CC BY
17
УДК 661.123 :+ 582.272
А.М. Рогов, И.А. Кадникова, Н.М. Аминина
ВЛИЯНИЕ ФЕРМЕНТНОЙ ОБРАБОТКИ САХАРИНЫ ЯПОНСКОЙ НА ЕЕ ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ
Определена альгиназная активность ферментных комплексов из внутренностей Strongylocentrotus intermedius и Cucumaria japonica. Установлено гидролитическое действие ферментных комплексов из внутренностей иглокожих на полисахариды сахарины японской при рН 8. Обнаружены различия ферментного гидролиза основных соединений водоросли при температуре 30-45°С. Изучено влияние ферментной обработки сахарины на ее химический состав.
Ключевые слова: сахарина японская, альгиназная активность, ферментный комплекс, внутренности, иглокожие, химический состав.
A.M. Rogov, I.A. Kadnikova, N.M. Aminina
INFLUENCE OF ENZYME TREATMENT OF SACCHARINA JAPONICA ON ITS CHEMICAL COMPOSITION
The alginase activity of the enzyme complexes of Strongylocentrotus intermedius and Cucumaria japonica viscera was determinated. The hydrolytic action of the enzyme complexes of the echinoderm innards on Saccharina japonica polysaccharides at pH 8 was established. The differences of the enzymatic hydrolysis of basic compounds of the algae at 30-45 0C were detected. The effect of S.japonica enzyme treatment on its chemical composition was studied.
Key words: Saccharina japonica, alginase activity, enzyme complex, viscera, echinoderms, chemical composition.
DOI: 10.17217/2079-0333-2016-38-44-50
Сахарина японская - это важный элемент питания не только для человека, но и для различных морских животных. Она является источником незаменимых для развития организмов веществ: редких микроэлементов и аминокислот, пигментов, полисахаридов и других биологически активных соединений. При этом большая часть полисахаридов и белков малодоступна или совершенно недоступна пищеварительным ферментам человека и животных. В связи с этим при разработке продукции из водорослевого сырья возникает проблема усвоения питательных веществ водорослей и ведется поиск ферментов для расщепления белково-полисахаридного комплекса морских водорослей.
Современный уровень развития биотехнологии показывает, что ферментация - это наиболее эффективный способ обработки морского растительного сырья для получения продукции (пищевой, БАВ, кормовых добавок), где будут сохраняться биологически активные компоненты (аминокислоты, минеральные вещества, олигосахариды). Ферментированные продукты из водорослей являются также идеальными для питания личинок и молоди креветки, трепанга, моллюсков [1-4].
В связи с вышеизложенным целью работы являлось исследование влияния ферментативной обработки на химический состав сахарины для получения кормовых продуктов для марикультуры.
Материалы и методы исследований
В качестве исходного материала для исследований использовали водоросль - сахарину японскую Saccharina japonica, добытую в июле 2015 г.; внутренности серого ежа Strongylocentrotus intermedius, собранного в апреле 2015 г.; внутренности кукумарии японской Cucumaria japonica, выловленной в июле 2015 г.
При выполнении исследований химического состава водорослей использовали стандартные методы [5]. В образцах водорослей определяли содержание воды, минеральных веществ, альги-новой кислоты. Общее содержание углеводов определяли антроновым методом [6]. Альгиназ-ную активность ферментных комплексов определяли колориметрическим методом по количеству образовавшихся восстанавливающихся сахаров [7].
Результаты и их обсуждение
Ранее проведенные исследования состава сахарины японской показали, что основным субстратом для действия ферментов являются углеводы, в первую очередь это альгиновая кислота и клетчатка [8]. Деструкция полисахаридов под действием ферментов уменьшает содержание высокомолекулярных соединений, мешающих усвоению корма из сахарины молодью трепанга, что позволит использовать этот доступный вид водоросли для организации промышленного производства кормов [9-12]. Использование промышленных форм ферментных препаратов для обработки сахарины сдерживается их активностью по отношению к расщепляемому субстрату. По литературным данным основные пищеварительные ферменты иглокожих, в частности Сысытапа japónica и Strongylocentrotus intermedius, способны осуществлять деструкцию полисахаридов сахарины и относятся к классам лиаз и гидролаз [13,14].
Внутренности иглокожих нами рассматривались как единая ферментная система, обладающая определенной активностью, которая оказывает влияние на проведение технологического процесса по обработке водорослей. Химический состав внутренних органов кукумарии и морского ежа представлен в табл. 1.
Таблица 1
Химический состав внутренних органов промысловых иглокожих
Сырье Соде ржание, %
воды белка липидов минеральных веществ
Сысытапа japónica 88,6 4,0 2,6 3,4
Strongylocentrotus intermedius 80,3 11,7 3,6 1,0
Комплекс ферментов из мороженых внутренностей серого ежа и кукумарии японской получали по схеме, представленной на рис. 1.
Рис. 1. Схема выделения ферментного комплекса из мороженых внутренностей иглокожих
Экстракция проводилась фосфатным буфером при соотношении 1 : 0,5 (внутренности : буфер), в течение 8 ч при температуре 3±1°С и значениях рН от 5 до 8. В результате проведенных экспериментов были получены по четыре экстракта ферментов из каждого вида внутренностей. Во всех полученных образцах определяли альгиназную активность (АА). В качестве субстрата использовали 0,1%-ный раствор альгината натрия. За единицу активности принимали количество фермента, которое катализировало образование 1 мкмоля восстанавливающихся сахаров (в пересчете на галактуроновую кислоту) за 1 ч.
Самую высокую АА показал комплекс ферментов, полученный из внутренностей морского ежа при рН 7, наиболее низкую - при рН 8. Обнаружено два пика активности системы ЖКТ ежа при кислой и нейтральной рН.
Цц/мл 600,0
500,0
400,0
300,0
200,0
100,0
0,0
-а - Экстракт из внутренностей серого морского ежа -•—Экстракт из внутренностей кукумарии
N
\
\
\
Ч
\
рН 5
рН 6
рН 7
рН 8
Рис. 2. Альгиназная активность ферментной системы внутренних органов иглокожих
При анализе внутренностей кукумарии японской обнаружено, что максимальную АА имеет ферментный комплекс, выделенный при рН 8, минимальную - при рН 6. С увеличением рН среды в щелочную область АА комплекса увеличивается. Для выделения комплекса альгинолитических ферментов из внутренних органов Cucumaria japonica рекомендовано рН экстрагента, равное 8 (рис. 2).
В результате исследований показано различие в активности ферментов ЖКТ у разных классов иглокожих: АА комплекса ферментов, выделенных из внутренностей серого ежа, выше по сравнению с АА ферментов ЖКТ Cucumaria japonica.
Ферментные комплексы, выделенные из иглокожих, использовали для обработки сахарины. Измельченные водоросли заливали 0,2 М фосфатным буфером с рН от 5 до 8 и гидромодулем (ГМ) 1 : 10 (водоросль : буфер) (при обработке ферментным комплексом из морского ежа), и 1 : 15 (при обработке ферментным комплексом из кукумарии). После этого добавляли 1,5 мл экстрактов ферментов на 1 г водоросли. Гидролиз проводили при 30°С и 45°С (рис. 3).
Сухая сахарина
Ферментированная сахарина
Рис. 3. Общая схема обработки сахарины ферментными комплексами из внутренностей Cucumaria japonica и Strongylocentrotus intermedius
Для оценки степени ферментолиза был изучен химический состав сахарины до и после ее обработки ферментным комплексом. После обработки водорослей комплексом из внутренностей кукумарии основные изменения происходят в количественном составе углеводов (рис. 4). С увеличением рН в щелочную область возрастает степень гидролиза альгиновой кислоты, ее количество уменьшается в 2,2 раза. Содержание легкогидролизуемых полисахаридов (ЛГП) в обработанных образцах увеличивается и находится на уровне 18,0-20,1% (рис. 4, а, б). Одновременно происходит гидролиз клетчатки и деструкция фукоидана. Концентрация фукои-
дана в сахарине уменьшается в 4,9 раза, а содержание клетчатки снижается до уровня 5,5-7,5%. %
40 35 30 25 20 15 10 5 0
а
до обработки
рН5
рН6
рН7
рН8
%
40 п
30 25 20 15 10 5 0
до обработки
рН5
рН6
рН7
рН8
1 ЛГП И Клетчатка ■ Альгиновая к-та ИФукоидан И Азотистые в-ва П Минеральные в-ва
Рис. 4. Изменения химического состава сахарины после обработки ферментным комплексом из внутренностей Cucumaria japónica: а - обработка при 30°С; б - обработка при 45°С
35
б
При температуре обработки 45°С гидролиз клетчатки идет сильнее, чем при 30°С, содержание ее уменьшается до 4,5%. Быстрее также происходит деструкция фукоидана, одновременно отмечается рост содержания ЛГП. Однако гидролиз основного компонента сахарины - альгино-вой кислоты, при температуре обработки 45°С проходит слабее, чем при 30°С (рис. 4, б).
Аналогичные закономерности наблюдаются при обработке сахарины ферментным комплексом из внутренностей Strongylocentrotus intermedius. С повышением рН от 5 до 8 в водоросли быстрее происходит деструкция полисахаридов: в 2,3 раза уменьшается содержание альгиновой кислоты, в 2,5 раза - клетчатки. При этом увеличивается содержание ЛГП (рис. 5, а).
%
40 -| 35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 -
0
до обработки
рН5
рН6
рН7
рН8
%
45 п 40 35 -30 -25 20 -15 10 -5 0
I
до обработки
рН5
рН6
рН7
рН8
■ ЛГП и Клетчатка ШАпьгиновая к-та ПФукоидан ■ Азотистые в-ва □ Минеральные в-ва
а
б
Рис. 5. Изменения химического состава сахарины после обработки ферментным комплексом из внутренностей Strongylocentrotus intermedius: а - обработка при 30°С; б - обработка при 45°С
С увеличением температуры обработки до 45°С гидролиз альгиновой кислоты усиливается, ее содержание уменьшается в 3,6 раза по сравнению с обработкой при температуре 30оС. Количество ЛГП увеличивается до 22,8% за счет перехода в эту категорию части альгиновой кислоты после ферментного гидролиза (рис. 5, б).
Количество азотистых и минеральных веществ во всех образцах сахарины после обработки увеличивается, по-видимому, за счет внесения ферментного комплекса (рис. 5, а, б).
На основании проведенных исследований установлено, что наиболее активным гидролитическим действием на чистый альгинат обладают ферментные комплексы из внутренностей Strongylocentrotus intermedius при рН 5, из внутренностей Cucumaria japonica - при рН 8.
При использовании в качестве субстрата сахарины японской нами было подтверждено более сильное действие на состав ее полисахаридов ферментных комплексов из внутренностей иглокожих при рН 8. Обнаружены различия ферментного гидролиза основных соединений водоросли при разных значениях температуры. В результате рекомендовано проводить обработку сахарины комплексом ферментов из внутренностей Cucumaria japonica при рН 8, гм 1 : 15, температуре 30°С, 24 ч, из внутренностей Strongylocentrotus intermedius - при рН 8, гм 1 : 10, температура 45°С, 24 ч.
Литература
1. Ashida T., Okimasu E., Amemura A. Effects of a femented vegegable product on hemolysis and lipid peroxidation of Japanese flounder erythrocytes // Fish. Sci. - 2002. - V. 68. - P. 1324- 1329.
2. Ashida T., Okimasu E. Immunostimulatory effects of fermented vegetable product on the nonspecific immunity of Japanese flounder Paralichthys olivaceus // Fish Sci. - 2005. - V. 71. -P.257-262.
3. The dietary effects of a fermented vegetable product on glutatthione peroxidase activity and lipid peroxidation of Japanese flounder Paralichthys olivaceus / T. Ashida, Y. Takei, M. Takagaki, Y. Matsuura, E. Okimasu // Fish. Sci. - 2006. - V. 72. - P. 179-184.
4. The influence of diets containing dried bivalve feces and/or powdered algae on growth and energy distribution in sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) (Echinodermata: Holothuroidea) / X Yuan, H. Yang, Y. Zhou, Y. Mao, T. Zhang , Y. Liu //Aquaculture. - 2006. - V. 256. - P. 457-467.
5. ГОСТ 26185-84 Водоросли морские, травы морские и продукты их переработки. Методы анализа. - Введ. 01.01.85. - М: Изд-во стандартов, 1984. - 53 с.
6. ГОСТ 26176-91 Корма, комбикорма. Методы определения растворимых и легкогидроли-зуемых углеводов. - Введ. 01.01.93. - М.: Стандартинформ, 2011. - 10 с.
7. Гамаюрова В.С., Зиновьева М.Е. Ферменты. Лабораторный практикум: учеб. пособие. -СПб.: Проспект Науки, 2011. - 256 с.
8. Рогов А.М., Кадникова И.А., Аминина Н.М. Исследование влияния ферментативной обработки морских водорослей Saccharina japonica на ее химический состав // Химия и технология новых веществ и материалов: тезисы докладов Всероссийской молодежной науч. конф. (26-30 мая 2014). - Сыктывкар, 2014. - С.171- 173.
9. Рассказов В.А. Ферменты морских организмов и перспективы их использования в медицине и биотехнологии // Вестник ДВОРАН. - 2014. - № 1. - С. 61-68.
10. Полисахариды бурых водорослей и ферменты морских организмов, катализирующие их превращения. Перспективы создания БАД и лекарств на основе полисахаридов и продуктов их трансформации / Т.Н. Звягинцева, М.И. Кусайкин, С.П. Ермаков, Н.М. Шевченко // Исследования природных соединений в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова. -Владивосток: Дальнаука, 2013. - 186 с.
11. Перцева А.Д. Сравнительная характеристика активности ферментов тканей трепанга и кукумарии // Научные труды Дальрыбвтуза. - 2015. - Т. 37. - С. 135-138.
12. Богатыренко Е.А. Потенциальные пробиотики дальневосточного трепанга Apostychopus japonicus, продуцирующие пищеварительные ферменты // Микробиология. - 2010. - Т. 79. -№ 2. - С. 193-198.
13. Ферменты из морских организмов. Основные свойства и перспективы их использования /
B.А. Рассказов, Т.Н. Звягинцева, В.В. Сова, Л.А. Елякова // Вестник ДВОРАН. - 1999.- № 4. -
C. 56- 66.
14. Агаркова В.В. Биохимические основы биотических взаимоотношений серого морского ежа Strongylocentrotus intermedius и бурой водоросли Laminaria japonica: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Владивосток, 2007. - 20 с.
Информация об авторах Information about authors
Рогов Александр Максимович - Тихоокеанский рыбохозяйственный научно-исследовательский центр; 690091, Россия, Владивосток; младший научный сотрудник лаборатории безопасности и качества морского растительного сырья; aleksandr.rogov@tinro-center.ru
Rogov Aleksandr Maksimovich - Pacific Scientific Research Fisheries Centre; 690091, Russia, Vladivostok; Junior Researcher of Seaweed Raw Material Safety and Quality Laboratory; aleksandr.rogov@tinro-center.ru
Кадникова Ирина Арнольдовна - Тихоокеанский рыбохозяйственный научно-исследовательский центр; 690091, Россия, Владивосток; доктор технических наук, старший научный сотрудник, ведущий научный сотрудник лаборатории безопасности и качества морского растительного сырья; kadnikova@tinro.ru
Kadnikova Irina Arnoldovna - Pacific Scientific Research Fisheries Centre; 690091, Russia, Vladivostok, Doctor of Technical Sciences; Senior Scientist, Leading Researcher of Seaweed Raw Material Safety and Quality Laboratory; kadnikova@tinro.ru
Аминина Наталья Михайловна - Тихоокеанский рыбохозяйственный научно-исследовательский центр; 690091, Россия, Владивосток; кандидат биологический наук, заведующая лабораторией безопасности и качества морского растительного сырья; aminina@tinro.ru
Aminina Natalya Mikhailovna - Pacific Scientific Research Fisheries Centre; 690091, Russia, Vladivostok; Candidate of Biological Sciences; Senior scientist, Head of Seaweed Raw Material Safety and Quality Laboratory; aminina@tinro.ru
