CC BY
12УДК 597.554.3: 574.64 + 595.3:574.64
И.Л. Голованова, Г.А. Папченкова
ВЛИЯНИЕ ГЕРБИЦИДА «РАУНДАП» НА АКТИВНОСТЬ КАРБОГИДРАЗ РАЧКОВОГО ЗООПЛАНКТОНА И МОЛОДИ ПЛОТВЫ
Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, Борок, Ярославская обл.
Исследовано in vitro влияние сублетальных концентраций гербицида «Раундап» 0,1—50 мг/л (по глифосату) на амилолитическую активность и активность сахаразы в тканях представителей суммарных проб рачкового зоопланктона, дафнии Daphnia magna и молоди плотвы Rutilus rutilus (L.) при температуре 20 °С и рН 7,4. Установлено, что карбогидразы молоди плотвы более чувствительны к токсическому действию «Раундапа» по сравнению с одноименными ферментами зоопланктона. Величина и направленность эффектов зависят от концентрации токсиканта, вида гидробионтов и типа субстрата.
Ключевые слова: гербицид «Раундап», глифосат, зоопланктон, Daphnia magna, Rutilus rutilus, амилолитическая активность, активность сахаразы.
Введение. Высокотехнологичный системный гербицид широкого спектра действия глифосат [N-(phosphonomethyl) glycine] используется в мире с середины 70-х годов прошлого века. На основе его действующего вещества изопропил-аминовой соли глифосата создано много гербицидов, самый известный из которых «Раундап». Несмотря на заявленную производителем (компания Монсанто, США) безопасность препарата в настоящее время накоплено много сведений о токсичности «Раундапа» и составляющих его компонентов [7]. Полученные данные в основном касаются острой токсичности и хронического действия сублетальных концентраций гербицида на морфо-биологические характеристики гидробионтов [2, 3, 5, 7, 9]. В то же время влияние «Раундапа» на физиолого-биохими-ческие показатели беспозвоночных животных и молоди рыб, которые могут служить дополнительным источником ферментов для консумен-тов и принимать участие в процессах самопереваривания жертвы [1], практически не исследовано.
Цель настоящей работы заключалась в изучении in vitro влияния гербицида «Раундап» в сублетальных концентрациях (0,1—50,0 мг/л) на активность карбогидраз — ферментов, осуществляющих гидролиз ди- и полисахаридов, в тканях рачкового зоопланктона и молоди плотвы Ruti-lus rutilus (L).
Материал и методы исследования. В качестве объектов исследования использовали планктонные организмы, входящие в состав суммарных проб рачкового зоопланктона, включающие представителей отр. Daphniiformes, Copepoda, Os-tracoda (Cyclops sp., Bosmina sp., Daphnia sp. и др.),
дафния Daphnia magna (Straus) и сеголетки плотвы Rutilus rutilus (L.). Рачковый зоопланктон и молодь плотвы отлавливали в летний период в прибрежной части Рыбинского водохранилища. Чистая культура дафний получена в лабораторных условиях, где она поддерживалась в 1,5-литровых аквариумах с дехлорированной водопроводной водой при температуре 22—25 °C при ежедневном кормлении рачков суспензией клеток водоросли Chlorella vulgaris Beyer., культура которой также поддерживалась в лаборатории.
Для приготовления растворов токсиканта использовали коммерческий препарат гербицида, имеющий торговое название «Раундап» (произведен и расфасован ЗАО фирма «Август» (Россия) по лицензии фирмы «Монсанто Европа С. А.» (Бельгия). Средство представляет собой 36 %-ный водный раствор глифосата. Возможные инертные ингредиенты, усиливающие действие активного элемента или облегчающие использование гербицида, в аннотации к препарату не указаны. Выбор тестируемых концентраций 0,1—50,0 мг/л был обусловлен установленными значениями ПДК для воды рыбохозяй-ственных водоемов (0,001 мг/л), а также значениями 96-ч CL50 «Раундапа» для рыб и дафний (от 86 до 168 мг/л) [4, 8].
Для определения ферментативной активности в целом организме гидробионтов при помощи стеклянного гомогенизатора готовили суммарные гомогенаты из нескольких сотен рачков или 30 экз. сеголетков плотвы (тушки рыб предварительно измельчали ножницами на стекле ледяной бани), добавляя охлажденный до 2—4 °С раствор Рингера для холоднокровных животных (110 ммоль NaCl, 1,9 ммоль KCl, 1,3 ммоль
CaCl2, pH 7,4) в соотношении 1:9. Затем исходный гомогенат дополнительно разводили раствором Рингера в 2—10 раз. Растворы субстратов (растворимый крахмал в концентрации 18 г/л и раствор сахарозы в концентрации 50 ммоль/л) готовили на таком же растворе Рингера. Инкубацию гомогената и субстрата проводили в течение 30—60 мин при температуре 20 °С, рН 7,4. Го-могенаты предварительно инкубировали в присутствии растворов «Раундапа» определенной концентрации (в контроль вместо токсиканта добавляли равное количество раствора Рингера) в течение 1 ч. Концентрации «Раундапа», рассчитанные по содержанию глифосата, составляли 0,1, 1,0, 5,0, 10,0, 25,0 и 50,0 мг/л.
Активность карбогидраз: амилолитическую активность (отражающую суммарную активность а-амилазы КФ 3.2.1.1, глюкоамилазы КФ 3.2.1.3 и ферментов группы мальтаз КФ 3.2.1.20) и активность сахаразы, КФ 3.2.1.48 оценивали по приросту гексоз модифицированным методом Нельсона [6]. Активность ферментов в суммарных пробах гомогената определяли в пяти повторностях и выражали в микромолях продуктов реакции, образующихся за 1 мин инкубации в расчете на 1 г влажной массы ткани (мкмоль/г-мин). Результаты представлены в виде средних и их ошибок (M±m). Достоверность различий оценивали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA, LSD тест), р < 0,05.
Результаты и обсуждение. При исследовании влияния «Раундапа» в концентрациях 0,1— 10 мг/л на уровень амилолитической активности в тканях организмов, входящих в состав суммарных проб рачкового зоопланктона, а также в целом организме молоди плотвы статистически значимые эффекты в большинстве случаев отсутствуют (табл. 1). Лишь самая низкая из тестируемых концентраций гербицида достоверно повышала амилолитическую активность
на 13 и 17 % от контроля у зоопланктона и плотвы соответственно (р < 0,01). Увеличение уровня ферментативной активности при концентрации «Раундапа» 0,1 мг/л хорошо согласуется с результатами экспериментов in vivo, свидетельствующими о стимулирующим влиянии низких доз органических токсикантов на активность пищеварительных ферментов [1]. При изучении действия более высоких концентраций «Раундапа» 25 и 50 мг/л на амилолитическую активность и активность сахаразы в тканях организмов, входящих в состав суммарных проб рачкового зоопланктона достоверных различий не выявлено (табл. 2). У дафний «Раундап» повышает амилолитическую активность на 24 и 30 %, активность сахаразы на 28 и 85 % от контроля при концентрации 25 и 50 мг/л соответственно. Уровень амилолитической активности в целом организме молоди плотвы достоверно снижался на 11 и
24 % в присутствии «Раундапа» в концентрации
25 и 50 мг/л (p < 0,01).
В исследованиях по токсичности «Раундапа» для бактерий (Vibriofischeri), микроводорослей (Selenastrum capricornutum и Skeletonema costa-tum), простейших (Tetrahymena pyriformis и Eu-plotes vannus) и ракообразных (Ceriodaphnia dubia и Acartia tonsa) показано, что концентрации, вызывающие остановку роста (CI50) для бактерий и простейших, близки и составляют 23,5— 29,5 мг/л [9]. Микроводоросли и ракообразные были в 4—5 раз чувствительнее к действию «Раундапа». При этом значения 48-ч CL50 для C. dubia составили 147 мг/л, для A. tonsa — 35,3 мг/л [9], для D. magna - 98 мг/л [4] и 780 мг/л [8]. Повышение рН (6-9) и мутности воды (0-200 мг/л) достоверно увеличивало токсичность «Раундапа» для C. dubia, но изменение температуры (20-30 °С) и наличие пищи не вызывало значительных эффектов [9]. При изучении токсичности «Раундапа» для 4-х видов водных беспозво-
Таблица 1
Амилолитическая активность в тканях представителей суммарных проб рачкового зоопланктона и молоди плотвы (М±т) в присутствии «Раундапа» в концентрации 0,1-10 мг/л (по глифосату)
Концентрация «Раундапа», мг/л Амилолитическая активность, мкмольДг-мин)
рачковый зоопланктон молодь плотвы
0 4,13+0,20* 8,11+0,36*
0,1 5,94+0,14** 11,54+0,19**
1 5,49+0,14* 10,06+0,34*
5 5,62+0,33* 10,23+0,63*
10 5,58+0,24* 9,31+0,19*
Примечание. Здесь и в табл. 2: М±т — среднее значение показателя и его ошибка; *,** указывают на статистически достоверные различия между показателями в столбце, р < 0,01
Таблица 2
Активность карбогидраз в тканях представителей суммарных проб рачкового зоопланктона, дафнии и молоди плотвы (М±т) в присутствии «Раундапа» в концентрации 0,1-10 мг/л (по глифосату)
Концентрация «Раундапа», мг/л Амилолитическая активность, мкмольДг-мин) Активность сахаразы, мкмольДг-мин)
Рачковый зоопланктон (суммарные пробы)
0 3,49+0,12* 1,00+0,05*
25 3,56+0,10* 1,05+0,03*
50 3,52+0,12* 1,06+0,03*
Дафния
0 4,64+0,21* 0,20+0,01*
25 5,73+0,16** 0,26+0,01**
50 6,03+0,23** 0,37+0,03***
Плотва
0 9,83+0,31* 1,00+0,05*
25 8,71+0,09** 1,05+0,03*
50 7,43+0,33*** 1,06+0,03*
ночных: дафнии D. magna, гаммарусов Gammarus pseudolimnaeus, личинок хирономид Chironomous plumosus, личинок поденок Ephemerella walkeri и 4-х видов рыб: радужной форели Salmo gairdne-ri, черного толстоголова Pimephales promelas, канального сомика Ictaluruspunctatus и синежабер-ного солнечника Lepomis macrochirus установлено, что острая токсичность варьирует от 2,3 мг/л (96-ч CL50 для черного толстоголова) до 43 мг/л (48-ч CE50 — концентрации, вызывающие обездвиживание у 50 % организмов — для поденок) [7]. По данным других авторов значения 96-ч CL50 для радужной форели Oncorhynchus mykiss составляли от 86 до 168 мг/л [8]. При этом установлено, что «Раундап» более токсичен для радужной форели и синежаберного солнечника при повышении температуры на 10 °С и значений рН от 6,5 до 7,5. Однако его токсичность не изменялась при увеличении рН от 8,5 до 9,5 [7]. При действии «Раундапа», содержание которого в воде составило 0,004 мг/л, выявлен ряд морфологических нарушений в различных органах карпа Cyprinus carpio (L.), при этом наибольшие изменения отмечены в печени и скелетной мускулатуре, в меньшей степени — в кишечнике, патологические изменения в жабрах и мозге были незначительны [2].
В 15-суточных тестах установлено, что «Раундап» в концентрациях от 0,2 до 2 мг/л снижает показатели линейного роста и продуктивности D. magna как у родительских особей, так и у развивающегося потомства [3]. Более высокие сублетальные концентрации «Раундапа» 25
и 50 мг/л также оказывают угнетающее действие на репродукцию и линейные размеры D. magna в ряду 4-х поколений [4]. При этом адаптации рачков к «Раундапу» не выявлено, но отмечено существенное снижение резистентности к гербициду в 4-ом поколении дафний по сравнению с материнской линией. Наблюдаемые в ходе эксперимента изменения активности гидро-лаз в тканях D. magna (повышение протеолити-ческой активности и снижение амилолитиче-ской активности), по всей вероятности, могут отражать увеличение роли белков в метаболизме рачков при действии сублетальных концентраций гербицида. Морфологические аномалии в строении D. magna, выражающиеся в появлении патоморфологических отклонений в строении ряда структур, были выявлены лишь в 4-ом поколении дафний при действии «Раундапа» в концентрациях 25 и 50 мг/л [5].
Анализ результатов хронических экспериментов [4] и данных, полученных в настоящей работе, позволил выявить разнонаправленные эффекты одних и тех же концентраций «Раундапа» на активность карбогидраз в целом организме D. magna в условиях in vivo и in vitro. Действительно, в 15-сут. эксперименте показано достоверное снижение амилолитической активности на 37 и 50 % от контроля при действии «Раундапа» в концентрации 25 и 50 мг/л, в то время как в условиях in vitro ферментативная активность повышалась на 24 и 30 % соответственно. Активность сахаразы в условиях in vivo снижалась на 50 % при концентрации «Раундапа» 50 мг/л, в эксперименте in
vitro — напротив, достоверно повышалась на 28 и 85 % от контроля при обеих исследованных концентрациях. Эти различия, по всей вероятности, обусловлены тем, что в условиях in vivo «Раундап» может оказывать опосредованное влияние, изменяя скорость синтеза ферментов и, возможно, количественное соотношение карбогидраз, гид-ролизующих полисахарид крахмал. Сравнение эффектов эквимолярных концентраций «Раунда-па» в условиях in vitro показало, что карбогидразы молоди плотвы более чувствительны к токсическому действию гербицида по сравнению с одноименными ферментами рачкового зоопланктона. Большая чувствительность карбогидраз в целом организме молоди рыб по сравнению с ферментами беспозвоночных животных (рачкового зоопланктона, моллюсков, личинок насекомых) была отмечена ранее при действии in vitro ионов кадмия, меди и цинка [1].
Заключение. При исследовании in vitro активности карбогидраз (амилолитической активности и активности сахаразы) в тканях гидроби-онтов (рачкового зоопланктона, дафнии и молоди плотвы) установлены разнонаправленные эффекты при действии гербицида «Раундап» в широком диапазоне сублетальных концентраций 0,1—50 мг/л. Самая низкая из исследованных концентраций гербицида (0,1 мг/л) повышает амилолитическую активность в тканях рачкового зоопланктона и молоди плотвы на 13 и 17 % от контроля. «Раундап» в концентрациях 25 и 50 мг/л не изменяет уровня амилолитической активности в тканях гидробионтов, входящих в состав суммарных проб рачкового зоопланктона, достоверно повышает ее у дафнии и снижает у молоди плотвы. Карбогидразы молоди плотвы более чувствительны к токсическому действию «Раундапа» (25 и 50 мг/л) по сравнению с одноименными ферментами рачкового зоопланктона. Величина и направленность эффектов зависят от вида гидробионтов, концентрации токсиканта и типа субстрата.
Список литературы
1. Голованова И.Л. Влияние природных и антропогенных факторов на гидролиз углеводов у рыб и объектов их питания // Автореф. дис. докт. — СПб: ИЭФБ им. И.М. Сеченова РАЛ, 2006. — 43 с.
2. Жиденко А.А., Коваленко Е.М. Влияние «Раундапа» на динамику гистологических показателей в органах карпа // Гидробиол. журнал, 2006. — Т. 42. — № 6. — С. 104-111.
3. Папченкова Г.А. Исследование хронической токсичности гербицида «Раундап» в ряду поколений Daphnia magna // Токсикол. вестник, 2007. — № 5. — С. 14-17.
4. Папченкова Г.А., Голованова И.Л., Ушакова Н.В. Репродуктивные показатели, размеры и активность гидролаз у Daphnia magna в ряду поколений при действии гербицида «Раундап» // Биология внутренних вод, 2009. — № 3. — С.
5. Папченкова Г.А., Гребенюк Л.П. Влияние сублетальных концентраций гербицида «Раундап» на размеры, плодовитость и морфологические параметры Daphnia magna (Cladocera) // Токсикол. вестник, 2008. — № 4. — С. 27-30.
6. Уголев А.М., Иезуитова Н.Н. Определение активности инвертазы и других дисахаридаз // Исследование пищеварительного аппарата у человека. — Л.: Наука, 1969. — 192 с.
7. FolmarL.C., SandersH.O., Julin A.M. Toxicity of the herbicide glyphosate and several of its formulations to fish and aquatic invertebrates // Arch. Environ. Contam. Toxicoogy, 1979. — V 8. — P. 269-278.
8. Smith E.A., Oehme F.W. The biological activity of glyphosate to plants and animals: A literature review //Vet. Hum. Toxicology, 1992. — V. 34. — № 6. — P. 531-543.
9. Tsui M.T., Chu L.M. Aquatic toxicity of glypho-sate-based formulations: comparison between different organisms and the effects of environmental factors // Chemosphere, 2003. — V 52. — P. 1189-1197.
Переработанный экз. статьи поступил в редакцию 25.03.09.
I.L. Golovanova, G.A. Papchenkova
IMPACT POSED BY THE HERBICIDE «ROUNDUP» ON THE ACTIVITY OF CARBOHYDRASES IN CRAYFISH ZOOPLANKTON AND YOUNG ROACHES
I.D. Papanin Institute of Inland Waters Biology, Russian Academy of Sciences, Borok, Yaroslav Region
Investigations in vitro were conducted on the influence of sub-lethal concentrations of herbicide «Roundup» in doses of 0.1—50 mg/l (as glyphosate) on the amylolytic activity and saccharase activity in tissues of representatives of gross samples of crayfish zooplankton, Daphnia magna and young roaches Rutilus rutilus (L.) at 20° and pH 7.4. It was found out that carbohydrases in young roaches are more sensitive to the «Roundup» toxic effect as compared to the same-named zooplankton enzymes. The scale and directivity of effects depend on toxicant concentrations, hydrobiont species and type of substrate.
