CC BY
84
ВЛИЯНИЕ ФОСФАТВДИЛИНОЗИТОЛ-4-ФОСФАТ-5-КИНАЗЫ (ТИП 2 АЛЬФА) НА АКТИВНОСТЬ НЕЙРОНАЛЬНЫХ КС^ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ В ООЦИТАХ ХЕШОРШ LAEVIS
Ольга Юрьевна ФЕДОРЕНКО, Светлана Александровна ИВАНОВА, Валентин Яковлевич СЕМКЕ
НИИ психического здоровья СО РАМН 634014, г. Томск, Сосновый Бор
Нейрональные потенциалзависимые калиевые KCNQ-каналы, экспрессирующиеся в мозге обычно в виде гетеромерных комплексов KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5, регулируют возбудимость многих нейронов. Известно, что для своего открытия им требуется фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат. В данной работе изучались эффекты нейрональной фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназы (тип 2 альфа) (PIP5K2A), катализирующей образование фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата, на калиевые каналы KCNQ2, KCNQ5, KCNQ2/ KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 в ооцитной экспрессирующей системе Xenopus стандартным двухэлектродным методом фиксации напряжения (voltage clamp). Было показано, что дифосфорилированные фосфоинози-тиды активируют гетеромерные нейрональные М-каналы KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 в ооцитной экспрессирующей системе Xenopus неспецифическим образом. Кроме того, обнаружено активирующее действие PIP5K2A на гетеромерные калиевые каналы KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5. Гомомерные калиевые каналы KCNQ2 и KCNQ5 не обладали чувствительностью к Р1Р5К2А-киназе, свидетельствуя о том, что присутствие KCNQ3-субъединицы в канальном комплексе необходимо для Р1Р5К2А-опосредованных эффектов.
Ключевые слова: PIP5K2A, киназа, нейрональные калиевые М-каналы.
В регуляции везикулярного транспорта и клеточной возбудимости фундаментальную роль играет фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат (Р1(4,5)Р2), который напрямую связывается с белками синаптических везикул и других внутриклеточных мембранных структур [1, 2]. В нейронах Р1(4,5)Р2 влияет как на экзоцитоз-ную, так и на эндоцитозную фазы синаптического везикулярного цикла посредством связывания с синаптическими белками, подобно синаптотагмину и клатрин-адапторному белку АР-2 [1—4]. Дефосфорилирование синаптоя-нином приводит к высвобождению молекул клатрина из эндоцитозных синаптических везикул, что позволяет им рециркулировать в пул, доступный для нового раунда транс-миттерного высвобождения [1, 3]. Р1(4,5)Р2 также является субстратом для некоторых фосфатидилинозитол-3-киназ, которые фос-форилируют дериваты фосфатидилинозитола в D3-положении [5].
Р1Р5К2А-киназа катализирует фосфорили-рование инозитольного кольца в 5 положении, используя в качестве субстратов либо фосфа-тидилинозитол, либо фосфатидилинозитол-4-фосфат и, таким образом, вовлечена в рецептор-активируемые сигнальные пути, мембранную трансдукцию нейротрансмиттерных сигналов,
функционирование ионных каналов и синаптических везикул, а также во внутриклеточные сигнальные пути [6—8].
М-каналы представляют собой потенциал зависимые К+-каналы, которые регулируют возбудимость многих нейронов. Их прогрессивное открытие в ходе деполяризации фиксирует мембранный потенциал приблизительно на значении —55...—60 мВ и снижает возбудимость мембраны [9]. Данные нейрональные каналы состоят из субъединиц семейства KCNQ, обычно экспрессирующихся в нейронах мозга человека в комбинации гетеромерных калиевых каналов KCNQ2/3 и KCNQ3/5. Нативные М-каналы, а также экспрессированные KCNQ2/3 и KCNQ3/5 ингибируются при стимулировании мускариновых ацетилхолино-вых рецепторов M1-mAChR [10]. Для открытия М-каналов требуется фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат, в то время как их ингибирование при стимулировании mAChR происходит, главным образом, за счет снижения уровня Р1Р2 на мембране [11]. В данной работе проводилось исследование влияния нейрональной Р1Р5К2А-киназы на активность гомомерных (KCNQ2 и KCNQ5), а также гетеромерных (KCNQ2/3 и KCNQ3/5) калиевых каналов в эксперименте на ооцитах Хепорт laevis.
Федоренко О.Ю. — к.м.н, старш.н.с. лаборатории клеточных и молекулярно-биологических исследований, e-mail: f_o_y@mail.ru
Иванова С.А. — д.м.н., профессор, руководитель лаборатории клеточных и молекулярно-биологических исследований, е-mail: Svetlana@mail.tomsknet.ru
Семке В.Я. — академик РАМН, директор, е-mail: redo@mail.tomsknet.ru
Материалы и методы
Эксперименты проведены на базе института физиологии Тюбингенского университета г. Тюбингена (Германия). KCNQ2, KCNQ3 и KCNQ5 были субклонированы в векторе pSGEM. Все конструкции подтверждены автоматическим ДНК-секвенированием. кРНК KCNQ2, KCNQ3 и KCNQ5 была синтезирована с использованием набора SP6 или T7 mMessage mMachine (Ambion Inc., США). Инъецированные по 50 нл РНК ооциты инкубировались при 17—18 °С в течение 3 дней. Каждый ооцит был инъецирован по 5 нг кРНК KCNQ либо по 5 нг кРНК KCNQ вместе с 5 нг кРНК PIP5K2A. Первую контрольную группу составили ооциты, экспрессирующие либо гомомерные (KCNQ2, n = 44, или KCNQ5, n = 63), либо гетеромер-ные калиевые каналы (KCNQ2/3, n = 52, или KCNQ3/5, n = 42). Во второй группе ооциты экспрессировали KCNQ-каналы совместно с нормальным, так называемым диким, типом Р1Р5К2А-киназы. На 4-й день экспрессированные на поверхности мембраны калиевые каналы KCNQ изучались стандартным двухэлектродным методом фиксации напряжения с использованием усилителя Turbo Tec 10CX (NPI, Tamm, Германия), интерфейса ITC-16, объединенного с программным обеспечением pCLAMP 8.0 (Axon Instruments Inc. / Molecular Devices, Калифорния, США) для получения и анализа данных. Активность KCNQ-каналов тестировалась 3-секундными импульсами в диапазоне от удерживающего потенциала — 100 мВ к потенциалам между —120 и +60 мВ с интервалами в 20 мВ и последующей генерацией импульсов обратно к —120 мВ. Значения амплитуды тока определялись в конце деполяризирующих импульсов и нормализовались относительно среднего значения тока, генерируемого KCNQ-каналами, экспрессированными в одиночку.
В серии экспериментов по изучению эффектов аналогов дифосфорилированных фосфои-нозитидов в ооцитах экспрессировались гете-ромерные калиевые каналы KCNQ2/KCNQ3 (n = 17) и KCNQ3/KCNQ5 (n = 11), после чего в ооциты вводили водорастворимые аналоги сигнальных молекул C6-PI(3,4)P2, C6-PI(3,5)P2 и C6-PI(4,5)P2 (4,6 нл, 100 мг/мл) за 30-60 минут до регистрации.
В экспериментах по изучению эффекта скэ-винджера PI(4,5)P2, PIP2-Grip, в часть ооци-тов, экспрессирующих гетеромерные калиевые каналы KCNQ2/KCNQ3 (n = 18) в одиночку или коэкспрессирующих с PIP5K2A, за 30-60 минут
до регистрации вводили по 4,6 нл водорастворимого аналога PI(4,5)P2 или PIP2-Grip (100 мг/мл).
Графический анализ и статистическая обработка результатов выполнялись с использованием программного обеспечения Origin 6.0 (Microcal, Германия). На рисунках результаты представлены в виде средних арифметических, в качестве интервалов погрешностей приведены стандартные ошибки средних арифметических. Значимость различий между группами определяли с помощью t-критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Гомомерные нейрональные калиевые каналы KCNQ2 и KCNQ5 экспрессировались в одиночку или совместно с ферментом PIP5K2A. Коэкспрессия с PIP5K2A не приводила к существенным изменениям амплитуды тока при +50 мВ: для канала KCNQ2 прирост составил 7% (р = 0,7), KCNQ5 - 3% (р = 0,76) (рис. 1, 2). Таким образом, подтипы нейрональных калиевых каналов KCNQ2 и KCNQ5 не обладают чувствительностью к нормальному (дикому) типу PIP5K2A.
60 мВ
-120 мВ
Ш
KCNQ2
+PIP5K2A
г.
-100 -50 0 50
Потенциал (мВ)
Рис. 1. Ток, генерируемый гомомерными калиевыми каналами KCNQ2, экспрессированными в одиночку и коэкспрессированными с РІР5К2А в ооцитах Хепорт laevis. Здесь и на рис. 2—4: черные кружки обозначают средние значения амплитуды тока, генерируемого калиевыми каналами KCNQ2, экспрессированными без РІР5К2А, белые - с РІР5К2А.
Рис. 2. Ток, генерируемый гомомерными калиевыми каналами KCNQ5, экспрессированными в одиночку и коэкспрессированными с PIP5K2A в ооцитах Xenopus laevis
В случае коэкспрессии гетеромерных калиевых каналов КС^2/КС^3 и КС^З/ KCNQ5 с Р1Р5К2А амплитуды токов значительно возросли, на 53% (р = 0,0056) и на 115% (р = 0,0006) соответственно по сравнению с амплитудами токов, генерируемых каналами, экспрессированными в одиночку (рис. 3, 4). Обнаруженное увеличение не сопровождалось заметными изменениями в кинетике работы каналов (не было сдвига потенциальной зависимости и изменения временного цикла активации — дезактивации).
Выявленное Р1Р5К2А-опосредованное увеличение амплитуды тока в гетеромерных калиевых каналах KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/ KCNQ5 может быть опосредовано присутствием KCNQ3-субъединицы в гетеромерном канальном комплексе.
Р1Р5-киназы образуют Р1(4,5)Р2, который необходим для активации М-каналов [11]. С другой стороны, ингибирование М-каналов путем стимулирования mAChR происходит, главным образом, вследствие снижения уровня Р1Р2 на мембране [11]. Возможно, стимуляция mAChR и активация фосфатидилинозитол-4-и фосфатидилинозитол-5-киназ подобно
Рис. 3. Ток, генерируемый гетеромерными калиевыми
каналами KCNQ2/KCNQ3, экспрессированными в одиночку и коэкспрессированными с PIP5K2A в ооцитах Xenopus laevis
Рис. 4. Ток, генерируемый гетеромерными калиевыми
каналами KCNQ3/KCNQ5, экспрессированными в одиночку и коэкспрессированными с PIP5K2A в ооцитах Xenopus laevis
Р1Р5К2А-киназе выступают в качестве антагонистических модуляторов функционирования М-каналов, благодаря которым мембранное содержание PIP2 представляет собой контролируемый переменчивый процесс [12]. Известно, что PIP2 напрямую присоединяется к каналам KCNQ2/KCNQ3 и регулирует вероятность их открытия (Po) [13, 14]. Дивергентные аффинности KCNQ-каналов для PIP2 могут лежать в основе дифференциальной максимальной Po нейрональных гомо- и гетеромерных KCNQ-каналов, наблюдаемых в неповрежденных клетках (cell-attached patches) [13]. В упомянутой работе было показано, что сродство канала KCNQ3 к аналогам PI(4,5)P2 с короткой С-цепочкой составляет около 2,6 мкМ, что в 100 раз больше аффинности нейрональных каналов KCNQ2 и KCNQ4 (50%-я эффективная концентрация (EC50) для канала KCNQ2 была равна 205 мкМ, для канала KCNQ4 — 215 мкМ). Присутствие KCNQ3 в гетеромерном канальном комплексе KCNQ2/KCNQ3 придает соответствующим каналам повышенную чувствительность (EC50 = 40 мкМ) [13]. К сожалению, калиевые каналы KCNQ3 слабо экспрессируются в ооцитах, поэтому они не могут быть напрямую, как гомомерные каналы, тестированы на чувствительность к Р1Р5К2А-киназе. Тем не менее их функциональную активность можно оценить в комплексе гетеромерных каналов. Присутствие KCNQ3 в гетеромерных комплексах KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 может также передавать восприимчивость к PIP5K2A через увеличение концентрации PIP2, предполагаемого продукта Р1Р5К2А-киназы. Таким образом, PIP5K2A является функциональным модулятором гетеромерных KCNQ каналов.
Чтобы установить, был ли обнаруженный стимулирующий эффект Р1Р5К2А-киназы на активность калиевых каналов KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 следствием образования фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата, ее прямого продукта, а также изучить селективность гетеромерных канальных комплексов в отношении дифосфорилированных фосфоинозити-дов, гетеромерные калиевые каналы KCNQ2/ KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 экспрессировались в ооцитах, в которые затем вводили водорастворимые аналоги сигнальных молекул C6-PI(3,4)P2, C6-PI(3,5)P2 и C6-PI(4,5)P2. 2
Оба гетеромерных канала были активированы всеми тремя аналогами PI(4,5)P2 при +50 мВ (рис. 5, 6), соответствующие приросты амплитуды тока составили: для канала KCNQ2/
КС^3, Р1(3,4)Р2 - 128% (р = 0,022), Р1(3,5)Р2 -175% (р = 0,016), Р1(4,5)Р2 - 142% (р = 0,0005); для канала КС^3/КС^5, Р1(3,4)Р2 -83% (р = 0,028), Р1(3,5)Р2 - 139% (р = 0,041), Р1(4,5)Р2 - 106% (р = 0,048).
Таким образом, дифосфорилированные фосфоинозитиды активируют гетеромерные нейрональные М-каналы KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 в ооцитной экспрессирующей системе неспецифическим образом. Остается неизученной физиологическая роль стимуляции каналов Р1(3,4)Р2 и Р1(3,5)Р2, так как содержание этих аналогов Р1Р2 на плазматической мембране намного меньше, чем основного, Р1(4,5)Р2.
Дополнительные эксперименты с предварительным инъецированием ооцитов скэвиндже-ром Р1(4,5)Р2 Р1Р2^пр позволили установить стимулирующий эффект экзогенного Р1(4,5)Р2 в отношении канала KCNQ2/KCNQ3 при +50 мВ только в случае отсутствия Р1Р5К2А
Рис. 5. Ток, генерируемый гетеромерными калиевыми каналами KCNQ2/KCNQ3 (п = 17), экспрессированными в ооцитах Хепорш 1ае\Ы, неинъецированных и инъецированных водорастворимыми аналогами С6-Р1(3,4)Р2 С6-Р1(3,5)Р2 и С6-Р1(4,5)Р2 Здесь и на рис. 6: черные кружки обозначают средние значения амплитуды тока, генерируемого калиевыми каналами KCNQ2/KCNQ3, экспрессированными в одиночку, белые символы -каналами, коэкспрессированными: кружки — с С6-Р1(3,4)Р2, квадраты — с С6-Р1(3,5)Р2, треугольники — с С6-Р1(4,5)Р2.
(прирост амплитуды тока составил 68%), наряду с ингибированием канала KCNQ2/KCNQ3 Р1Р2-Grip исключительно в присутствии Р1Р5К2А (в этом случае снижение амплитуды тока составило 20%) (рис. 7).
Рис. 6. Ток, генерируемый гетеромерными калиевыми каналами KCNQ3/KCNQ5 (п = 11), экспрессированными в ооцитах Хепорт laevis, неинъецированных и инъецированных водорастворимыми аналогами С6-Р1(3,4)Р2, С6-Р1(3,5)Р2 и Сб-Р1(4,5)Р2.
к 2 * о і
I— со
^ X
CD ”
X
|“ 5 s 2
Ц О
С §•
J -
< О
2.0
1.5-
1.0
0.5-
0.0
р=0.01
2.0п
1.5-
1.0-
0.5-
0.0-1
р=0.04
1
Я Контроль
□ Р1(4,5)Р,
□ PIP2-Grip
KCNQ2/3
+Н,0
KCNQ2/3
+PIP5K2A
Рис. 7. Ток, генерируемый гетеромерными
калиевыми каналами KCNQ2/KCNQ3 (п = 18), экспрессированными в одиночку или с Р1Р5К2А в ооцитах Хепорт laevis, в присутствии водорастворимого аналога Р1(4,5)Р2 или скэвинджера PIP2-Grip.
Полученные данные указывают на то, что базальный уровень PI(4,5)P2 на плазматической мембране ооцитов недостаточно высок для насыщения активности каналов KCNQ2/ KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5, что позволяет стимулировать их либо прямым воздействием экзогенного PIP2, либо продукцией PIP2 PIP5K2A-киназой.
Таким образом, было показано, что нейрональная Р1Р5К2А-киназа является функциональным модулятором гетеромерных каналов KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5, в то время как гомомерные подтипы нейрональных калиевых каналов KCNQ2 и KCNQ5 не обладают чувствительностью к ферменту. Выявленное Р1Р5К2А-опосредованное увеличение амплитуды тока в гетеромерных калиевых каналах KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 может быть опосредовано присутствием в канальном комплексе субъединицы KCNQ3. Кроме того, получены данные о том, что дифосфорилирован-ные фосфоинозитиды активируют гетеромер-ные нейрональные М-каналы KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 в ооцитной экспрессирующей системе неспецифическим образом.
Работа выполнена при поддержке гранта INTAS (Ref. N. 04-83-3764).
Литература
1. Cremona O., Di Paolo G., Wenk M.R. et al. Essential role of phosphoinositide metabolism in synaptic vesicle recycling // Cell 1999. 99: 179-188.
2. Di Paolo G., De Camilli P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics // Nature. 2006. 12: 651-657.
3. McPherson P.S., Garcia E.P., Slepnev V.I. et al. A presynaptic inositol-5-phosphatase // Nature. 1996. 379: 353-357.
4. Osborne S.L., Meunier F.A., Schiavo G. Phosphoinositides as key regulators of synaptic function // Neuron. 2001. 32: 9-12.
5. Cockcroft S., De Matteis M.A. Inositol lipids as spatial regulators of membrane traffic // J. Membr. Biol. 2001. 180: 187-194.
6. Chatah N.E., Abrams C.S. G-protein-coupled receptor activation induces the membrane translocation and activation of phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase I alpha by a Rac- and Rho-dependent pathway // J. Biol. Chem. 2001. 276: 34059-34065.
7. Shyng S.L., Barbieri A., Gumusboga A. et al. Modulation of nucleotide sensitivity of ATP-sensitive potassium channels by phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. 97: 937-941.
8. Wenk M.R., Pellegrini L, Klenchin V.A. et al. PIP kinase Igamma is the major PI(4,5)P(2) synthesizing enzyme at the synapse // Neuron 2001. 32: 79-8.
9. Marrion N.V. Control of M-current // Annu. Rev. Physiol. 1997. 59: 483-504.
10. Jentsch T.J. Neuronal KCNQ potassium channels: physiology and role in disease // Nat. Rev. Neurosci. 2000. 1: 21-30.
11. Delmas P., Brown D.A. Pathways modulating neural KCNQ/M (Kv7) potassium channels // Nat. Rev. Neurosci. 2005. 6: 850-862.
12. Suh B.C., Hille B. Recovery from muscarinic modulation of M current channels requires phospha-
tidylinositol 4,5-bisphosphate synthesis // Neuron. 2002. 35: 507-520.
13. Li Y., Gamper N., Hilgemann D.W., Shapiro M.S. Regulation of Kv7 (KCNQ) K+ channel open probability by phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate // J. Neurosci. 2005. 25: 9825-9835.
14. Zhang H., Craciun L.C., Mirshahi T. et al. PIP2 activates KCNQ channels, and its hydrolysis underlies receptor-mediated inhibition of M currents // Neuron. 2003. 37: 963-975.
INFLUENCE OF PHOSPHATIDIL INOSITOL - 4-PHOSPHAT-5-KINASE (TYPE 2ALFA) ON ACTIVITY OF NEURONAL KCNQ POTASSIUM CHANNELS IN OOCYTE XENOPUS LAEVIS
Olga Yurjevna FEDORENKO, Svetlana Aleksandrovna IVANOVA, Valentin Yakovlevich SEMKE
Institute of the Russian Academy of Medical Sciences Research Institute for mental health of Siberian Branch RAMS Sosnovyi Bor settlement, Tomsk, 634014
Regulated by the product PIP2 of PIP5K2A are M-channels, voltage-gated K+ channels that regulate the excitability of many neurons. Neuronal KCNQ2/KCNQ3 and KCNQ3/KCNQ5 channels require PIP2 to open. Standart Two Electrode Voltage Clamp method was performed to study the effects of the neuronal PIP5K2A on KCNQ2, KCNQ5, KCNQ2/KCNQ3 and KCNQ3/KCNQ5 in the Xenopus expression system. Bi-phosphorylated phosphoinositides have been shown to activate heteromeric neuronal M-channels KCNQ2/KCNQ3 and KCNQ3/KCNQ5 in the oocyte expression system in a non-specific manner. Moreover, wild type-PIP5K2A has been found to activate heteromeric KCNQ2/KCNQ3 and KCNQ3/KCNQ5. Homomeric KCNQ2 and KCNQ5 channels have been not activated by the PIP5K2A kinase indicating that the presence of KCNQ3 in the channel complex is required for the kinase mediated effects.
Key words: PIP5K2A, kinase, M neuronal potassium channels.
Fedorenko O. Yu. — Ph.D., the laboratory of cell and molecular biological research, e-mail: f_o_y@mail.ru Ivanova S.A. — Ph.D., professor, the head of the laboratory of cell and molecular biological research, e-mail: Svetlana@mail.tomsknet.ru
Semke V.Y. — academician, director, e-mail: redo@mail.tomsknet.ru
