.

Поскольку роль гидролаз жертвы особенно велика на начальных этапах желудочного пищеварения, изучали действие Раундапа на активность карбогидраз реальной жертвы (плотва на начальной стадии пищеварения: покровы тела и плавники целы или частично разрушены), извлеченной из желудка щуки. Уровень амилолитической активности в тканях реальной жертвы составил 8,27±0,12, активность сахаразы - 0,77±0,05 мкмоль/г^мин. При действии Раундапа отмечен четкий концентрационно-зависимый ингибирующий эффект: амилолитическая активность снижается на 17-32%, активность сахаразы - на 59-69% от контроля по мере увеличения концентрации токсиканта. Лишь при самой низкой концентрации гербицида 0.1 мг/л отмечено достоверное повышение активности сахаразы на 64% от контроля. Противоположная направленность эффектов Раундапа на ферменты потенциальной и реальной жертвы обусловлена разной активностью карбогидраз при различных значениях рН (нейтральными в первом случае и кислыми во втором) и свидетельствует о возможности большего токсического влияния гербицида на гидролиз углеводов в условиях желудочного пищеварения.

Ранее установлены изменения биохимических показателей в печени карпа, свидетельствующие об увеличении роли белков в метаболизме при хроническом действии Раундапа в концентрации 0,004 мг/л (2 ПДК) [2]. Увеличение роли белков в метаболизме при действии Раундапа было продемонстрировано и в 15 суточных тестах на 4-х поколениях Daphnia magna [4]. Растворы гербицида в сублетальных концентрациях 25 и 50 мг/л (по глифосату) повышали протеолитическую и снижали амилолитическую активность гидролаз, расщепляющих белковые и углеводные компоненты в тканях рачков.

В нашей работе впервые исследованы изменения активности карбогидраз в слизистой оболочке и содержимом кишечника, а также в тканях молоди рыб различных экологических групп при действии in vitro Раундапа в широком диапазоне сублетальных концентраций 0,150 мг/л (температура 200С и рН 7,4). Раундап оказывает большие токсические эффекты на карбогидразы слизистой оболочки кишечника молоди рыб по сравнению с одноименными ферментами химуса и целого организма. При этом наибольший эффект выявлен у карпа, в питании которого углеводы играют большую роль по сравнению с другими исследованными видами. Сравнение эффектов эквимолярных концентраций Раундапа в условиях in vitro показало, что карбогидразы в целом организме молоди рыб более чувствительны к токсическому действию гербицида по сравнению с одноименными ферментами рачкового зоопланктона [1]. Поскольку ферменты жертвы могут принимать участие в самопереваривании и служить дополнительным источником ферментов для консументов [3], снижение активности карбоги-драз в тканях молоди рыб, особенно в условиях реального желудочного пищеварения, может значительно снижать вклад карбогидраз кормовых объектов в пищеварение типичных и факультативных ихтиофагов. Полученные результаты не только расширяют представления о токсичности гербицида Раундап, но и позволяют выявить негативные эффекты до появления видимых отклонений от нормы и прогнозировать последствия его влияния на гидробионтов.

Заключение. При исследовании in vitro активности ферментов, гидролизующих углеводы (амилолитическая активность и активность сахаразы), в кишечнике и в целом организме молоди некоторых видов рыб при действии гербицида Раундап в широком диапазоне концентраций 0,1-50 мг/л при температуре 200С и рН 7,4 установлено, что карбогидразы слизистой оболочки кишечника более чувствительны к токсическому действию Раундапа по сравнению с одноименными ферментами химуса и целого организма. Раундап оказывает больший токсический эффект на активность карбогидраз в тканях реальной жертвы по сравнению с таковыми потенциальной жертвы. Величина и направленность эффектов зависят от концентрации токсиканта, вида рыб и спектра ферментов, участвующих в гидролизе углеводов.

31

Активность карбогидраз в слизистой оболочке молоди рыб (М ± т) в присутствии Раундапа в концентрации 0,1-50,0 мг/л (по глифосату)

Концентрация Раундапа, мг/л Вид рыб

Плотва Окунь Щука Тюлька Карп

Амилолитическая активность, мкмоль/ гмин

0 57,2 ± 1,6а 34,4 ± 1,2я-6 0,89 ± 0,02я 11,7 ± 0,3я 228,8 ± 2,0 я

0,1 56,4 ± 3,5я 37,6 ± 2,1я 0,79 ± 0,026 10,3 ± 0,36 193,6 ± 3,96

1 52,4 ± 3,2я-6 32,5 ± 2,6я-6 0,78 ± 0,02 6 10,3 ± 0,56 179,2 ± 4,86в

10 52,9 ± 1,1а-6 31,2 ± 3,0я-6-в 0,77 ± 0,03 6 9,51 ± 0,66 176,8 ± 8,66в

25 47,2 ± 1,56-в 28,4 ± 3,16-в 0,74 ± 0,03 6 9,20 ± 0,56 173,6 ± 7,9в

50 42,1 ± 1,9в 24,8 ± 2,1в 0,74 ± 0,01 6 9,10 ± 0,36 166,4 ± 4,7в

Активность сахаразы, мкмоль/ гмин

0 1,16 ± 0,11а 0,59 ± 0,04я - 0,64 ± 0,01я 1,24 ± 0,09я

0,1 1,09 ± 0,10я 0,51 ± 0,03я - 0,68 ± 0,07я 1,25 ± 0,11я

1 1,24± 0,10я 0,82 ± 0,036 - 0,63 ± 0,01я 1,27 ± 0,04я

10 1,66 ± 0,176 0,93 ± 0,046 - 0,67 ± 0,01я 1,29 ± 0,05я

25 1,80 ± 0,106 1,06 ± 0,04в - 0,66 ± 0,01я 1,36 ± 0,13я

50 1,88 ± 0,066 1,14 ± 0,06в - 0,67 ± 0,01я 1,36 ± 0,10я

Примечание. Здесь и в табл. 2, 3: М ± т - среднее значение показателя и его ошибка; разные надстрочные индексы

указывают на статистически значимые отличия между показателями в столбце, р < 0,05; - данные отсутствуют.

32

5

Таблица 2

Активность карбогидраз в химусе кишечника молоди рыб (М ± т) в присутствии Раундапа в концентрации 0,1-50,0 мг/л (по глифосату)

Концентрация Раундапа, мг/л Вид рыб

Плотва Окунь Щука Тюлька Карп

Амилолитическая активность, мкмоль/ гмин

0 85,6 ± 3,9а>б 57,6 ± 4,7а 0,99 ± 0,02а 1,41 ± 0,27а 183,2 ± 2,7а

0,1 74,4 ± 4,3а 65,6 ±3,0а 1,07 ± 0,04 а 1,33 ± 0,22а 158,4 ± 3,3б

1 85,5 ± 9,4а>б 57,6 ± 4,5а 1,06 ± 0,02 а 1,68 ± 0,07а 153,6 ± 3,7б

10 97,6 ± 8,5б 58,0 ± 9,9а 1,01 ± 0,02 а 1,52 ± 0,14а 140,0 ± 3,4в

25 85,6 ± 8,2а>б 56,8 ± 3,9а 1,01 ± 0,02 а 1,37 ± 0,23а 139,2 ± 1,5в

50 95,2 ± 5,6б 59,2 ± 6,6а 1,05 ± 0,05 а 1,68 ± 0,16а 136,0 ±5,5в

Активность сахаразы, мкмоль/ гмин

0 1,80 ±0,02аАв 0,32 ± 0,04а•б - 0,12 ± 0,01а 1,11 ± 0,03а

0,1 1,87 ± 0,04а 0,30 ± 0,02аАв - 0,11 ± 0,01а 1,16 ± 0,05а>б

1 1,85 ± 0,10бв 0,32 ± 0,04а•б - 0,11 ± 0,01а 1,15 ± 0,04а

10 1,72 ± 0,10в 0,22 ± 0,02в - 0,11 ± 0,02а 1,24 ± 0,02б-в

25 1,64 ± 0,06^ 0,37 ± 0,01а - 0,14 ± 0,01а 1,28 ± 0,02в

50 1,48 ±0,05аАв 0,28 ± 0,03б-в - 0,13 ± 0,01а 1,29 ± 0,03в

33

Активность карбогидраз в целом организмемолоди рыб (M. ± m) вч присутствии Раундапа в концентрации 0,1-50,0 мг/л (по глифосату)

Концентрация Раундапа, мг/л Вид рыб

Плотва Окунь Щука Тюлька

Амилолитическая активность, мкмоль/ гмин

0 9,07 ± 0,32а 4,11 ± 0,07а>б 3,93 ± 0,24а 0,51 ± 0,03а

0,1 10,0 ± 0,56а>б 3,79 ± 0,32а>б 4,07 ± 0,12а 0,52 ± 0,03а

1 10,20 ± 0,54а>б 4,27 ± 0,17аб 4,33 ± 0,30а 0,47 ± 0,03а

10 10,80 ± 0,53б 3,49 ± 0,45а 5,40 ± 0,19б 0,47 ± 0,02а

25 11,07 ± 0,37б 4,27 ± 0,44а>б 5,53 ± 0,27б 0,49 ± 0,03а

50 11,40 ± 0,78б 4,53 ± 0,40б 5,73 ± 0,29б 0,46 ±0,02а

Активность сахаразы, мкмоль/ гмин

0 0,72 ± 0,04а 0,88 ± 0,09а 0,28 ± 0,06а 0,14 ± 0,02а

0,1 0,82 ± 0,35 а 0,91 ± 0,08 а 0,39 ± 0,12а 0,16 ± 0,01а

1 0,81 ± 0,20 а 0,88 ± 0,18 а 0,27 ± 0,05а 0,15 ± 0,01а

10 0,82 ± 0,14 а 0,79 ± 0,03 а 0,29 ± 0,05а 0,15 ± 0,01а

25 1,00 ± 0,11 б 0,99 ± 0,07 а 0,24 ± 0,01а 0,13 ± 0,01а

50 1,10 ± 0,09 б 1,10 ± 0,02 а 0,24 ± 0,03а 0,15 ±0,01а

34

5

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Голованова И.Л., Папченкова Г.А. Влияние гербицида Раундап на активность карбогидраз рачкового зоопланктона и молоди плотвы // Токсикологический Вестник. 2009. № 4. С. 32-35.

2. Жиденко А.А., Бибчук Е.В. Изменения биохимических показателей в печени карпа в условиях действия Раундапа // Совр. проблемы теорет. и практ. ихтиологии. Тез. II Межд. научно-практ. конф. Севастополь, 2009. С. 50-52.

3. Кузьмина В.В. Вклад индуцированного аутолиза в процессы пищеварения вторичных консументов на примере гидробионтов // Доклады РАН. 2000. Т. 339. № 1. С. 172-174.

4. Папченкова Г.А., Голованова И.Л., Ушакова Н.В. Репродуктивные показатели, размеры и активность гидролаз у Daphnia magna в ряду поколений при действии гербицида Раундап // Биология внутренних вод, 2009. № 3. С. 105-110.

5. Уголев А.М., Иезуитова Н.Н. Определение активности инвертазы и других дисахаридаз // Исследование пищеварительного аппарата у человека. Л.: Наука, 1969. С. 192-196.

6. Cox С. Glyphosate // Journal of pesticide reform. 2004. V. 24, № 4. P. 10-15.

7. Folmar L.C., Sanders H.O., Julin A.M. Toxicity of the herbicide glyphosate and several of its formulations to fish and aquatic invertebrates // Arch. Environ. Contam. Toxicoogy, 1979. V. 8.P. 269-278.

8. Smith E.A., Oehme F.W. The biological activity of glyphosate to plants and animals: A literature review // Vet. Hum. Toxicology, 1992. V. 34. № 6. P. 531-543.

9. Tsui M.T.K., Chu L.M. Aquatic toxicity of glyphosate-based formulations: comparison between different organisms and the effects of environmental factors // Chemosphere. 2003. V. 52. № 7. P. 1189-1197.

Golovanova I.L., Filipov A.A., Aminov A.I. Influence of herbicide Roundup in vitro on the activity of carbohydrases in fish young

I.D. Papanin Institute for Biology of Inland Waters, Borok, Yaroslav Region

The effect of herbicide Roundup sub-lethal concentrations of 0.1-50.0 mg/l (as glyphosate) on the carbohydrases activity (amylolytic activity and saccharose activity) was investigated in vitro in the intestine mucous membrane and content as well as in the whole organism of the fish young ( temperature 200C, pH 7.4). It was found out that carbohydrases of the intestine mucous membrane are more sensible to the Roundup toxic impact as compared to like-named enzymes of chime and the whole organism. Roundup produces a more significant toxic effect on the carbohydrase activity in tissues of the real victim in comparison with a potential victim. The effect size and directionality depend on toxicant concentrations, fish species and range of enzymes participating in hydrocarbons hydrolysis.

Материал поступил в редакцию 19.04.2010 г

35