Влияние эпидермального фактора роста на процессы регенерации грануляционной ткани в послеоперационной полости височной кости, полученной в ходе санирующей операции на среднем ухе по открытому типу Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-1-128-133

УДК 616.284.7-089.874

ВЛИЯНИЕ ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА НА ПРОЦЕССЫ РЕГЕНЕРАЦИИ ГРАНУЛЯЦИОННОЙ ТКАНИ В ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОЙ ПОЛОСТИ ВИСОЧНОЙ КОСТИ, ПОЛУЧЕННОЙ В ХОДЕ САНИРУЮЩЕЙ ОПЕРАЦИИ НА

СРЕДНЕМ УХЕ ПО ОТКРЫТОМУ ТИПУ

Огнетов С.Ю., Кирьянов НА.

ФГБОУ ВО Ижевская государственная медицинская академия, г. Ижевск, Российская Федерация

Аннотация. Цель. Определить как влияет эпидермальный фактор роста на процессы регенерации грануляционной ткани в послеоперационной полости височной кости, полученной в ходе санирующей операции на среднем ухе по открытому типу. Методы. Приведены данные литературы. В исследовании участвовало 70 пациентов. Всем участникам статистического наблюдения была произведена общеполостная санирующая операция на среднем ухе (санирующая операция по открытому типу, canal wall-down). На 7 день после операции тампон удалялся из уха. На 8-ые сутки производили биопсию мягких тканей послеоперационной полости. Затем пациенты были разделены на 2 группы по 35 человек. В первой группе (основная) в послеоперационном периоде использовался эпидермальный фактор роста. Вторая группа была контрольной или группой сравнения. Во второй группе местное лечение не использовалось. На 15 день в основной группе и в группе сравнения производили биопсию мягких тканей послеоперационной полости. Использовались окраска гематоксилином и эозином, пикрофуксином и иммуногистохимическое выявление ядерного антигена ki-67, маркера мка cd 34 и виментина.

Выводы. Использование эпидермального фактора роста в послеоперационном периоде санирующей операции на среднем ухе по открытому типу значительно усиливает процессы регенерации грануляционной ткани.

Ключевые слова: эпидермальный фактор роста, санирующая операция на среднем ухе по открытому типу, грануляционная ткань.

Из года в год в медицине появляется что-то новое. В проблеме сенсоневральной тугоухости, которая, казалось, никогда не решится, появились значительные успехи благодаря генной инженерии. Пока, правда, на экспериментальном этапе. Американские ученые из Медицинского колледжа при Гарвардском университете научились восстанавливать волосковые клетки внутреннего уха. В ходе исследования ученые выявили ген (pRb), тормозящий регенерацию волосковых клеток. Опыты на мышах показали, что "выключение" этого гена способствовало активному обновлению во-лосковых клеток [1]. Эту же проблему (сенсоневраль-ная тугоухость) пытаются решить, и тоже с определенным успехом, при помощи стволовых клеток. Из этого следует, что медицинская наука не стоит на месте.

Однако проблема ранозаживления в хирургии уха по-прежнему остается нерешенной. Большинство ото-хирургов считает, что лечение хронического гнойного среднего отита с холестеатомой может быть только хирургическим. Используется санирующая операция, направленная на полноценное удаление холестеатомы. В ходе операции на месте санированных кариозных участков среднего уха формируется трепанационная

полость. Если применяется открытая методика (сапа1 wall-down), то послеоперационная полость получается открытой. Эта полость при нормальном ранозаживле-нии покрывается сначала грануляционной тканью, а потом эпидермисом. Однако полноценная эпидермиза-ция раневой поверхности в трепанационной полости височной кости наступает лишь в 65—87% случаев [2], а по данным ряда автором - 46,5% [3]. Показанием для санирующей операции на среднем ухе является наличие хронического воспаления (хронический мезотим-панит или эпитимпанит) [4], который протекает в условиях нарушенного местного иммунитета [5]. Осложняющим фактором является кариес височной кости. В ходе общеполостной санирующей операции на ухе [6] из эпитимпанума, антрума и ячеек сосцевидного отростка создается единая послеоперационная полость, которая должна подвергнуться эпидермизации. Эти структуры изначально покрыты однослойным плоским эпителием, что создает дополнительные проблемы для регенерации эпителия. Послеоперационная полость должна полностью покрыться многослойным плоским ороговевающим эпителием, чтобы в будущем избе-

—---

'Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК

~ 128 ~

жать обострений хронического процесса. Процесс репарации эпидермиса в костной полости является нетипичным и малоизученным [7,8]. Все это заставляет искать способы решения данной проблемы. Использование эпидермального фактора роста, на наш взгляд, позволяет решить эту проблему. [9]. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) был первым ростовым фактором, обнаруженным еще в 1962 г. и до сих пор рассматривается как классический представитель этих биологически активных веществ. Он состоит из 53 аминокислот, соединенных тремя дисульфидными связями, имеет молекулярный вес 6 кДа. [10] Эпидермальный фактор роста стимулирует миграцию и пролиферацию фиб-робластов, кератиноцитов, эндотелиальных и других клеток, активно участвующих в ранозаживлении, способствуя эпидермизации. Рекомбинантный эпи-дермальный фактор роста входит в состав мази «Эбер-мин» (Эбер Биотек С.А., Куба; номер регистрации П N012569/01, от 01.10.2007).

Цель исследования. Определить влияние эпи-дермального фактор роста на процессы регенерации грануляционной ткани в послеоперационной полости височной кости, полученной в ходе санирующей операции на среднем ухе по открытому типу.

Пациенты и методы исследования. В исследовании участвовало 70 пациентов, из них 37 мужчин и 33 женщины, в возрасте от 15 до 64 лет. Исследование проводилось в отделении оториноларингологии БУЗ УР "Первая республиканская клиническая больница МЗ УР". В группу исследования отбирались пациенты с диагнозом: хронический гнойный средний отит с хо-лестеатомой, кариесом кости. Всем участникам статистического наблюдения была произведена общеполостная санирующая операция на среднем ухе (санирующая операция по открытому типу, canal wall-down). Все операции выполнял один хирург, применяя стандартные методы. В ходе операции бором удалялась задняя костная стенка наружного слухового похода и латеральная стенка аттика, а также производилась ревизия барабанной полости (тимпанотомия). Холестеа-тома, грануляции и другие патологические ткани удалялись. Тимпанопластика проводилась либо одномоментно, либо вторым этапом через 6 месяцев. Из костных структур (эпитимпанум, антрум и ячейки сосцевидного отростка) формировалась единая послеоперационная полость. Затем кожа задней стенки наружного слухового прохода рассекалась и укладывалась нижним лоскутом в послеоперационную полость. После этого полость выкладывалась силиконовой пленкой и тампонировалась комочками гемостатической губки. На 7 день после операции тампон удалялся из уха. На 8-ые сутки производили биопсию мягких тканей послеоперационной полости. Затем пациенты были разделены на 2 группы по 35 человек. В первой группе

(основная) в послеоперационном периоде использовался эпидермальный фактор роста (мазь «Эбермин»). Препарат наносился в послеоперационную полость на седьмые сутки после операции на ватнике слоем 1 мм. Вторая группа была контрольной или группой сравнения. Во второй группе местное лечение не использовалось. На 15 день в основной группе и в группе сравнения производили биопсию мягких тканей послеоперационной полости. Материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (pH 7,4), осуществляли проводку на гистопроцессоре и заливали в парафин. Для гистологических и иммуногистохимиче-ских исследований изготавливали срезы толщиной 3-4 мкм. Для гистологических исследований срезы депар-афинировали, регидратировали и окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Ги-зону. Для иммуногистохимических исследований использовался непрямой двухшаговый метод, основанный на использовании немеченых первичных антител, которые после связывания с антигеном тканей выступают в роли антигена для вторичных, конъюгирован-ных с ферментом (пероксидазой хрена), антител. На начальном этапе срезы депарафинировали и регидра-тировали. Затем производилось температурное восстановление эпитопа (демаскировка антигена, HIER) в модуле предобработки Dako PTLink с помощью буферов FLEX Target Retrieval Solution, High pH и FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (Dako) при t°97°C в течение 20мин. Иммуногистохимические реакции проводили в автоматизированном режиме на иммуногистостейнере AutostainerLink48 фирмы Dako с первичными антителами к цитокератинам (Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin, clone AE1/AE3, Dako), виментину (Monoclonal Mouse Anti-Vimentin, clon V9, Dako), к ядерным антигенам (Monoclonal Mouse Anti-Human Ki67 Antigen, clone MIB-1, Dako) и антигенам эндоте-лиальных клеток (Monoclonal Mouse Anti-Human CD 34 ClassII, clone QBEnd 10, Dako). Время инкубации составило 30 мин. Результаты иммуногистохимических исследований трактовали на основании качественных и полуколичественных оценок. При этом использовали следующую схему полуколичественной оценки [11]. Интенсивность окрашивания (слабая - 1 балл, умеренная - 2 балла, выраженная - 3 балла). Количество прореагировавших клеток (менее 25% - 1 балл, 25-50% - 2 балла, более 51 % -3 балла). Итоговый балл: 0-3 - слабая степень, 4-6 баллов - умеренная степень, 7-9 баллов - выраженная степень.

Результаты и их обсуждение. В послеоперационной ране идет процесс формирования и созревания грануляционной ткани. При этом в грануляционной ткани происходит как интенсивная пролиферация кровеносных сосудов, так и мезенхимальных клеток, среди которых существенное место занимают фибробласты,

продуцирующие коллаген, необходимый для формирования полноценной соединительной ткани. На 8-е сутки после операции грануляционная ткань содержит

большое количество мелких капилляров, вокруг которых располагаются клетки преимущественно гематогенной природы - нейтрофилы, лимфоциты и др. Кол-лагеновые волокна единичны (рис 1).

Рис. 1. Созревание грануляционной ткани на 8 сутки после операции. Окраска гематоксилином и эозином. х

200

Сравнение гистологических препаратов на 15-е сутки в основной и контрольной группах показало, что при использовании эпидермального фактора роста

коллагеновые волокна располагаются более упорядо-ченно, что препятствует образованию грубого рубца

(рис.2.).

Рис. 2. 15 сутки после операции. Упорядоченное расположение коллагеновых волокон в основной группе (использование эпидермального фактора роста). Окраска пикрофуксином, х 200

Специфичным и оптимальным для широкого использования в патологоанатомической практике маркером пролиферации является антиген Кь67. Ядерный антиген Ю-67 впервые описан Gerdes и соавторами в 1983 году, он состоит из двух полипептидных цепей с молекулярной массой 345 и 395 кДа. Это основная часть нуклеарного матрикса, в течение интерфазы ассоциированная с хромосомами фазы митоза. Результат

i s

с,'

иммуногистохимического выявления антигена Кь67 представлен в виде очень четко окрашенных в темно-коричневый цвет ядер клеток [12].

Особого внимания заслуживает степень пролифе-ративной активности фибробластов в грануляционной ткани. Так, на 8 сутки после операции количество клеток, экспрессирующих К 67 не более 20% (1 балла) (рис.3).

* м -■ *#, -

л

i i

ч

*/. i

»1 - *

/

■ V

у • . « ^ *

•J. I ,' • » .

Рис. 3. 8 сутки после операции. Экспрессия К 67 в грануляционной ткани. х 100.

К 15 суткам после операции формируется соединительная ткань, клетки которой также экспрессируют К

67. Однако выраженность этого процесса без использования эбермина существенно ниже, чем с применением этого препарата (рис. 4 а, б)

Рис.4. 15-е сутки после операции. Экспрессия К 67 в клетках формирующейся соединительной ткани без использования эбермина (а, слева), и с применением препарата (б, справа). х 200.

Большое значение имеет пролиферация эндотели-альных клеток и формирование кровеносных сосудов при созревании грануляционной ткани. Так, при использовании в качестве маркера МКА CD 34, с помощью которого визуализируются эндотелиальные

клетки, можно увидеть не только плотность распределения сосудов, но и интенсивность степени экспрессии CD 34. На рисунке 3 отчетливо видно незначительная степень экспрессии CD 34 в единичных сосудах грануляционной ткани (1 балл).

' * - ' .

«к Ж , -г

V э

■■ ц

'' . -V t ■.

к ^ к ^ Д

ш

--* < * ;.■: Ч/Ч

• -Ч'ч * л Ш

Ш

- • •-< 'У* . '.'I ¿ШЛ

Рис. 5. 8 сутки после операции. Экспрессия CD 34 в стенках кровеносных сосудов в гранулционной ткани.

На 15 сутки после операции количество кровеносных сосудов в формирующейся соединительной ткани

I-* »

продолжает оставаться высоким, однако без использования эпидермального фактора роста экспрессия CD

34 существенно ниже (рис. 6 а,б)

%

I

\

I

Рис. 6. 15-е сутки после операции. Экспрессия CD 34 в стенках кровеносных сосудов в группе сравнения (а,

слева) и в основной группе (б, справа).

Одним из основных клеточных элементов созревающей грануляционной ткани является фибробласт. Эти клетки являются производными мезенхимы, а маркером их служит виментин. Оказалось, что экспрессия

I* 1. чТ*^» Жг*

виментина в созревающей грануляционной ткани на 8-е сутки после операции была невелика и ее можно обозначить в 1-2 балла (рис.4).

- ч

•-s •

vvv

• *Îv

-i44 »

■<r

ïM

m

.5 »

Рис. 7. 8 сутки после операции. Экспрессия виментина в грануляционной ткани.

г

«

4 : Щ^*

/ -

Через 15 суток после операции выраженность экспрессии виментина еще более усиливается и составляет без

эбермина 2 балл, а при использовании эбермина 5 баллов (рис. 8 а,б).

Рис. 8. 15-е сутки после операции. Экспрессия виментина в грануляционной ткани основной группы (а) и в

группе сравнения (б).

Таким образом, итоговый балл по иммуногистохи-мической оценке пролиферативной активности созревающей грануляционной ткани с использованием эпи-дермального фактора роста составил - 8 баллов. В группе сравнения этот показатель существенно ниже -пролиферативная активность созревающей соединительной ткани - 3 балла.

Вывод. Использование эпидермального фактора роста в послеоперационном периоде санирующей операции на среднем ухе по открытому типу значительно усиливает процессы регенерации грануляционной ткани.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

[1] Огнетов С.Ю., Проблемы ранозаживления в хирургии уха и способы ее решения // Вестник современной клинической медицины. 2017. Т.10 (2). С. 43-47

[2] Семенов Ф.В., Ридненко В.А., Немцева С.В. Анализ некоторых причин рецидива хронического гнойного

среднего отита в послеоперационном периоде. // Вестник оториноларингологии. 2005. №3. С.48-49

[3] Янов Ю.К., Ситников В.П., Аникин И.А. [и др.] Болезнь оперированного уха: клиническая характеристика и па-томорфологическое обоснование // Российская оториноларингология. 2005. №. 4. С.149 -154

[4] Пальчун В.Т. Оториноларингология: национальное руководство М.:ГЭОТАР-Медиа, 2008.- 960 с.

[5] Ярилин А.А. Иммунология: учебник. М.: ГЭОТАР-Ме-диа, 2010, 752 с.

[6] Тос Мирко Руководство по хирургии среднего уха. Т.2. Хирургия сосцевидного отростка и реконструктивные операции. Пер. с англ. А.В. Давыдова. под ред. А.В. Старохи Томск, Сибирский государственный медицинский университет, 2005, 436 с.

[7] Кузин М.И. Раны и раневая инфекция: Руководство для врачей. М.: Медицина, 1990. 592 с.

[8] Белоусов А. Е. Пластическая, реконструктивная и эстетическая хирургия. СПб: Гиппократ, 1998. 744 с.

■ Огнетов С.Ю., Кравчук А.П. Способ эпидермизации послеоперационной полости у пациентов, перенесших общеполостную санирующую операцию на среднем ухе // «Здоровье и образование в XXI веке». 2017. Т.19, №2. С.36-40

[10] Никитина З.К. Научно-методические основы комплексной технологии получения биологически активных веществ из рекомбинантных штаммов - продуцентов эпи-дермального фактора роста.: дис. ... д-р биол.наук Москва, 2000. 299 с.

[11] Сыдиков А.А., Заславский Д.В., Зайцев В.С., Насыров Р.А. Иммуногистохимические критерии диагностики мелкобляшечного парапсориаза, крупнобляшечного парапсориаза и грибовидного микоза // Современные проблемы науки и образования. 2013. № 6.; URL: https: //www. science-

education.ra/ru/article/view?id=10714 (дата обращения: 12.10.2017)

[12] Иммуногистохимические методы: руководство. Пер. с англ. под ред. Г.А. Франка и П.Г. Малькова // М., 2011. 224 с.

INFLUENCE OF EPIDERMAL GROWTH FACTOR ON THE PROCESSES OF REGENERATION OF GRANULATION TISSUE IN THE POSTOPERATIVE CAVITY OF THE TEMPORAL BONE OBTAINED IN THE COURSE OF A CANAL WALL DOWN MAS-

TOIDECTOMY

Ognetov S.Yu., Kiryanov N.A.

Izhevsk State Medical Academy, Izhevsk, Russian Federation

Annotation. Objective. To determine how the epidermal growth factor influences the processes of regeneration of granulation tissue in the postoperative cavity of the temporal bone, obtained during canal wall down mastoidectomy.

Methods. The literature data are presented. The study involved 70 patients. All participants in the statistical observation were subjected to a canal wall down mastoidectomy. On the 7th day after the operation, the swab was removed from the ear. On the 8th day, a soft tissue biopsy of the postoperative cavity was performed. Then the patients were divided into 2 groups of 35 people each. In the first group (main group), the epidermal growth factor was used in the postoperative period. The second group was a control group or a comparison group. In the second group, no local treatment was used. On day 15 in the main group and in the comparison group, a soft tissue biopsy of the postoperative cavity was performed. The staining with hematoxylin and eosin, picrofuxin and immunohistochem-ical detection of the nuclear antigen ki-67, mca marker cd 34 and vimentin were used.

Conclusions. The use of the epidermal growth factor in the postoperative period of canal wall down mastoidectomy significantly enhances the processes of regeneration of the granulation tissue.

Key words: canal wall down mastoidectomy, epidermal growth factor, granulation tissue.

REFERENCES

[1] Ognetov S.Yu., Problemyi ranozazhivleniya v hirurgii uha i sposobyi ee resheniya // Vestnik sovremennoy klinich-eskoy meditsinyi. 2017. T.10 (2). p. 43-47

[2] Semenov F.V., Ridnenko V.A., Nemceva S.V. Analiz nekotoryh prichin recidiva hronicheskogo gnojnogo sred-nego otita v posleoperacionnom periode. // Vestnik otori-nolaringologii. 2005. №3. p.48-49

[3] Janov Ju.K., Sitnikov V.P., Anikin I.A. [i dr.] Bolezn' operirovannogo uha: klinicheskaja harakteristika i patomorfologicheskoe obosnovanie // Rossijskaja otori-nolaringologija. 2005. №. 4. p.149 -154

[4] Pal'chun V.T. Otorinolaringologija: nacional'noe rukovod-stvo M.:GJeOTAR-Media, 2008.- 960 p.

[5] Jarilin A.A. Immunologija: uchebnik. M.: GJeOTAR-Me-dia, 2010, 752 p.

[6] Tos Mirko Rukovodstvo po hirurgii srednego uha. T.2. Hi-rurgija soscevidnogo otrostka i rekonstruktivnye operacii. Per. s angl. A.V. Davydova. pod red. A.V. Starohi Tomsk, Sibirskij gosudarstvennyj medicinskij universitet, 2005, 436 p.

[7] Kuzin M.I. Rany i ranevaja infekcija: Rukovodstvo dlja vrachej. M.: Medicina, 1990. 592 p.

[8] Belousov A. E. Plasticheskaja, rekonstruktivnaja i jestetich-eskaja hirurgija. SPb: Gippokrat, 1998. 744 p.

[9] Ognetov S.Ju., Kravchuk A.P. Sposob jepidermizacii posleoperacionnoj polosti u pacientov, perenesshih ob-shhepolostnuju sanirujushhuju operaciju na srednem uhe // «Zdorov'e i obrazovanie v XXI veke». 2017. T.19, №2. p.36-40

[10] Nikitina Z.K. Nauchno-metodicheskie osnovy kom-pleksnoj tehnologii poluchenija biologicheski aktivnyh veshhestv iz rekombinantnyh shtammov - producentov jep-idermal'nogo faktora rosta.: dis. ... d-r biol.nauk Moskva, 2000. 299 p.

[11] Syidikov A.A., Zaslavskiy D.V., Zaytsev V.S., Nasyirov R.A. Immunogistohimicheskie kriterii diagnos-tiki melkoblyashechnogo parapsoriaza, krupnoblyashechnogo parapsoriaza i gribovidnogo mikoza // Sovremennyie problemyi nauki i obrazovaniya. 2013. # 6.; URL: https://www.science-education.ru/ru/arti-cle/view?id= 10714 (data obrascheniya: 12.10.2017)

[12] Immunogistohimicheskie metody: rukovodstvo. Per. s angl. pod red. G.A. Franka i P.G. Mal'kova // M., 2011. 224 p.