CC BY
60
УДК 612.826+612.8.-009 Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011
Л. С. ГОДЛЕВСКИЙ1, Е. В. КОБОЛЕВ1, В. Ф. МУСТЯЦА2, Г. А. ДРОЗДОВА2
ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ ЧЕРВЯ МОЗЖЕЧКА НА ТИОЛ-ДИСУЛЬФИДНУЮ СИСТЕМУ ГОЛОВНОГО МОЗГА
Ёафедра биофизики, информатики и медаппаратуры Одесского государственного медицинского университета,
Украина, 65082, г. Одесса, Валиховский пер., 2;
2кафедра патологической физиологии Российского университета дружбы народов,
Россия, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6. E-mail: godlevsky@odmu.edu.ua
У крыс-самцов линии Вистар осуществляли электрические стимуляции (100 Гц) палеоцеребеллярной коры (язычок, клочок). Группой контроля служили крысы с аналогичными стимуляциями фронтальных отделов коры мозга. Показано, что под влиянием раздражений коры мозжечка происходит увеличение содержания тиоловых небелковых групп в ткани гемисфер на фоне отсутствия изменений содержания фактора некроза опухолей-альфа. Под влиянием электростимуляций также отмечалось увеличение абсорбции C14 метионина тканью вентрального гиппокампа, H3 триптофана - тканью вентрального гиппокампа, ствола мозга и «остального» мозга. Полученные данные обсуждаются с позиций активирования антиоксидантных механизмов в структурах головного мозга.
Ключевые слова: тиолы, червь мозжечка, антиоксидантные механизмы, фактор некроза опухолей-альфа, аминокислоты.
L. S. GODLEVSKY1, E. V. KOBOLEV1, V. F. MUSTYATSA2, G. A. DROZDOVA2
THE INFLUENCE OF CEREBELLAR VERMIS ELECTRICAL STIMULATION UPON BRAIN THIOL-DISULFIDE SYSTEM
department of biophysics, informatics and medical devices, Odessa state medical university,
Ukraine, 65082, Odessa, Valikhovskiy per., 2;
2department of pathological physiology, peoples friendship university of Russia,
Russia, 117198, Moscow, str. Mikluho-Maklay, 6. E-mail: godlevsky@odmu.edu.ua
Electrical stimulations (100 Hz) of paleocerebellar cortex (uvula and flocculus) were performed. The analogous stimulations of frontal cortical zones were used as a control. It was established that cerebellar irritation was resulted in the net increasing of notprotein thiol groups in hemispheral tissue without changes of tumeor necrosing factor alpha content. The increased absorbtion of C14 methionine by ventral hippocampal structures, and H3 triptophane by ventral hippocampus, brain stem and «rest» tissue of brain as well were registered under conditions of paleocerebellar electrostimulation. Gained data are discussed as those which are in favor for the increasing of antioxidant mechanisms in brain structures, as a result of paleocerebellar electrical stimulation.
Key words: thiols, cerebellar vermis, antioxidative mechanisms, tumor necrosing factor alpha, aminoacids.
Электростимуляция (ЭС) палеоцеребеллярной коры обеспечивает угнетение эпилептической активности [1, 6]. При этом развитие противосудорожного действия в существенной мере зависит от формы эпилептического синдрома, мощности эпилептиформных проявлений, а также исходного функционального состояния структур мозга [6]. Одним из факторов, определяющих указанные параметры, является выраженность перекисного окисления липидов, состояние антиоксидантных защитных систем [1, 4]. Поэтому возможным механизмом осуществления эффектов антиэпилептических воздействий, в том числе и ЭС структур мозжечка, является коррекция процессов перекисного окисления липидов в структурах мозга [1, 7]. Косвенно развитие подобных эффектов под влиянием мозжечка подтверждают данные [5], свидетельствующие о снижении провоспалительных эффектов внутристриарного применения интерлейкина 1-Р в условиях ЭС ядра шатра, в спектре действия которого важную роль играют механизмы активирования пе-рекисного окисления липидов [10].
Поэтому задачей настоящего исследования явилось определение уровня тиол-дисульфидных групп, пред-
ставляющих собой факторы антиоксидантной защиты, в структурах мозга: в гемисфере и ткани мозжечка [7] в условиях ЭС палеоцеребеллярной коры. Дополнительной задачей было изучение эффектов включения в структуры мозга метионина, обеспечивающего антиок-сидантное действие за счет усиления синтеза восстановленного глутатиона [2]. Кроме того, исследовали включение триптофана - предшественника серотонина и уровень фактора некроза опухолей-альфа, которые обладают соответственно анти- и проэпилептогенным действием [7, 9] в условиях ЭС палеоцеребеллярной коры.
Методика исследования
Исследования проведены на крысах-самцах линии Вистар массой 180-270 г, содержавшихся в 12-ч. условиях смены света и темноты, со свободным доступом к воде и пище. Крысам под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, в/бр.) вживляли под визуальным контролем биполярные электроды в область коры червя мозжечка (флоккуло-нодулярная долька). Животным контрольной группы имплантировали биполярные электроды в лобные отделы коры головного мозга. Через 10-14
дней с момента оперативного вмешательства животных использовали в эксперименте.
ЭС структур мозга. ЭС осуществляли прямоугольными импульсами с помощью электростимулятора ЭСУ-2. С целью подбора параметров интенсивности стимулирующего тока ЭС начинали при силе тока в 20-40 ^А (100 Гц, длительность 1 мс, длительность ЭС 1 с) и проводили ЭС каждые 2,5-3,0 мин. Интенсивность каждой последующей ЭС увеличивали на 20 ^А до тех пор, пока под влиянием ЭС не развивалась поведенческая реакция (поворот, замирание животного). После этого интенсивность ЭС редуцировали на 20% и использовали для дальнейших стимуляций. Таким образом, для ЭС палеоцеребеллярной коры применяли ток интенсивностью 100-180 ^А, а у крыс группы контроля (стимуляция фронтальных отделов коры мозга) интенсивность тока составила 50-120 ^А. Указанные параметры тока не вызывали нарушений/прерывания текущей двигательной активности, а также не индуцировали поведенческих реакций. С целью локализации местоположения стимулирующих электродов у крыс осуществляли электрокоагуляцию анодом постоянного тока (10,0 мА в течение 45 с), катодом служили широкие металлические электроды, располагавшиеся на задних конечностях животных.
Исследование включения аминокислот структурами мозга. За 10 мин до внутрибрюшинного применения С14-метионина или Н3-триптофана (400-1000 мкКи/ кг; уд. акт. = 55,8 кКи/моль; НО «Изотоп», Киев, Украина) с помощью электростимулятора ЭСУ-2 проводили стимуляции мозжечка. Животным контрольной группы вводили меченые аминокислоты без воздействия электрическим током. Всего в группах с введением Н3-трип-
тофана было по 5 животных, а в группе с введением С14-метионина - по 4 крысы.
Через 1 ч с момента введения аминокислот животных умерщвляли введением большой дозы пентобарби-тала (100 мг/кг) и готовили пробы ткани мозга. Подсчет радиоактивности после предварительной обработки ткани (солюбилизация и гашение хемилюминесцен-ции) осуществлялся с помощью толуол-тритонового сцинциллятора на жидкостном сцинцилляционном счетчике «1219-Rackbeta» (LKB-Wallac, США) и выражался в количестве актов распадов в секунду (или Беккерелей) на 1 мг сырой ткани мозга. Одновременно проводили верификацию локализации стимулирующих электродов.
Определение уровня фактора некроза опухолей-альфа осуществляли иммуноферментным методом (ELISA). Животных умерщвляли через 30 мин после ЭС мозжечка. Ткань мозга быстро извлекали при 4о C и замораживали на сухом льду. Гомогенаты готовили на холоде в фосфатном буферном растворе (5 г/мл), после чего их центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 минут и отбирали 100 мкл супернатанта для определения уровня цитокина, что осуществляли с помощью селективных антител («Bratrak» система «Amersham Pharmacia B^tech», Великобритания). Абсорбцию определяли спектрофотометрически при 450 нм. Точность определения составила 4,0 пг/мл. Данные выражали в пг на мг влажной ткани.
Определение уровня тиолов осуществляли методом амперометрического титрования (Хемлаб-прибор, ТУ 25-11-364-69, Украина) с помощью азотно-кислого серебра [3]. Принцип метода заключался в компенсации тиолами диффузионного электрического тока, который индуцировался Ag+ на поверхности платинового электрода.
%
400 350 300 250 200 150 100 50 0
I
II
III
IV
Влияние электрической стимуляции структур мозга на включение триптофана и метионина образованиями мозга
Примечание: по оси абсцисс: I - включение С14-метионина и II - Н3-триптофана при раздражении коры червя мозжечка; III - включение С14-метионина и IV - Н3-триптофана при раздражении лобной коры; по оси ординат: включение аминокислот - данные представлены в % по отношению к контролю, который принят за 100%;
# - P<0,05 по сравнению с контрольными значениями (Mann-Whitney тест).
Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011
Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011
Таблица 1
Содержание SH- и SS- групп в образцах ткани мозга (мкмоль/Л гомогената)
Ткань гемисфер Мозжечок
Белковые SH-груnnы SS-группы Небелковые SH-группы Белковые SH-группы SS-группы Небелковые SH-группы
Контроль 35,6 (13,3-60,5) (п= 3) 10,3 (8,9-12,2) (п=3) 0 (п=3) 51,2 (28,0-75,5) (п=4) 38,0 (20,0-57,0)* (п=4) 0 (п=4)
Электро- стимуляция палеоцере- беллума 35,7 (24,1-71,0) (п=6) 15,3 (6,8-35,5) (п=6) 2,3 (0-6,0)# (п=6) 69,4 (56,4-94,4)* (п= 5) 35,18 (26,5- 50,0)* (п=5) 2,1 (0-6,2) (п=5)
Примечание: # - Р<0,05 в сравнении с контролем;
* - Р<0,05 в сравнении с данными исследований ткани гемисфер в той же группе (КгивсаП^аШв тест).
Таблица 2
Содержание фактора некроза опухолей-альфа в образцах ткани мозга
(пг/мг влажной ткани)
Ткань гемисфер Мозжечок
Контроль 34,7 (20,9-55,1) (п=5) 106,7 (61,6-140,8) (п=5) *
Электростимуляция палеоцеребеллума 57,7 (36,0-127,2)* (п=7) 115,6 (71,4-153,7)* (п=4)
Примечание: * - Р<0,05 в сравнении с соответствующим показателем содержания фактора некроза опухолей-альфа в ткани гемисфер головного мозга (КгивсаП^аШв тест).
Для исследования небелковой фракции забирали 200 мкл супернатанта и добавляли 100 мкл 5%-ной метафосфоновой кислоты, после чего осуществляли центрифугирование при 3000 об./мин на протяжении 30 мин. Данные выражали в мкм на литр гомогената.
Для статистической оценки результатов исследований - длительности существования очагов применяли критерий КгивсаП^аШв, для оценки мощности очагов и включения аминокислот - ANOVA+ Ыештап-КеЫэ тест.
Результаты
Уровень тиолов в небелковой фракции ткани гемисфер после ЭС коры мозжечка интактных животных достоверно превышал таковой в группе контроля (Р<0,05). В группе крыс с ЭС в ткани мозжечка регистрировался достоверно более высокий уровень белковых БН-групп в сравнении с аналогичным показателем в ткани гемисфер (в 1,94 раза). При этом следует подчеркнуть, что исходный уровень ББ-белковых групп в ткани мозжечка был достоверно более высоким (в 3,68 раза) в сравнении с таковым в ткани гемисфер (Р<0,05) (табл. 1). В условиях ЭС палеоцеребеллярной коры отмечалась тенденция к увеличению небелковых БН-групп на фоне незначительной тенденции к снижению белковых ББ-групп в ткани мозжечка (табл. 1).
Под влиянием ЭС коры мозжечка не отмечалось изменений уровня фактора некроза опухолей-альфа в исследуемых образцах тканей (табл. 2). Следует отметить, что содержание фактора некроза опухолей-аль-
фа в ткани мозжечка было более высоким, чем в ткани гемисфер головного мозга (Р<0,05) (табл. 2).
ЭС коры мозжечка вызывала возрастание включения С14-метионина в структуры вентрального гиппокампа - на 54,4% больше, чем в группе контроля (Р<0,05) (рисунок). Аналогичная стимуляция мозжечка в условиях внутрижелудочкового введения Н3-триптофана сопровождалась увеличением включения аминокислоты в ткань вентрального гиппокампа (в 3,6 раза), структуры ствола мозга (в 2,2 раза), а также в ткань «остального мозга» (в 2,0 раза) (Р<0,05). При этом в структурах мозжечка отмечалась тенденция к снижению включения данной аминокислоты.
В условиях аналогичной ЭС, проведенной у животных с имплантацией биполярных электродов в лобные отделы коры головного мозга, уровень включения Н3-триптофана имел тенденцию к увеличению в исследуемых образованиях мозга. В частности, в структурах вентрального гиппокампа и ствола мозга отмечалось увеличение включения соответственно на 30,7% и 25,8% (Р>0,05). В подобных условиях ЭС уровень включения метионина, наоборот, имел тенденцию к снижению (рисунок). При этом наибольшее снижение включения аминокислоты имело место в ткани ствола мозга (на 34,2%) (Р>0,05).
Обсуждение
Таким образом, отмеченное в настоящем исследовании возрастание уровня Ад+-чувствительных
БИ-небелковых групп в коре мозга, вызываемое электростимуляцией палеоцеребеллярной коры, может представлять собой механизм антиэпилептической защиты мозга, поскольку данный фактор является существенным в формировании нейродегенерации, вызываемой цитокинами [5, 10]. Ранее сходный эффект активирования антиоксидантных механизмов был установлен при ЭС мозжечка у кошек, у которых было показано увеличение уровня тиоловых соединений в крови [1].
В механизмах реализации эффектов мозжечка на структуры мозга, по-видимому, не принимают участия изменения уровня фактора некроза опухолей- альфа, который не изменялся в условиях раздражения палеоцеребеллума. В то же время весьма вероятна возможность блокирования путей реализации эффектов провоспалительных цитокинов в структурах мозга при активации структур мозжечка, так как электростимуляция ядра шатра сопровождается снижением числа лейкоцитов (вдвое), вовлекаемых в формирование воспалительных изменений, индуцированных внутристриарным применением интерлейкина 1-Р [5]. При этом авторы указывают на значение механизмов продукции оксида азота в развитии данных эффектов. Весьма вероятен сходный механизм и в условиях раздражения палеоцеребеллярной коры, которое антидромно обеспечивает активирование ядра шатра [5].
Проведенные исследования показали, что под влиянием электростимуляции палеоцеребеллярной коры возрастает включение метионина в структуры вентрального гиппокампа, и поэтому можно полагать, что повышение проницаемости гемато-энцефали-ческого барьера для данной аминокислоты обеспечивает повышение синтеза тиоловых групп [2]. Кроме того, отмечается выраженный эффект раздражения мозжечка в отношении триптофана - предшественника серотонина, обусловливающего тормозные сомногенные эффекты. Учитывая антиоксидантные свойства триптофана, а также его метаболитов, в том числе серотонина [1], возможно полагать, что наблюдаемые антиоксидантные эффекты мозжечка также связаны с метаболическими превращениями данной аминокислоты. Кроме того, учитывая противоэпилеп-тические эффекты активации серотонинергической
системы мозга [1], можно полагать, что электростимуляция палеоцеребеллума оказывает противосу-дорожное действие посредством активации данной системы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Годлевский Л. С., Коболев Е. В., Мустяца В. Ф., Дроздова Г. А. Моделирование и механизмы подавления экспериментального эпилептического синдрома. - Одесса, 2010. - 350 с.
2. Кулинский В. И., Колесниченко Л. С. Система глутатиона I. Синтез, транспорт, глутатионтрансферазы, глутатионпероксида-зы // Биомед. химия. - 2009. - Т. 55. № 3. - С. 255-277.
3. Соколовский В. В. Тиосульфидное соотношение крови как показатель состояния специфической резистентности организма. -СПб, 1996. - 33 с.
4. Флеров М. А., Толстухина Т. И., Герасимова И. А. Процессы свободнорадикального окисления липидов в нейронах и нейроглии коры больших полушарий при судорогах // Бюл. экспер. биол. мед. - 2004. - Т. 138. № 10. - С. 385-387.
5. Galea E., Glickstein S. B., Feinstein D. L., Golanov E. V., Reis D. J. Stimulation of cerebellar fastigial nucleus inhibits interleukin-1-beta-induced cerebrovascular inflammation // Am. j. physiol. - 1998. -Vol. 275. № 7. - P. 2053-2063.
6. Godlevsky L. S., van Luijtelaar E. L. J. M., Shandra A. A., Coenen A. M. L. Cause and effect relations in disease; lessons from epileptic syndromes in animals // Medical hypotheses. - 2002. - V. 58. № 3. - P. 237-243.
7. Godlevsky L. S., Shandra A. A., Oleinik A. A., Vastyanov R. S., Kostyushov V. V., Timchishin O. L. TNF-a in cerebral cortex and cerebellum is affected by amygdalar kindling but not by stimulation of cerebellum // Polish j. of pharmacology. - 2002. - Vol. 54. № 5. -P. 655-660.
8. Herraiz T., Galisteo J. Endogenous and dietary indoles: a class of antioxidants and radical scavengers in the ABTS assay // Free radic. res. - 2004. - Vol. 38. № 3. - P. 323-331.
9. Shandra A. A., Godlevsky L. S., Vastyanov R. S., Oleynik A. A., Konovalenko V. L., Rapoport E. N., Korobka N. N. The role of TNF-a in amygdala kindled rats // Neuroscience research. - 2002. - Vol. 42. № 2. - Р. 147-153.
10. Takagi Y., Mitsui A., Nishiyama A., Nozaki K., Sono H., Gon Y., Hashimoto N., Yodoi J. Overexpression of thioredoxin in transgenic mice attenuates focal ischemic brain damage // Proc. natl. acad. sci. USA. - 1999. - Vol. 96. № 7. - P. 4131-4136.
Поступила 28.08.2010
Г. В. ДОЛЖЕНКОВА1, В. И. ЯКУШЕВ1, M. В. ПОКРОВСКИЙ1, Г. Г. ПОКРОВСКАЯ1, Е. А. БЕСХМЕЛЬНИЦЫНА1, А. А. АРУСГАМОВА3, А. С. БЕЛОУС1, О. С. ГУДЫРЕВ2, Е. Б. АРГЮШКОВА2
ДОЗОЗАВИСИМЫЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ, ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТИВНЫЕ И КАРДИОПРОТЕКТИВНЫЕ ЭФФЕКТЫ СИМВАСТАТИНА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
кафедра фармакологии;
2НИИ экологической медицины ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»,
Россия, 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3;
3кафедра фармацевтической химии и фармакогнозии ГОУ ВПО «Белгородский государственный университет Федерального агентства образования», Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85. E-mail: vladi-yakus@yandex.ru
Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011 УДК 615.224+615.213
