CC BY
41
Известия ТИНРО
2010 Том 163
ТЕХНОЛОГИЯ ОБРАБОТКИ ГИДРОБИОНТОВ
УДК 577.112:577.2
Н.Н. Ковалев1, Т.С. Запорожец2, Е.В. Михеев1, Т.П. Смолина2*
1 Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр,
690091, г. Владивосток, пер. Шевченко, 4;
2 Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии
Сибирского отделения РАМН, г. Владивосток, ул. Сельская, 3
ВЛИЯНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ РЕЦЕПТУР БАВ ГИДРОБИОНТОВ НА АКТИВНОСТЬ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ И ФАКТОРЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА
Разработаны новые рецептуры БАД из гидробионтов, обладающие защитным действием на нейромедиаторную и иммунную системы мышей. Предложено использование при токсическом действии фосфорорганических соединений в качестве антидотов БАВ гидробионтов. Показано, что профилактический прием БАД "Моллюскам" повышает на 40 % активность сывороточной холинэстеразы. Профилактическое введение экспериментальных рецептур БАВ мышам с хронической интоксикацией фосфорорганическим соединением обеспечивало защитный эффект, выражающийся в предотвращении депрессии показателей факторов врожденного иммунитета: количество лейкоцитов в периферической крови, масса и клеточ-ность селезенки были сопоставимы с таковыми у интактных здоровых животных.
Ключевые слова: фосфорорганические соединения, холинэстераза, иммунитет, биологически активные вещества.
Kovalev N.N., Zaporozhets T.S., Micheev E.V., Smolina T.P. Influence of biologically active substances from hydrobionts on serum cholinesterase activity and factors of innate immunity // Izv. TINRO. — 2010. — Vol. 163. — P. 408-413.
New compositions of biologically active supplements to food (BASF) from marine organisms are developed which have protective effect on neuromediator and immune systems of mice. Their using as antitoxic agents is proposed. Preventive taking of the BASF "Molluscam" raises the serum cholinesterase activity on 40 %. Preventive introduction the mixture of experimental BASF to mice with chronic intoxication by organophosphorus compounds prevents depression of their innate immunity: their leucocyte number, weight and cellularity of spleen are similar to these parameters for healthy intact animals.
Key words: organophosphorus compound, cholinesterase, immunity, biologically active substance.
* Ковалев Николай Николаевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией, e-mail: kovalevnn@tinro.ru; Запорожец Татьяна Станиславовна, доктор медицинских наук, заведующая лабораторией, e-mail: niiem_vl@mail.ru; Михеев Евгений Валерьевич, кандидат технических наук, младший научный сотрудник, e-mail: mikheev@tinro.ru; Смолина Татьяна Сергеевна, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник, e-mail: niiem_vl@mail.ru.
Введение
В последние годы исследования БАВ гидробионтов привели к разработке ряда потенциальных лекарственных средств и значительного количества БАД к пище. БАД к пище из животного и растительного сырья морского происхождения, как правило, характеризуются сложностью химического состава и широким спектром биологического действия (Биологически активные добавки ..., 2006). Особенности технологии получения и разнообразие биологических эффектов БАД к пище, разрабатываемых в ТИНРО-центре, описаны в ряде публикаций (Бесед-нова, Эпштейн, 2004, 2010; Суховеева, Подкорытова, 2006). Отмечается большое профилактическое значение применения БАД в ряде пограничных состояний, связанных с неблагополучными факторами среды. В настоящее время накоплены убедительные доказательства того, что наиболее тонким и чувствительным индикатором внешнего влияния на организм человека является состояние иммунной системы (Сидоренко и др., 1989). Эта система является одной из самых важных в формировании реакции организма на внешнее воздействие (Хаитов, 1995). Проблема профилактического применения БАД приобретает особенное значение в токсикологической практике, что обусловлено загрязнением окружающей среды поллютантами различной природы, в том числе фосфороргани-ческими (ФОС) и хлорорганическими соединениями. Эта проблема свидетельствует о важности отслеживания токсических эффектов поллютантов на живой организм (Bocquene et al., 1990; Manahan, 2003). Токсическое поражение организма связано с угнетением не только иммунной, но и холинэргической системы. Хорошо известно о высоких сорбционных (антитоксических) и иммуномоду-лирующих свойствах биополимеров из морского растительного сырья (Запорожец, Беседнова, 2007). Положительное влияние БАД животного происхождения на центральную нервную систему позволяет предположить их защитную роль при токсическом воздействии (Беседнова и др., 2007). Оценки влияния комплексных рецептур БАД, содержащих БАВ из животного и растительного сырья морского происхождения, ранее не проводилось. Между тем оценка влияния БАД и рецептур на их основе имеет существенное значение для выяснения механизма токсического воздействия на поллютантов и возможности снижения этого действия с помощью БАД к пище и поиска антидотов природного происхождения.
Таким образом, исследование влияния ФОС на нейромедиаторную и иммунную системы, разработка рецептур на основе БАВ гидробионтов при токсическом действии фосфорорганических соединений представляются актуальной проблемой современной биотехнологии и медицины.
Материалы и методы
В качестве ФОС применяли синтетический фосфорорганический ингибитор (ФОИ) О-этил^-гексилметилтиофосфанат (шифр ЛГ-63), который среди О-этил-S-гексилметилтиофосфанатов с нормальным алкильным радикалом является активным антихолинэстеразным соединением.
Острую токсичность ФОИ определяли на белых беспородных мышах. Для этого мышам (по 8 особей в группе) вводили внутрибрюшинно ЛГ-63 в дозах 100 мкг/мышь (5 мг/кг), 500 мкг/мышь (25 мг/кг) и 1000 мкг/мышь (50 мг/кг) в физиологическом растворе в объеме 0,5 мл.
Экспериментальные исследования выполнены на неинбредных белых мышах массой тела 18-20 г, полученных из питомника Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск). Работа выполнена с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах.
В качестве профилактических средств защиты использовали БАД и их смеси, разработанные в ТИНРО-центре, — полисахариды различного происхожде-
ния: хитозан (Хитин ..., 2002) и альгилозу (Суховеева, Подкорытова, 2006), известные как энтеросорбенты, а также БАД "Моллюскам", оказывающую влияние на нормализацию процессов в центральной нервной системе (Биологически активные добавки ., 2006).
Для оценки влияния профилактического введения экспериментальных рецептур БАВ на факторы врожденного иммунитета и остаточную активность холинэстеразы в сыворотке крови мышей, получавших перорально ФОС ЛГ-63, животным (по 5 особей в группе) в течение 21 дня вводили перорально моллюскам — 5 мг/кг, хитозан — 5 мг/кг, альгилозу — 5 мг/кг, моллюскам 2,5 мг/кг + хитозан 2,5 мг/кг, моллюскам 2,5 мг/кг + альгилоза 2,5 мг/кг. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор в том же объеме, что и исследуемый препарат. Затем мышам опытной и контрольной групп в течение 10 дней вводили ЛГ-63 по схеме: 5 дней в дозе 1,25 мг/кг перорально, 3 дня в дозе 2,50 мг/кг перорально, два последних дня — внутримышечно 5,0 и 10,0 мг/кг. По истечении 10 дней мышей выводили из опыта декапитацией под эфирным наркозом и определяли остаточную активность холинэстеразы в сыворотке крови мышей спектрофотометрическим методом Элмана (Ellman et al., 1961) с использованием в качестве субстрата иодида ацетилтиохолина (ICN, США). Абсолютное количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, общую клеточность лимфоидных органов, клеточный состав экссудата перитонеальной полости подсчитывали стандартными методами (Лабораторные методы ., 1987). Фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов перитонеальной полости мышей регистрировали по поглощению S. talylococcus (штамм 209). Для этого взвесь клеток в объеме 100 мкл соединяли в центрифужных пробирках со 100 мкл взвеси S. aureus в соотношении 1 : 20, инкубировали 30 мин при 37 °С, центрифугировали при 200 g 5 мин, надосадочную жидкость сливали, из осадка готовили мазки, фиксировали метанолом, окрашивали азур-11-эозином и микроскопиро-вали, определяя фагоцитарный показатель (ФП, %) — количество клеток, участвующих в фагоцитозе, — и фагоцитарное число — среднее число микроорганизмов, поглощенных одним фагоцитом. Адгезивные свойства и бактерицидную активность (НСТ-тест) клеток перитонеальной полости определяли спектрофото-метрическим методом (Сидоренко и др., 1989).
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программы "Biostat". Использовались следующие методы статистического анализа: проверка нормальности распределения количественных признаков при малом числе наблюдений с использованием W-критерия Шапиро-Уилка, для оценки значимости различий при нормальном распределении количественных признаков — t-критерий Стьюдента (для независимых выборок), при ненормальном распределении — непараметрический критерий Манна-Уитни (для сравнения двух попарно не связанных между собой вариационных рядов).
Результаты и их обсуждение
При изучении острой токсичности О-этил^-гексилметилтиофосфаната проводили наблюдение за животными, оценивали сроки гибели, число павших животных, поведенческие реакции. Было установлено, что клиническая картина интоксикации животных, получавших исследуемое вещество перорально, не сопровождалась общим угнетением, снижением двигательной и пищевой активности, тургора кожного покрова. Острая токсичность ФОС для белых неинбредных мышей при внутрибрюшинном введении составила 12,33 ± 4,05 мг/кг.
Хроническая интоксикация мышей, индуцированная сочетанным перораль-ным и парентеральным введением ФОИ в нарастающих дозах в течение 10 дней, приводила к снижению остаточной активности холинэстеразы (до 40 % по отношению к контролю, принятому за 100 %), изменению соотношения клеточных элементов периферической крови (снижению количества лимфоцитов и увеличе-
нию сегментоядерных нейтрофилов) (табл. 1), уменьшению массы и клеточности селезенки, подавлению функциональной активности нейтрофилов (табл. 2),
Таблица 1
Влияние биологически активных веществ на факторы врожденного иммунитета неинбредных мышей с хронической интоксикацией, индуцированной ФОИ
ТаЬ1е1
Influence of biologically active substances on factors of innate immunity of uninbred albino mice with chronic intoxication by organophosphorus compounds
Группа животных Лимфоциты С/я нф П/я нф Эозинофилы
Интактные мыши 69,8 ± 6,4 28,3 ± 2,6 0,5 ± 0,3 1,2 ± 0,2
Контроль ФОИ 54,0 ± 4,1* 42,2 ± 3,0* 0,75 ± 0,30 3,0 ± 0,6
Моллюскам 66,0 ± 3,2** 31,3 ± 3,3 0,5 ± 0,1 2,1 ± 0,3
Моллюскам+альгилоза 59,0 ± 3,6 39,0 ± 3,8 0,5 ± 0,2 1,6 ± 0,3
Моллюскам+хитозан 69,5 ± 4,1* 28,6 ± 2,6** 0,1 ± 0,1 1,6 ± 0,1
Моллюскам+чага 57,0 ± 5,3 39,8 ± 3,3 0,8 ± 0,1 1,6 ± 0,2
Примечание. С/я нф — сегментоядерные нейтрофилы; П/я нф — палочкоядер-ные нейтрофилы. * p < 0,05 по отношению к интактному контролю. ** p < 0,05 по отношению к контролю ФОИ.
Таблица 2
Влияние биологически активных веществ на клеточный состав периферической крови неинбредных мышей с хронической интоксикацией, индуцированной ФОИ
Table 2
Influence of biologically active substances on cellularity of peripheral blood of uninbred albino mice with chronic intoxication by organophosphorus compounds
Группа животных Лейкоциты Масса селезенки, мг Клеточность селезенки, х106 ФП, % Фагоцитарное число Адгезия, тыс. кл НСТ, OD ■ 10-3
Моллюскам 8,9 ± 1,6* 189 ± 28* 312 ± 54* 64 ± 6* 1,5 ± 0,6* 451±23* 30,0 ± 2,1*
Моллюскам+ хитозан 7,4 ± 1,6 186 ± 22* 293 ± 43* 54 ± 7 1,9 ± 0,9 441±15* 33,3 ± 2,3
Моллюскам+ альгилоза 5,9 ± 1,1 176 ± 29 230 ± 34* 41,0 ± 4,5 1,1 ± 0,3* 440±14* 29,4 ± 2,7
Моллюскам+ чага 6,9 ± 1,3 142 ± 21 228 ± 37* 62,4 ± 8,0 1,4 ± 0,4* 515±29* 35,0 ± 3,1*
Контроль ФОИ 5,6 ± 0,5 118 ± 19** 140 ± 30** 26,7 ± 3,0** 0,9 ± 0,2** 390±14** 23,4 ± 2,1**
Интактные мыши 7,0 ± 1,1 191 ± 44 226 ± 27 50 ± 4 1,54 ± 0,10 440 ± 19 30,0 ± 2,4
* p < 0,05 по отношению к контролю ФОИ.
* p < 0,05 по отношению к интактному контролю.
На основе ранее полученных данных (Беседнова, Эпштейн, 2004; Запорожец, Беседнова, 2007) об активности препаратов нами были разработаны дозировка и рецептура профилактических добавок: для индивидуальных препаратов — 5 мг/кг, для смесей — 1 : 1 в той же дозировке.
Было установлено, что профилактическое введение мышам с хронической интоксикацией ЛГ-63 моллюскама в дозе 5 мг/кг оказывает выраженное влияние на активность холинэстеразы сыворотки крови (табл. 3).
В то же время при использовании комплексных экспериментальных рецептур выраженной стимуляции активности фермента сыворотки крови мышей не наблюдалось (введение мышам смеси моллюскама и чаги лишь на 7 % увеличивало активность сывороточного фермента, смесь моллюскама и альгилозы не изменяла, а смесь моллюскама с хитозаном незначительно снижала активность холинэстеразы).
Пероральное введение интактным мышам (без хронической интоксикации ФОИ) моллюскама и экспериментальных рецептур БАВ оказывало стимулирующее влияние в отношении факторов врожденного иммунитета и сопровождалось увеличением абсолютного количества нейтрофильных лейкоцитов, массы и клеточности селезенки, функциональной активности фагоцитирующих клеток. Наиболее эффективными оказались композиции моллюскам + хитозан и моллюскам + альгилоза.
Таблица 3
Влияние биологически активных веществ на активность холинэстеразы сыворотки крови мышей при хронической интоксикации ФОИ
Table 3
Influence of biologically active substances on serum Cholinesterase activity of mice with chronic intoxication by organophosphorus compounds
Показатель Контроль Моллюскам Моллюскам+ хитозан Моллюскам+ альгилоза Моллюскам+ чага
Активность, % (без ФОИ) 100 98 103 103 97
Активность, % (хроническая интоксикация) 100 141 93 100 107
Профилактическое введение экспериментальных рецептур БАВ мышам с хронической интоксикацией фосфорорганическим соединением обеспечивало защитный эффект, выражающийся в предотвращении депрессии показателей факторов врожденного иммунитета: количество лейкоцитов в периферической крови, масса и клеточность селезенки были сопоставимы с таковыми у интакт-ных здоровых животных (см. табл. 2, 3).
Заключение
Таким образом, проведенные исследования показывают, что хроническая интоксикация неинбредных мышей, индуцированная сочетанным пероральным и парентеральным введением фосфорорганического соединения в нарастающих дозах, приводит к угнетению факторов неспецифической резистентности. Пе-роральное введение моллюскама и его композиций оказывает стимулирующее влияние в отношении факторов врожденного иммунитета. Наибольшим защитным эффектом обладают моллюскам и композиции моллюскам + хитозан, моллюскам + альгилоза, обеспечивающие сохранение модулирующего действия в отношении факторов врожденного иммунитета и повышения уровня активности сывороточной холинэстеразы. Эффект комплексных БАВ обусловлен преимущественно стимулирующим действием моллюскама.
Исследованные экспериментальные рецептуры биологически активных веществ могут быть использованы в качестве средств, предотвращающих угнетение факторов врожденного иммунитета при хронической интоксикации фосфор-органическими соединениями.
Список литературы
Беседнова H.H., Пивненко Т.Н., Запорожец Т.С. Биологически активная добавка к пище "Моллюскам" (в помощь практикующему врачу) : методическое пособие. — Владивосток : ТИНРО-центр, 2007. — 36 с.
Беседнова H.H., Эпштейн Л.М. Иммуноактивные пептиды из гидробионтов и наземных животных : монография. — Владивосток : ТИНРО-центр, 2004. — 248 с.
Беседнова H.H., Эпштейн Л.М. Природный модификатор функций врожденного иммунитета. ДНК из молок лососевых : монография. — Владивосток : Медицина ДВ, 2010. — 191 с.
Биологически активные добавки к пище (БАД) Приморского края (пособие для врачей и фармацевтов). — Владивосток, 2006. — 118 с.
Запорожец Т.С., Беседнова Н.Н. Иммуноактивные биополимеры из морских гидробионтов : монография. — Владивосток : НИИЭМ СО РАМН, 2007. — 218 с.
Лабораторные методы исследования в клинике : справочник / под ред. В.В. Меньшикова. — М. : Медицина, 1987. — 365 с.
Сидоренко Г.И., Федосеева В.Н., Щарецкий А.Н., Пристовская Л.В. Имму-нотоксикология — важнейшее направление исследований в гигиене окружающей среды // Гигиена и санитария. — 1989. — № 3. — С. 7-11.
Суховеева М.В., Подкорытова А.В. Промысловые водоросли и травы морей Дальнего Востока: биология, распространение, запасы, технология переработки : монография. — Владивосток : ТИНРО-центр, 2006. — 242 с.
Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология : монография. — М., 1995. — 219 с.
Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение : монография. — М. : Наука, 2002. — 365 с.
Bocquene G., Galgani F., Truquet P. Characterization and assay conditions for use of ACHe activity from several marine species in pollution monitoring // Mar. Environ. Res. — 1990. — Vol. 30, № 2. — P. 75-89.
Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V.Jr., Featherstone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmocol. — 1961. — Vol. 7, № 1. — P. 88-95.
Manahan S.E. Organophosphorus compounds // Toxicological chemistry and biochemistry. — Boca Raton, Florida : Levis Publishers; CRC Press Company, 2003. — 384 р.
Поступила в редакцию 1.07.10 г.
