CC BY
73
УДК 618.11-089.87-089.168.1-06:616.151.4-085:615.273.2]-092.9:57.084.1
ВЛИЯНИЕ ЭТИНИЛЭСТРАДИОЛА НА РЕОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КРОВИ И ГЕМОСТАЗ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ОВАРИОЭКТОМИИ
Анна Марковна АНИЩЕНКО1, Олег Ибрагимович АЛИЕВ1, Татьяна Макаровна ПЛОТНИКОВА2
1 ФГБУ НИИ фармакологии СО РАМН 634028, г. Томск, ул. Ленина, 3
2 ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России 634050, г. Томск, Московский тракт, 2
Этинилэстрадиол при курсовом введении (25 мкг/кг внутрижелудочно в течение 14 дней) у крыс после оварио-эктомии уменьшает повышенную вязкость крови на 4-11 % за счет улучшения реологических свойств эритроцитов, а также в результате снижения гематокрита и уровня фибриногена в плазме. Препарат уменьшает эндо-телиальную дисфункцию, но при этом повышает коагуляционные свойства крови, увеличивая АДФ-зависимую агрегацию тромбоцитов и способствуя формированию тромба в сосуде при его инициации раствором хлорида железа.
Ключевые слова: этинилэстрадиол, овариоэктомия, вязкость крови, деформируемость и агрегация эритроцитов, агрегация тромбоцитов, гемостаз, эндотелиальная дисфункция.
Климактерический период у женщин продолжается около 25-30 лет, является переходной ступенью от репродуктивного периода к старости и характеризуется гормональными сдвигами, связанными со старением яичников [9]. Обусловленное этим быстрое снижение уровня циркулирующих в крови эстрогенов является пусковым механизмом для развития многих вегетативных и психоэмоциональных симптомов, которые наблюдаются у большинства женщин и резко снижают качество жизни. Для лечения синдрома дефицита эстрогенов, обусловленного естественной или искусственной менопаузой, применяют гормональную заместительную терапию (ГЗТ). Отмечен положительный эффект ГЗТ при лечении больных климактерическим синдромом в отношении вегетососудистых расстройств, метаболических сдвигов в виде гиперлипидемии, инсулинорезистентности и остеопороза [4, 9]. Вместе с тем исследования эффективности ГЗТ, проведенные с позиций доказательной медицины, свидетельствуют о неэффективности данного вида терапии в качестве первичной и вторичной профилактики сердечно-сосудистых осложнений климактерического синдрома [13]. Это диктует необходимость дальнейшего изучения преимуществ и риска гормональной терапии. Комплексный анализ влияния ГЗТ на основные факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний при кли-
мактерическом синдроме у женщин весьма затруднен, поскольку помимо гипоэстрогенемии на показатели могут оказывать влияние возраст (наступление естественной менопаузы колеблется в пределах 10 лет), индекс массы тела, курение, наличие или отсутствие сопутствующих заболеваний (диабет, гиперлипидемия и др.) [10].
Неоднозначность эффектов и сложность комплексного анализа влияния ГЗТ на факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний при климактерическом синдроме явились основанием для оценки эффектов этинилэстрадиола в опытах на линейных крысах при экспериментальной овариоэктомии по сравнению с показателями у ложнооперированных животных одинакового возраста и массы тела.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Эксперименты проведены на 74 аутбредных самках крыс Вистар массой 320-380 г, полученных из клиники лабораторных животных НИИ фармакологии СО РАМН (г. Томск). Животных содержали в стандартных условиях вивария при естественном освещении, свободном доступе к воде и пище. Исследования выполняли в соответствии с рекомендациями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств» [8]. Удаление
Анищенко А.М. - к.м.н., научный сотрудник лаборатории фармакологии кровообращения Алиев О.И. - д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории фармакологии кровообращения Плотникова Т.М. - д.б.н., проф. кафедры фармакологии, [email protected]
яичников осуществляли под эфирным наркозом по общепринятой методике [5]. Крысы, у которых проводили лапаротомию и ушивали рану, составили группу ложнооперированных животных. Этинилэстрадиол вводили внутрижелудочно в дозе 25 мкг/кг в 1 % крахмальной слизи ежедневно в течение 14 дней, начиная с 8-х суток после овариоэктомии. Контрольные животные получали эквиобъемное количество 1 % крахмальной слизи. На 21-е сутки эксперимента через 2 часа после последнего введения этинилэстрадиола у животных под эфирным наркозом забирали кровь для исследования. В пробах крови определяли содержание эстрадиола иммуноферментным методом с помощью набора EIAlgen Estradiol (Adaltis Italia S.p.A., Италия) на иммуноферментном анализаторе «Униплан» (ЗАО «Пикон», г. Москва). В этих же пробах оценивали гемореологические показатели в соответствии с методическими рекомендациями по изучению веществ, влияющих на реологические свойства крови [6]. Индекс эффективности транспорта кислорода в ткани рассчитывали как отношение гематокрита к вязкости крови при различных скоростях сдвига [11].
Исследование показателей свертывающий системы крови проводили на коагулометре KG-4 (Cormay, Польша). Определение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) и протромбинового времени свертывания проводили с помощью наборов «АЧТВ-тест» и «Техпластин-тест» («Технология - стандарт», Россия). Агрегацию тромбоцитов в стандартизованной богатой тромбоцитами плазме определяли нефелометрическим методом [1]. В качестве индуктора агрегации использовали аденозиндифос-фат (АДФ) в конечной концентрации 4 х 10 -6 М.
Формирование тромба в сонной артерии крыс, наркотизированных уретаном (1 г/кг), инициировали аппликацией на сосуд 10 % раствора FeCl2, отмечали степень снижения и время полной остановки кровотока в стенозированном сосуде. Величину кровотока по сосуду регистрировали с помощью электромагнитного расходомера крови MFV-1100 (Nihon Kohden, Япония). Через сутки осуществляли изъятие участка сосуда, на который воздействовали раствором FeCl2, тромб выделяли и взвешивали.
Для оценки эндотелийзависимой и эндоте-лийнезависимой вазодилатации регистрировали артериальное давление после внутривенного введения соответственно ацетилхолина (5 мкг/кг) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг). Рассчитывали площади над кривой реакции артериального давления. Коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) оценивали как отношение реакции на нитропруссид натрия к реакции на ацетилхо-лин [3].
Данные представлены в виде M ± m, где M - среднее значение, m - стандартная ошибка среднего значения. Для оценки достоверности межгрупповых различий использовали непараметрический критерий Манна - Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Овариоэктомия вызывала снижение уровня эстрадиола в крови половозрелых самок крыс с 43,8 ± 1,3 до 17,6 ± 1,5 пг/мл (на 60 %). Вязкость крови у крыс этой группы по сравнению с лож-нооперированными животными увеличилась на 7-18 % при всех исследованных скоростях сдвига (см. рисунок). Для оценки вклада изменений
10-1
О ей Я- +о, \*
I8
IS я
1
¡3 6-
U о
2 СО
д
4-
...............—
3 5 7 10
п—I—I I I I 1111 мши — 50 100
Т-1—гтп
300
Скорость сдвига, с
-1
et «10-
«
т
g
&
ч
и
е § б
о
ложнооперированные
контроль
этинилэстрадиол
30
"Г
т
60 90
Too
Скорость сдвига, с"
-1
Рис. Влияние этинилэстрадиола (25 мкг/кг внутрижелудочно) на вязкость крови (а) и доступность кислорода для тканей (б) у крыс после овариоэктомии
Примечание. Здесь и в табл. 2 обозначены статистически значимые (р < 0,05) отличия от соответствующих показателей: * - ложнооперированных животных, + - крыс после овариоэктомии.
Таблица 2
Влияние этинилэстрадиола (25 мкг/кг, внутрижелудочно в течение 14 дней) на коагуляционные
свойства крови крыс после овариоэктомии
Таблица 1
Влияние этинилэстрадиола (25 мкг/кг, внутрижелудочно в течение 14 дней) на коэффициент эндотелиальной дисфункции и гемореологические показатели у крыс после овариоэктомии
Показатель Ложнооперированные (n = 8) Контроль (овариоэктомия) (П = 9) Овариоэктомия + этинилэстрадиол (n = 9)
КЭД, отн. ед. 2,06 ± 0,09 3,42 ± 0,34* 2,46 ± 0,35+
Гематокрит, % 43 ± 1 46 ± 1* 42 ± 1+
Полупериод агрегации 21 ± 2 14 ± 2* 19 ± 1+
эритроцитов, с
ИДЭ, отн. ед.
90 с-1 0,161 ± 0,009 0,158 ± 0,010 0,184 ± 0,011
180 с-1 0,201 ± 0,009 0,188 ± 0,009 0,214 ± 0,009+
360 с-1 0,262 ± 0,013 0,222 ± 0,007* 0,265 ± 0,009+
890 с-1 0,310 ± 0,011 0,282 ± 0,007* 0,324 ± 0,010+
Показатель Ложнооперированные (n = 7) Контроль (овариоэктомия) (n = 6) Овариоэктомия + этинилэстрадиол (n = 9)
Содержание фибриногена, г/л 2,4 ± 0,4 3,3 ± 0,2* 2,5 ± 0,3+
АЧТВ, с 18,3 ± 1,0 16,1 ± 1,3 17,3 ± 1,1
Протромбиновое время, с 13,4 ± 1,0 14,3 ± 0,5 14,6 ± 1,1
Амплитуда агрегации тромбоцитов, % 38 ± 2 41 ± 1 43 ± 3*
различных гемореологических параметров в повышение вязкости крови при постовариоэктоми-ческом синдроме определяли полупериод агрегации и индекс деформируемости эритроцитов (ИДЭ). ИДЭ при высоких скоростях сдвига (360 и 890 с-1) у крыс после удаления яичников был достоверно ниже, чем у ложнооперированных животных на 18 и 10 % соответственно, а полупериод агрегации эритроцитов уменьшался на 33 % (табл. 1), что свидетельствует о повышении их агрегационной активности. Помимо влияния на клеточные параметры, овариоэктомия приводила к изменению и плазменных факторов, определяющих вязкость крови - повышению гематокрита и уровня фибриногена на 7 и 38 % соответственно (табл. 1, 2).
Следовательно, у животных на фоне гипо-эстрогенемии, вызванной овариоэктомией, наблюдалось существенное повышение вязкости крови в результате увеличения гематокрита, содержания фибриногена в плазме крови, а также нарушения вязкоэластических свойств эритроцитов и возрастания их агрегационной активности. У женщин в
постменопаузальный период также отмечено повышение агрегации эритроцитов, фибриногена, гематокрита [12]. Условия эксперимента - модель овариоэктомии на линейных животных, - исключающие влияние на гемореологический статус возраста, индекса массы тела, сопутствующих заболеваний, курения, позволяют считать гипо-эстрогенемию основным фактором, вызывающим выявленные нами сдвиги параметров реологии крови и формирующим синдром повышенной вязкости крови. В свою очередь повышение вязкости крови уменьшало эффективность доставки кислорода тканям (см. рисунок), что является фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний в условиях гипоэстрогении [12].
Через 14 дней после овариоэктомии у крыс не отмечено достоверных изменений показателей тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза (см. табл. 2). КЭД у животных этой группы был на 66 % выше, чем у ложнооперированных крыс (см. табл. 1). Инициация тромбообразования в сонной артерии овариоэктомированных крыс аппликацией 10 % раствора хлорида железа при-
водила к полной остановке кровотока в среднем к 60-й минуте эксперимента. Тромб сохранялся и на следующие сутки после воздействия, и его средняя масса составляла 0,5 мг.
У овариоэктомированных крыс, получавших этинилэстрадиол, уровень эстрадиола достигал значений этого показателя у ложнооперирован-ных животных (43,5 ± 0,4 пг/мл). Устранение ги-поэстрогенемии приводило к повышению ИДЭ при скоростях сдвига 180-890 с1 на 14-19 % и увеличению полупериода агрегации эритроцитов на 36 % по сравнению с животными, не получавшими гормональное средство (см. табл. 1). Улучшение вязкоэластических свойств эритроцитов и, как следствие, нормализация показателей клеточной реологии крови при овариоэктомии обусловлены способностью этинилэстрадиола ограничивать процессы перекисного окисления липидов, восстанавливать соотношение липидов и белка, снижать повышенный уровень лизофосфолипи-дов в мембранах эритроцитов овариоэктомиро-ванных крыс [7]. Этинилэстрадиол достоверно снижал и плазменные показатели вязкости крови - гематокрит и уровень фибриногена соответственно на 9 и 24 % по сравнению со значениями у крыс контрольной группы (см. табл. 1, 2). Следствием этих эффектов этинилэстрадиола было уменьшение повышенной при гипоэстрогенемии вязкости крови на 4-11 % при всех исследованных скоростях сдвига. Вместе с тем этинилэстрадиол достоверно не увеличивал эффективность транспорта кислорода тканям (см. рисунок), вероятно, в результате снижения гематокрита (см. табл. 1).
Влияние этинилэстрадиола на сосудисто-тромбоцитарное и плазменное звенья гемостаза в условиях овариоэктомии было неоднозначным. Агрегация тромбоцитов повышалась на 13 % по сравнению со значениями у ложноопериро-ванных животных, а КЭД снижался на 28 % по сравнению со значениями у крыс, не получавших лечения (см. табл. 1, 2). Изученные распространенные показатели плазменного гемостаза при 14-дневном введении этинилэстрадиола существенно не изменялись (см. табл. 2). Следовательно, прокоагулянтные изменения, вызываемые этинилэстрадиолом при экспериментальной ова-риоэктомии, проявились в основном умеренной активацией сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза. Наличие эндотелийпротективной и антиоксидантной активности этинилэстрадиола [7], вероятно, «смягчает» инициированную эти-нилэстрадиолом агрегацию тромбоцитов и, как следствие, прокоагулянтный эффект эстрогенов.
Оценка влияния этинилэстрадиола на баланс про- и антигемостатических реакций при овари-
оэктомии осуществлялась на основе метода регистрации времени тромбообразования в сосуде после его инициации раствором хлорида железа. Воспроизведение тромбоза у овариоэктомиро-ванных животных после курсового применения этинилэстрадиола сопровождалось полным прекращением кровотока по сосуду к 5-й минуте эксперимента (в контроле - к 60-й минуте), в сте-нозированных сосудах формировались тромбы, масса которых через сутки составила в среднем 0,64 мг, что достоверно выше показателя контрольной группы на 28 %. Следовательно, баланс анти- и протромбогенных участников системы гемостаза при применении этинилэстрадиола в условиях экспериментального гипоэстрогенеми-ческого синдрома смещен в пользу последних.
Таким образом, этинилэстрадиол при его курсовом введении крысам в условиях овариоэкто-мии неоднозначно влияет на вязкостные и коа-гуляционные свойства крови. Этинилэстрадиол, устраняя гипоэстрогению, снижает повышенную вязкость крови, уменьшает эндотелиальную дисфункцию, но при этом увеличивает агрегацион-ную активность тромбоцитов и ускоряет формирование тромба в сосудах при его инициации раствором хлорида железа, что снижает терапевтическую ценность гормональной терапии в профилактике и лечении сердечно-сосудистых осложнений эстрогендефицитных состояний.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Этинилэстрадиол при экспериментальной овариоэктомии уменьшает повышенную вязкость крови как за счет улучшения реологических свойств эритроцитов, так и в результате снижения гематокрита и уровня фибриногена в плазме, но при этом не повышает эффективность доставки кислорода тканям. Этинилэстрадиол при гипо-эстрогенемии, вызванной удалением яичников у крыс, уменьшает эндотелиальную дисфункцию, повышает коагуляционные свойства крови, увеличивая АДФ-зависимую агрегацию тромбоцитов и способствуя формированию тромба в сосуде при его инициации раствором хлорида железа.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Баркаган З.С., Момот А.П. Основные методы лабораторной диагностики нарушений системы гемостаза. Барнаул, 1998. 10-11.
2. Бышевский А.Ш., Галян С.Л., Ральченко И.В. и др. Влияние комбинации витаминов-антиоксидан-тов на гемостаз при экспериментальной гипероксидации // Тромбоз, гемостаз, реология. 2005. 68. (3). 34-36.
3. Галаган М.Е., Широколова А.В., Ванин А.Ф. Гипотензивное действие оксида азота, продуцируемого из экзо- и эндогенных источников // Вопр. мед. химии. 1991. 37. (1). 67-70.
4. Доброхотова Ю.Э. Менопаузальный синдром. М.: РГМУ, 2005. 2-24.
5. Киршенблат Я.Д. Практикум по эндокринологии. М., 1969. 55-57.
6. ПлотниковМ.Б., Алиев О.И., Плотникова Т.М. Методические подходы к изучению веществ, влияющих на реологию крови // Эксперим. клинич. фар-макол. 2011. 74. (12). 36-40.
7. Плотникова Т.М., Шульгау З.Т., Плотникова А.М. и др. Влияние экстракта маакии амурской на липидный спектр и перекисное окисление липи-дов в мембранах эритроцитов при овариоэктомии у крыс // Эксперим. клинич. фармакол. 2008. 71. (6). 28-30.
8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств. М., 2005. 832 с.
9. Сметник В.П. Климактерические расстройства и методы их коррекции // Consilium medicum. 2007. 9. (6). 65-70.
10. Pignon B., Jolly D., Patron G. Erythrocyte aggregation-determination of normal values. Influence of age, sex, hormonal state, oestroprogestative treatment, haematological parameters and cigarette smoking // Nouv. Rev. Fr. Hematol. 1994. 36. (6). 431439.
11. Stoltz J.E., Donner M. New trends in clinical hemorheology: an introduction to the concept of the hemorheological profile // Schweiz. Med. Wochenschr. 1991. 43. 41-49.
12. Vaya A., Chorro P., Julia D. et al. Menopause, hormone replacement therapy and hemorheology // Clin. Hemorheol. Microcirc. 2004. 30. 277-281.
13. Writing Group for the Women's Health Initiative Investigators. Risk and benefit of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women: principal results from the Women's Health Initiative randomizes controlled trail // JAMA. 2002. 288. 321-333.
INFLUENCE OF ETHINYLESTRADIOL ON RHEOLOGICAL PROPERTIES OF BLOOD AND HEMOSTASIS IN EXPERIMENTAL OVARIECTOMY
Anna Markovna ANISHCHENKO1, Oleg Ibragimovich ALIEV1, Tatyana Makarovna PLOTNIKOVA2
1 Research Institute of Pharmacology of SB RAMS 634028, Tomsk, Lenin str., 3
2 Siberian State Medical University of Minzdrav of Russia 634050, Tomsk, Moscowsky tract, 2
Ethinylestradiol at the course introduction (25 mcg/kg intragastrically during 14 days) reduced blood viscosity by 4-11 % in rats after ovariectomy. This effect was due to improvement of rheological properties of red blood cells and reduction of hematocrit and fibrinogen levels in plasma. Ethinylestradiol reduced endothelial dysfunction but increased the ADP-dependent platelet aggregation and accelerated the intervascular thrombosis forming after its initiation by FeCl2 solution.
Key words: ethinylestradiol, ovariectomy, blood viscosity, erythrocyte deformability, erythrocyte aggregation, platelet aggregation, hemostasis, endothelial dysfunction.
Anishchenko A.M. - candidate of medical sciences, researcher of laboratory of circulation pharmacology
Aliev O.I. - doctor of medical sciences, leading researcher of laboratory of circulation pharmacology
Plotnikova T.M. - doctor of biological sciences, professor of the chair for pharmacology, e-mail: [email protected]
