CC BY
167
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Кресюн Н.В., 2013
УДК: 663.2: 617.735: 616.831.711
АКТИВНОСТЬ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ В СЕТЧАТОЙ ОБОЛОЧКЕ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ И ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ СТАРОЙ КОРЫ МОЗЖЕЧКА
Н.В. КРЕСЮН
Одесский национальный медицинский университет, Одесса, Украина
GLUTATHIONEPEROXIDASE ANDGLUTATHIONEREDUCTASE ACTIVITY IN RETINA UNDER CONDITIONS OF EXPERIMENTAL DIABETES AND PALEOCEREBELLAR ELECTRICAL STIMULATION
N. V. KRESYUN
Odessa National Medical University, Odessa, Ukraine
У крыс линии Вистар в/бр применением стрептозотоцина (50,0 мг/кг) моделировали сахарный диабет. Через 1,5 месяца с момента применения стрепотозотоцина активность глутатионпероксидазыуменшилась на 42,0% и глутатионредуктазы — на 33,0% в сравнении с соответствующими показателями у интактных крыс. Электрические стимуляции (ЭС) (100 Гц) палео-церебеллярной коры мозжечка (V-VII дольки), осуществляемые в течение месяца трижды в сутки предотвращали эффект снижения активности анти-оксидантных ферментов у крыс с экспериментальным диабетом.
Ключевые слова: стрептозотоцин, диабетическая ретинопатия, глутати-онпероксидаза, глутатионредуктаза, электрическая стимуляция мозжечка.
The model of sugar diabetes was induced in Wistar rats via i.p. streptozotocin (50,0 mg/kg) administration. In 1,5 months from the moment of streptozotocin the activity ofglutathioneperoxidase was reduced by 42,0% and such one of glutathion-ereductase — by 33,0% when compared with corresponded data in intact rats. Electri-
3І
cal stimulations (ES) (100 Hz) of paleocerebellum (V-VII lobules), which have been delivered during months three times per day effectively prevented the diabetes- induced reduction of activuity of antioxidant enzymes.
Key words: streptozotocin, diabetes retinopathy, glutathioneperoxidase, gluta-thionereductase, electrical stimulation of cerebellum.
Диабетическая ретинопатия (ДР) представляет собой результат комплексного поражения сетчатой оболочки глаза и ее сосудов, что является следствием диабетической капилля-ропатии [3, 4]. Одним из ведущих патогенетических механизмов возникновения и развития ДР является активирование перекисного окисления липидов, появление пероксинитрита, как результата вовлечения эндогенной системы оксида азота в патогенез имеющих место нарушений [3]. Поэтому применение антиоксидантов может представлять собой одно из патогенетически оправданных лечебных мероприятий при сахарном диабете, в том числе направленное против формирования осложнений таких как ДР [3, 4].
Было установлено, что применение электрических стимуляций (ЭС) ядра шатра мозжечка обеспечивает нейропротекторное действие в отношении индуцированных ишемией повреждений сетчатой оболочки у крыс [5]. Причем, одним из возможных ме-
ханизмов формирования подобных корригирующих влияний было анти-оксидантное действие [1].
Поэтому целью настоящего исследования было изучение особенностей активности антиоксидантных ферментов - глутатионпериоксидазы (ГПО) (КФ l.ll.l.9) и глутатионредуктазы (ГР) (КФ l.8.l.7) у крыс в условиях моделирования сахарного диабета применением стрептозотоци-на (СТЗ), а также динамики этих показателей в условиях применения ЭС палеоцеребеллярной коры мозжечка.
Материал и методы
Исследования выполнены в условиях хронического эксперимента на крысах-самцах линии Вистар, которые содержались в стандартных условиях вивария ОНМедУ. Исследования проводили в соответствие с требованиями GLP и комиссии биоэтики ОНМедУ (протокол № 84 от 10 октября 2008 г.). На каждые третьи сутки осуществляли взвешивание животных.
Под кетаминовым наркозом (100,0 мг/кг, в/бр) животным имплантировали биполярные нихромовые электроды (межэлектродное расстояние 0,25-0,3 мм) в дольки V-VII пале-оцеребеллярной коры, которые крепили к поверхности черепа с помощью быстротвердеющей зубоврачебной пластмассы типа «Норакрил». Животных наблюдали, начиная с 710-х суток с момента проведения оперативного вмешательства.
Экспериментальный сахарный диабет вызывали в/бр введением натощак СТЗ в дозе 50,0 мг/кг (“Sigma Aldrich.ru” Москва), который растворяли в буферном натриево-цитратном растворе (рН 4,5).
Через одну и две недели с момента применения СТЗ у животных в венозной крови, которую получали из хвостовой вены, определяли содержание глюкозы, и в дальнейших наблюдениях использовали животных, у которых этот уровень составлял более 300 мг/Л [4]. Определение содержания глюкозы проводили в 9.00, в условиях доступа животных пищи в течение ночного времени. В течение всего наблюдения животным применяли введения инсулина (0-2 ед п/к два - пять раз в неделю) [4].
Животных разделяли на пять групп: 1) контроль - интактные ложно оперированные крысы (11 животных); 2) интактные крысы, которым осуществляли ЭС палеоцеребеллярной коры (12 животных); 3) животные с сахарным диабетом без лечения (11 крыс); 4) крысы с диабетом, которым проводили ежедневные однократные ЭС палеоцеребеллярной коры (10 животных); 5) крысы, которым проводили ежедневные трехкратные ЭС па-леоцеребеллярной коры (10 животных).
На 14-е сутки с момента применения СТЗ и на протяжении последующих четырех недель осуществляли ЭС палеоцеребеллярной коры через предварительно имплантированные электроды. ЭС проводили с помощью прямоугольных импульсов силой тока 80-120 мкА, частотой импульсов 100 Гц, длительностью ЭС 2,5 с. Всего использовали два режима ЭС: однократно ежедневно и трехкратно (9.00; 14.00; 19.00).
По окончании наблюдения осуществляли эвтаназию и у декапитиро-ванных животных удаленные ткани замораживали и хранили в жидком азоте. Выделенные ткани сетчатки промывали фосфатным буферным
раствором с целью удаления компонентов крови и гомогенизировали в0,1 М фосфатного буфера (рН 7,0) из расчета 1:10 (вес/ объем). Гомогенизированные образцы отцентрифугировали в течение 15 мин при 13000 об/мини температуре + 4оС. Активность ГПО (ОБИ/мин/мг белка, нМ) определяли по [2] и ГР (КАОРИ/мин/мг белка, нМ) - по [7]. Концентрацию белка определяли по методу [9].
Результаты исследования обрабатывали статистически с применением метода АКОУАи теста Newman-Кеи1Б.
Результаты и их обсуждение
По окончании эксперимента масса тела крыс группы контроля увеличивалась в сравнении с исходным значеним на 36,2% и составила 297+18,3 г. Увеличение массы тела крыс с ЭС мозжечка составило соответственно 29,3% и 27,0% при однократних ежедневных ЭС в сравнении с показателями, зарегистрированными до начала ЭС (Р<0,05). В то же время, в группе крыс с диабетом без применения ЭС аналогичный показатель составил 10,7% (Р>0,05). Во всех группах животных диабетом содержание глюкозы в крови превышало
соответствующий показатель у интак-тных животных в 3,3-4,4 раза (Р<0,05).
Активность ГПО у интактных животных составила 1,05+ 0,09 нМ, в то время как у крыс с диабетом в отсутствие ЭС мозжечка этот показатель был меньшим на 42,0%(Р<0,05) (рис. 1 ). Под влиянием ЭС мозжечка регистрировалось возрастание активности ГПО, величина которой при однократных и трехкратных ЭС превышала аналогичный показатель у крыс с диабетом в отсутствие ЭС соответственно на 42,6% и на 80,0% (Р<0,05). Причем, в обеих группах исследуемый показатель не имел достоверных отличий в сравнении с показателем в группе интактных животных (Р>0,05).
Активность ГР в ткани сетчатой оболочки крыс с диабетом в отсутствие ЭС мозжечка составила 9,85+ 0,11нМ (рис. 2) и была на 33,0% меньше аналогичного показателя в группе интаткных животных (Р<0,05). Исследуемый показатель в группе крыс с диабетом, которым применяли однократные ЭС мозжечка был на 21,8% большим в сравнении с таковым у крыс с диабетом без ЭС (Р>0,05) и при этом оставался меньшим в сравнении с показателем у интактных крыс на 18,4%(Р>0,05). На
фоне более частых ЭС активность ГР и была на 8,2% меньше, чем у интакт-
возрастала в сравнении с показателем у ных животных (Р>0,05) (рис. 2).
диабетических крыс на 37,0% (Р<0,05)
Рис. 1. Активность глутатинпероксидазы в ткани сетчатой оболочки глаза крыс со стрептозотоцин-индуцированным диабетом в различных условиях лечения
По оси ординат: активность глутатинпероксидазы (ОБИ/мин/мг белка, нМ); по оси абсцисс - I- интактные крысы;11- интактные крысы с ЭС мозжечка ; 111-крысы с экспериментальным диабетом; IV- СТЦ-вызванный диабет+ ЭС палео-церебеллярной коры (один раз в сутки, две недели); V- СТЦ-вызванный диабет+ ЭС палеоцеребеллярной коры (три раза в сутки, две недели)
*-Р<0,05 в сравнении с показателем в группе интактных крыс с ЭС мозжечка; #-Р<0,05 - в сравнении с показателем в группе крыс с экспериментальным диабетом в отсутствие лечения.
Полученные результаты, таким образом, показывают, что у крыс с экспериментальным диабетом, индуцированным применением стрептозо-
тоцина, в ткани сетчатой оболочки глаза наблюдаются выраженные изменения со стороны активности ферментов, обеспечивающих инактивацию
Рис. 2. Активность глутатионредуктазы в тканисетчатойоболочкиглазак-рыссострептозотоцин-индуцированнымдиабетом в различных условиях лечения
По оси ординат: активность глутатионредуктазы (КАОРН/мин/мг белка, нМ); по оси абсцисс - те же обозначения, что на рисунке 1.
*-Р<0,05 в сравнении с показателем в группе интактных крыс с ЭС мозжечка; #-Р<0,05 - в сравнении с показателем в группе крыс с экспериментальным диабетом в отсутствие лечения.
активных форм кислорода по зависимому от синтеза глутатиона пути. Так, у животных через полтора месяца с момента применения стрептозотоцина регистровались снижение активности глутатионпероксидазы, которая
уменьшалась в сравнении с таковой у интактных животных - на 42,0% и глутатионредуктазы - на 33,0%. Подобный результат соответствует данным [3], которые также показали роль
недостаточности антиоксидантной ферментативной активности в патогенезе диабетической ретинопатии.
В нашем исследовании установлена протекторное влияние ЭС палео-церебеллярной коры в отношении диа-бет-вызванных нарушений активности ГПО и ГР, отмечаемых в тканях сетчатой оболочки. Причем, выраженность эффекта зависела от частоты ежедневных ЭС и при трехкратном воздей-
ствии на палеоцеребеллум отмечался протективный эффект в отношении диабет-провоцированным ферментативных нарушений. По- видимому, в ткани сетчатой оболочки под влиянием ЭС мозжечка происходит усиление процесса восстановления тиоловых групп, в том числе и синтеза глутатио-на, что было ранее отмечено в ткани головного мозга животных при ЭС старой коры мозжечка [1]. Возможно также, что положительные эффекты ЭС являются в значительной степени вторичными, обусловленнными снижением продукции провоспалитель-ных цитокинов, в частности, фактора-некроза опухолей альфа вызываемого ЭС палеоцеребеллума [1].
Указанные эффекты ЭС мозжечка отмечались в условиях гипергликемии, а также сопровождались более значительным увеличением массы тела животных в сравнении с таковым у крыс с диабетом в отсутствие ЭС. Следует подчеркнуть, что основныммеханизмом снижения массы тела у диабетических животных может быть повышенное образование мочевины, выраженная дегидратация и потеря электролитов на фоне высокого диуреза [3, 4]. В результате дегидратации тканей происходит липолиз и высвобождение высших жирных кис-
лот из депо липидов с последующим образованием кетоновых тел (ацетоацетат и бета-оксибутират), которые в свою очередь усиливают диурез, обеспечивая развитие патогенеза по типу порочного круга [4]. Рассматривая положительное влияние ЭС мозжечка на массу тела животного, следует отметить, что рецепторы лептина, обеспечивающего эффект насыщения, наиболее плотно расположены в тканях мозжечка [6, 8], что позволяет предполагать возможную роль структур мозжечка в регуляции пищевого поведения [6]. Причем, эффекты ЭС мозжечка не связаны с изменением уровня глюкозы крови и скорее могут объясняться ослаблением кетогенеза, так как установлена взаимосвязь выраженности противоэпилептических эффектов ЭС мозжечка и применения кетогенной диеты [1].
Выводы
1. Развитие ретинопатии при стрептозотоцин-индуцированном сахарном диабете у крыс сопровождается снижением активности глутати-онпероксидазы и глутатионредуктазы в сетчатой оболочке глаза.
2. Периодические электростимуляции (100 Гц) палеоцеребелляр-ной коры предотвращают диабет-
провоцированное снижение активности антиоксидантных ферментов в сетчатой оболочке.
Литература
1. Кресюн Н.В. Патофизиологические механізмі формирования диабетической ретинопатии и обоснование подходов к ее терапии / Н.В. Кре-сюн // Интегративная антропология. - 2013. - №1(21). - С. 43-48.
2. Моин В.М. Простой и специфический метод определения активности глyтатионпероксидазы в эритроцитах / В.М. Моин // Лаб. дело - 198б.
-Т.12.-С. 124-12б.
3. Полифенолы виноградных вин пре-дyпреждают накопление нитротирозина и активациюparp-1 в сетчатке глаза крыс со стрептозотоцин-индyцированным сахарным диабетом / В.Р. Дрель [и др.] // Мед. химия. - 2010. - Т. 1(42). - С. 2-33.
4. Al-Malki A.L. Oat attenuation of hyperglycemia-induced retinal oxidative stress and NF-kkB activation in strep-tozotocin-induced diabetic rats/ A.L. Al-Malki // Hindawi Publishing Cor-
poration. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. -2013 - http://dx.doi.org/10.1155/
2013/983923.
5. Ding A.D. Protective effect of electrical stimulating cerebellar fastigial nucleus on ischemia and reperfusion-injury of rat retina / A.D. Ding, H. Zhang, J.M. Wang // Zhonghua Yan KeZaZhi. -2004. - Vol.40, №6. - P. 400-403.
6. Effects of leptin deficiency and replacement on cerebellar response to food-related cues / S.M. Berman et al. // Cerebellum. - 2013. - Vol. 12, №1. - P. 59-67.
7. Goldberg D.M. Methods of Enzymatic Analysis // Weinheim: Verlag Chemie-1983. -Vol. 5(3).-P. 258-265.
8. Oldreive C.E. Neurotrophic effects of leptin on cerebellar Purkinje but not granule neurons in vitro / C.E. Oldreive, J. Harvey, G.H. Doherty // Neurosci. Lett. -2008. - Vol. 438(1)-P. 17-21.
9. Protein measurement with the fo-linphenol reagent / O.N. Lowry, N.J. Rosenbrough, A.L. Tarr, R.J. Randall // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193, №1. -P. 265-275.
Кресюн Наталья Валентиновна - канд. мед. наук, доцент кафедры офтальмологии. Одесский национальный медицинский университет, Одесса, Украина.
Тел.: +38048-7178916.
Факс: +38048-7232215.
E-mail: [email protected].
