CC BY
101
Биомедицина • № 1,2013, С. 36-47
Влияние фосфорорганических соединений на факторы врожденного иммунитета мышей
Т.С. Запорожец1, Л.А. Иванушко1, А.К Гажа1, Е.В.Михеев2, Н.Н. Ковалев2
1 - Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения РАМН
2 - Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр, Владивосток Контактная информация: дм.н Запорожец Татьяна Станиславовна, [email protected]
Проведено исследование влияния фосфорорганического соединения О-этил-8-гексилметил-тиофосфаната (ФОС) на активность сывороточной холинэстеразы и факторы врожденного иммунитета неинбредных мышей. Установлено, что О-этил-З-гексилметилтиофосфанат (ЬБ50 для неинбредных мышей при внутрибрюшинном введении 12,33±4,05 мг/кг) ингибирует активность сывороточной холинэстеразы, достигая максимума к 24 ч после введения. Фосфорорганическое соединение обладает выраженным иммунотоксическим действием в отношении факторов врожденного иммунитета экспериментальных животных, вызывая лейкопению, обусловленную уменьшением относительного содержания нейтрофильных лейкоцитов, угнетение функциональной активности нейтрофилов и макрофагов (снижение адгезивной и бактерицидной активности).
Ключевые слова: фосфорорганические соединения, холинэстераза, врожденный иммунитет.
Введение
Вопросы, связанные с изучением холинэстеразы и антихолинэстеразных веществ, в течение многих лет находятся в центре внимания специалистов различного профиля [1]. Токсикология антихолинэстеразных средств имеет большое значение, поскольку препараты этого механизма действия довольно часто используются в быту в качестве инсектицидов [8] или в сельском хозяйстве в качестве пестицидов [2]. Эти вещества чаще всего относятся к группе фосфорорганических соединений (ФОС) [6]. Обладающие выраженной физиологической активностью, ФОС нашли применение и в медицинской практике [5]. Общепризнанно, что ведущим звеном в механизме действия этих веществ на организм человека и теплокровных животных является нарушение каталитической функции фер-
мента холинэстеразы во всех органах и структурах, имеющих холинергическую иннервацию, и, прежде всего, в нервной системе [1]. Однако влияние таких соединений на организм не ограничивается ингибированием холинэргическских процессов. В ряде публикаций представлены доказательства роли иммунной системы в патогенезе нейротоксического действия, наблюдаемого при воздействии ФОС на организм [4, 9].
Целью настоящей работы явилась оценка влияния фосфорорганического соединения на холинэргическую и иммунную системы экспериментальных животных in vivo.
Материалы и методы
В качестве ФОС использовали синтетический 0-этил-8-гексилметилтиофосфанат (шифр ЛГ-63), который среди О-этил-S-
гексилметилтиофосфанатов с нормальным алкильным радикалом является активным антихолинэстеразным соединением.
Экспериментальные исследования выполнены на неинбредных белых конвенциональных мышах-самцах (возраст 2-3 мес.) массой 18-20 г, полученных из питомника «Рассвет», НПО «Вирион», г. Томск. Все исследования проводились в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» [7], международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах, и стандартными операционными процедурами лаборатории.
Мышей содержали в комнатах барьерного типа с контролируемыми условиями окружающей среды в пластиковых клетках (по 2 животных в клетке площадью 400 см2) на подстиле из резаной пищевой бумаги. Животные получали стандартный пищевой рацион и профильтрованную водопроводную воду.
Острую токсичность (I Л)_.) ФОС определяли, вводя мышам (по 8 особей в группе) внутрибрюшинно О-этил-8-гексилметилтиофосфанат в дозах 100 мкг/мышь (5 мг/кг), 500 мкг/мышь (25 мг/кг) и 1000 мкг/мышь (50 мг/кг) в физиологическом растворе в объеме
0,5 мл. IЛ Х(. расчитывали с помощью метода пробит-анализа. Для оценки влияния соединения на остаточную активность холинэстеразы в сыворотке крови, клеточность лимфоидных органов и факторы врожденного иммунитета мышам (по 6 особей в группе) вводили ФОС внутрибрюшинно в сублетальной дозе 100 мкг/мышь (5 мг/кг) в 0,5 мл физиологического раствора. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор в том же объеме, что и исследуе-
мый препарат. Через 2, 4, 16, 24, 48, 72 ч мышей выводили из опыта декапитаци-ей под эфирным наркозом и определяли остаточную активность холинэстеразы в сыворотке крови спектрофотометрическим методом Элмана [11] с использованием в качестве субстрата иодида аце-тилтиохолина (ICN, США). Абсолютное количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, общую клеточность лимфоидных органов (количество ядросодержащих клеток (ЯСК)), клеточный состав экссудата перитонеальной полости подсчитывали стандартными методами [3]. Фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов перитонеальной полости мышей регистрировали по поглощению
S. aureus (штамм 209). Для этого взвесь клеток в объеме 100 мкл соединяли в центрифужных пробирках со 100 мкл взвеси S. aureus в соотношении 1:20, инкубировали 30 мин при 37° С, центрифугировали при 200 g 5 мин, надосадочную жидкость сливали, из осадка готовили мазки, фиксировали метанолом, окрашивали азур-П-эозином и микроскопирова-ли, определяя фагоцитарный показатель (ФП%) - процент клеток, участвующих в фагоцитозе, и фагоцитарное число (ФЧ) - среднее число микроорганизмов, поглощенных одним фагоцитом. Адгезивные свойства и бактерицидную активность (НСТ-тест) клеток перитонеальной полости мышей исследовали спектрофотометрическим методом [10].
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ «Statistica 6». Использовались следующие методы статистического анализа: проверка нормальности распределения количественных признаков при малом числе наблюдений с использованием W-кригерия Шапиро-Уилка, оценка значимости различий при нормальном
распределении количественных признаков — t-критерий Стьюдента (для независимых выборок), при ненормальном распределении - непараметрический критерий Манна-Уитни (для сравнения двух попарно не связанных между собой вариационных рядов). Для множественных сравнений использовали дисперсионный ранговый метод ANOVA (Kruskal-Wallis) & Median test. Выборочные параметры, приводимые далее в таблицах, имеют следующие обозначения: средняя арифметическая (М), стандартное отклонение (о), значения медианы и интерквантильного размаха Me (LQ-UQ), объем анализируемой подгруппы (п). Уровень доверительной вероятности был задан равным 95%.
Результаты и их обсуждение
При изучении острой токсичности 0-этил-8-гексилметилтиофосфаната проводили наблюдение за животными, оценивали сроки гибели, число павтттих животных, клиническую картину интоксикации, поведенческие реакции. LDS0 ФОС для белых неинбредных мышей при внутрибрюшинном введении составила 12,33±4,05 мг/кг (рис. 1).
ствие с ацетилхолинэстеразои сыворотки крови мышей. Токсический эффект при введении 5 мг/кг соединения развивался в течение 24 ч, когда остаточная активность холинэстеразы сыворотки крови животных снижалась максимально (рис. 2). Восстановление исходного уровня активности фермента наблюдалось через 48 ч после введения ФОС.
Г
линия регрессии; —■— экспериментальные точки
Рис. 1. Пробит-анализ. Вероятность наступления смерти (по оси ординат, в %) в зависимости от дозы О-этил-Э-гексилметилтиофосфаната (по оси абсцисс, в мг/кг).
При исследовании антифермент-ной активности О-этил-8-гексилметил-тиофосфаната изучали его взаимодей-
Рис. 2. Остаточная активность сывороточной холинэстеразы плазмы крови мышей после введения сублетальной дозы ФОС (в % к контролю, принятому за 100%).
Через 2 ч после внутрибрюшинно-го введения мышам ФОС в дозе 5 мг/кг наблюдался транзиторный лейкоцитоз, сменяющийся через 4 ч лейкопенией, обусловленной уменьшением относительного содержания нейтрофильных лейкоцитов. Масса и клеточность селезенки в течение 4 ч не изменялись (Л ХОУЛ (К1шка1-\\’аШх:р=0,306) (табл. 1). В экссудате перитонеальной полости 46,2±8,2% нейтрофилов и 37,5±4,5% макрофагов были полностью разрушены. Фагоцитарная активность неповрежденных клеток была значительно снижена по сравнению с контролем (интактные мыши) (табл. 2).
Через 4 ч количество нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе, несколько увеличивалось, что объясняется миграцией неповрежденных клеток из кровеносного русла (табл. 2), однако способность к поглощению оставалась сниженной и у этих клеток. Фагоцитарная активность
100
90
80
70
е. R0
с R0
■©■ 40
30
20
10
0
Таблица 1
Влияние ФОС на клеточный состав периферической крови, клеточность и массу селезенки неинбредных мышей
Показатели Г руппа ЭИарко- \М1к, м±о (Ме) (1.0-110) Мапп- ШИйпеу, "Мее! Р А1МО\/А (Кгивка!- ШаШв) Р
Лейкоциты (109/л) Контроль 0,88 6,90 ±0,81 0
ФОС 2 часа 0,98 9,40 ±2,45 0,041
4 часа 0,84 4,50±1,04 0,002
Моноциты (%) Контроль 0,90 10,2±1,6 0,099
ФОС 2 часа 0,95 СО го |+ го 0,033
4 часа 0,95 со со |+ сл 0,144
Сегментоядерные нейтрофилы (%) Контроль 0,85 7,41 ±1,93 0
ФОС 2 часа 0,93 4,28±1,32 0,008
4 часа 0,74 18,1 ±3, 17,00 (16,00:24,00) 0
Палочкоядерные нейтрофилы (%) Контроль 0,68 0,5±0,55 0,5 (0,00; 1,00) 0,007
ФОС 2 часа 0,68 1,5±0,54 1,5 (1,00:2,00) 0,01
4 часа 0,82 2,0±0,63 0,001
Лимфоциты (%) Контроль 0,98 81,0 ±4,9 0,004
ФОС 2 часа 0,94 85,3±5,6 0,187
4 часа 0,98 71 ±4,9 0,005
Клеточность селезенки (ЯСКхЮб) Контроль 0,94 301,6±56,3 0,306
ФОС 2 часа 0,78 322,6±67,3 357,00 (226,00; 378,00) 1
4 часа 0,82 339,5±67,3 0,273
Масса селезенки (мг) Контроль 0,84 222,6±51,9 0,306
ФОС 2 часа 0,84 221,2±40,6 0,544
4 часа 0,77 197,8±81,5 195,00 (100,00; 338,00) 1
Примечание: для всех значений критерия \¥ - р>0,05 (параметры имеют нормальное распределение).
Вютес1кте № 1,2013
макрофагов перитонеальной полости мышей, инъецированных ФОС, продолжала снижаться, поскольку миграция этой популяции клеток в ответ на раздражитель наблюдалась позже - через 24 ч, а функциональная активность присутствующих в брюшной полости макрофагов ингибировалась под действием ФОС.
При исследовании влияния ФОС на функциональную активность клеток перитонеальной полости установлено снижение способности фагоцитов к адгезии
на пластик и продукции активных форм кислорода (табл. 2).
Выводы
Таким образом, полученные результаты указывают, что фосфоорганиче-ское соединение - этил-8-гексилметил-тиофосфанат - при внутрибрюшинном введении неинбредным мышам в дозе 5 мг/кг приводит к угнетению активности сывороточной холинэстеразы и обладает выраженным иммунотоксическим
Таблица 2
Влияние ФОС на функциональную активность клеток перитонеальной полости неибредных мышей
Показатели Г руппа ЭИарко- \М1к, м±о (Ме) (І-О-ІЮ) Мапп- ШИйпеу, Т-Іеві Р АІМОУА (КгивкаІ- ШаІІів) Р
Макрофаги ФП (%) Контроль 0,82 76,3±6,6 0
ФОС 2 часа 0,92 55,3±6,2 0
4 часа 0,98 32,2±3,8 0
ФЧ Контроль 0,88 15,0±2,7 0
ФОС 2 часа 0,98 7,3±2,2 0
4 часа 0,84 1,4±0,2 0
Нейтрофилы ФП (%) Контроль 0,97 42,3±6,7 0,006
ФОС 2 часа 0,85 28,3±3,2 0,002
4 часа 0,95 33,7±4,9 0,004
ФЧ Контроль 0,90 2,7±1,2 0,024
ФОС 2 часа 0,82 1,0±0,6 0,014
4 часа 0,63 1,3±0,5 1,0 (1,00; 2,00) 0,033
КПП Адгезия (тыс. кл) Контроль 0,92 363,6±26,6 0,004
ФОС 2 часа 0,98 308,8±30,3 0,008
4 часа 0,96 277,0±28,7 0
нет (ОД х 10-3) Контроль 0,88 13,2±3,4 0
ФОС 2 часа 0,98 6,4±1,6 0
4 часа 0,84 4,5±1,0 0
Примечание: для всех значений критерия W - р>0,05 (параметры имеют нормальное распределение).
Биомедицина № 1,2013 40
действием в отношении факторов врожденного иммунитета экспериментальных животных, вызывая лейкопению и угнетение функциональной активности ней-трофилов и макрофагов (снижение адгезивной, фагоцитарной и бактерицидной активности).
Список литературы
1. Голиков С.Н., Розенгарт В.И. Хо-
линэстеразы и антихолинэстеразные вещества. Д.: Медицина. 1964. 382 с.
2. Каган Ю.С. Глобальное значение пестицидов и особенности их биологического действия II Профилактическая токсикология / Под. ред. Н.Ф. Измерова. М: Центр международных проектов. 1984. 2. 4.1. С. 123-134.
3. Лабораторные методы исследования в клинике (справочник под ред. В.В. Меньшикова). М., «Медицина». 1987. 365 с.
4. Машковский МД. Лекарственные средства. М. «Медицина». 2000.
5. О’Брайн РД. Токсические эфиры кислот фосфора. М.: Мир. 1964. 278 с.
6. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 267 от 19.06.2003 «Правила лабораторной практики в Российской Федерации».
7. Розенгарт В.И.,Шерстобитов О.Е. Избирательная токсичность фосфорорганических инсектоакарицидов. Л.: Наука. 1978. 174 с.
8. Сидоренко Г.И., Федосеева В.Н., Щарецкий А.Н., Пристовская JI.B. Иммунотоксикология важнейшее направление исследований в гигиене окружающей среды II Гигиена и сан. 1989. №3. С. 7-11.
9. Хаитов, Р.М. Экологическая иммунология / P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин, Х.И. Истамов. М. 1995. 219 с.
10. Ellman GL,., Courtney KD., Andres VJr., Featherstone RM. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity II Biochem. Pharmocol. 1961. Vol. 7. № 1. P. 88-95.
Assessing the impact of organophosphorus compounds on the factors of innate immunity of mice
T.S. Zaporozhets, L.A. Ivanushko, A.K. Gazha, E.V. Miheev, N.N. Kovalev
The action of organophosphorus compounds (OPC) O-ethyl-S-geksilmetiltiofosfanata on the activity of serum cholinesterase and factors of nonspecific resistance purebred mice has been studied. LD50 of O-ethyl-S-geksilmetiltiofosfanata for neinbrednyh mice after intraperitoneal injection of 12,33 ± 4,05 mg I kg. Inhibition of serum cholinesterase remains within 24 h after injection. Organophosphorus compound has a pronounced immunotoxic effect on the factors of innate immunity, causing leukopenia, inhibition of functional activity of neutrophils and macrophages (decrease adhesive, phagocytic and bactericidal activity).
Key words: organophosphorus compounds, cholinesterase, innate immunity.
