CC BY
32
УДК 617.735:616.379-008.64-092.4:615.361.013.85.014.41
ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ СЕТЧАТКИ КРЫС ПРИ СТРЕПТОЗОТОЦИНОВОМ ДИАБЕТЕ 2 ТИПА ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
ПЛАЦЕНТЫ
В эксперименте на модели стрептозотоцининдуцированного сахарного диабета 2 типа изучена морфология сетчатки после использования криоконсервированных мезенхимальных стволовых клеток плаценты. Доказана тереапевтическая эффективность препарата криоконсервированных мезенхимальных стволовых клеток плаценты, которая выражалась снижением отека и уменьшением деструктивных и апоптических проявлений в сетчатке.
Ключевые слова: стрептозотоциновый сахарный диабет, сетчатка, криоконсервированные мезенхимальные стволовые клетки.
Лидирующее место среди заболеваний глаз приводящих к слепоте занимает диабетическая ретинопатия(ДР). Диабетическая ретинопатия развивается у 97% больных с инсулинзависимым сахарным диабетом и у 60% - с инсулиннезависимым сахарным диабетом [5]. Изучение этиопатогенеза, а также разработка методов лечения ДР является одной из актуальных проблем современной офтальмологии. В пследнее десятилетие интенсивно развивается новое направление медицины- клеточная и тканевая терапия, суть которой заключается в использовании криоконсервированных клеток и тканей эмбриофетоплацентарного комплекса с целью активации компенсаторных ресурсов поврежденных тканей в организме реципиента, а также стимуляции механизмов регенерации, замещения клеточных и тканевых структур при дальнейшем восстановлении функции организма [1].
Целью работы было изучение патоморфологических изменений в сетчатке крыс со стрептозотоциновым сахарным диабетом 2 типа после интравитреального и внутривенного введения криоконсервированных мезенхимальных стволовых клеток плаценты (кМСКП).
Материал и методы исследования. Исследования проводили на модели СД 2 типа на половозрелых самцах лабораторных крыс линии Вистар исходной массой 130-160г. Крыс содержали в стандартных условиях вивария при 12-часовом дневном освещении, температуре воздуха 20-25 оС, влажности воздуха - 50-55%. Инсулинорезистентность моделировали у крыс в течение десяти недель с помощью высокалорийной (высокожировой и высокоуглеводной) диеты, которая состояла из 15% жира, 25% сахарозы, 1% желчных кислот та 59,0 % стандартного питания, рекомендованного для данного вида животных. Интактные животные в течение десяти недель получали стандартную диету вивария.
Через четыре недели после начала эксперимента крысам, получавшим высококалорийную диету, внутрибрюшинно вводили цитратный раствор стрептозотоцина в дозе 25 мг/кг массы тела один раз в неделю в течение двух недель. Контрольные животные по аналогичной схеме получали внутрибрюшинно цитратный буфер [6]. Таким образом, данная модель позволяет воспроизвести два ключевых патогенетических механизма, наблюдаемые у больных сахарным диабетом 2 типа, а именно - нарушение секреции и действия инсулина.
Через семь дней после последней инъекции стрептозотоцина всех экспериментальных животных разделили на группы: интактный контроль (Н+кМСКП), крысы с диабетом, получавшие кМСКП (Д+кМСКП) и крысы с диабетом получавшие плацебо (Д+плацебо). кМСКП вводили внутривенно в концентрации 1,1х106 и интравитреально (для последующего изучения ретинопатии) в концентрации 0,1х106 контрольным животным и крысам с СД 2 типа, индуцированным высокалорыйной диетой и стрептозотоцином. Крысы группы Д+плацебо получали плацебо соответствующего объема по аналогичной схеме.
Фоторегистрацию проводили цифровой камерой Sigeta Ucmos 3100. Морфометрию проводили при помощи программы Toup Tek View 3.7.939. Статистическую обработку полученных данных выполняли при помощи программы Statgraph 2.0,используя непараметрический критерий Уитни-Манна.
Результаты исследования и их обсуждение. Сетчатка крыс в норме представлена десятью четко выраженными слоями, которые имеют разную толщину в центральном и периферическом ее участках.
Следует отметить неравномерность толщины ее наружного ядерного слоя у контрольных и у больных диабетом крыс, что придает ему некоторую волнистость именно с наружной стороны, т.е. обращенной к фоторецепторам, что хорошо заметно на рис 1. В слое ганглиозных нервных клеток обращает на себя внимание как наличие клеток разного размера, так и неодинаковая плотность их расположения в различных участках сетчатки. Эти признки характерны для нормальной сетчатой оболочки крысы полностью сохраняются и при СД 2 типа.
Патологические изменения в морфолгических структурах сетчатой оболочки могут быть учтены либо путем морфометрических подсчетов клеточных элнментов и иных структур, либо после использования дугих специальных методик, скажем, идентификации апоптозирующихся клеток. Такие исследования в последнем десятилетии были проведены несколькими группами зарубежных авторов, которые сообщили о возрастании количества апоптозирующися нейронов и нейроглиальных клеток, утрате части ганглиозных нейронов, шестнадцатипроцентном истончении внутреннего сетчатого слоя в сетчатке крыс, полуавших стрептозотоцин [2, 3, 4]. После воспроизведения стрептозотоцинового диабета у таких животных имеет место и некоторое истончение наружного ядерного слоя этой оболочки опять же вследствие апоптозирования его клеток [7].
В контрольной группе крыс и группе Н+кМСКП сетчатка глаз не изменена, обычного строения и толщины. В ганглиозном слое содержащем ганглиозные нервные клетки ядра с умеренным количеством гетерохроматина. Биполярные клетки и клетки Мюллера внутреннего ядерного слоя с ядрами умеренной оптической плотности (|зис_2).
Рис.1. Нормальное строение сетчатки крыс Вистар. (х400, окраска гемотоксилин -эозином).
Рис 2. Сетчатка глаза самца крысы группы Н+кМСКП. (х400, окр. гемотоксилин -эозином).
В группе Д+кМСКП в сетчатках крыс наблюдается отек внутреннего сплетениевидного слоя (рис.4), о чем может свидетельствовать незначительное увеличение его толщины (рис 3).
Одной из причин отека сплетениевидного слоя может быть уменьшение насыщенности клеток сетчатки кислородом. Подтверждением нарушения снабжения сетчатки кислородом являются данные морфометрии показывающие значительное меньшее количество капилляров заполненных эритроцитами в группе Д+кМСКП. Незначительное утолщение внешнего (наружного) ядерного слоя с сегментами фоторецепторов может быть связано с пролиферацией рецепторных клеток, возможно вызванной стволовыми клетками, введенными в полость глаза.
Рис. 4. Сетчатка глаза самца крысы группы Д+кМСКП. (х400, окраска гемотоксилин -эозином).
Рис. 6 Сетчатка глаза самца крысы группы Д+плацебо. (х400, окраска гемотоксилин -эозином).
Толщина сетчатки в этой группе меньше, чем в группе Н+кМСКП (рис. 5).
0,05 п
0,045 -
0,04 -
0,035 -
0,03 -
0,025 -
0,02 -
0,015 -
0,01 -0,005 0
0,105 п
0,1 -
0,095 -
0,09 -
0,085 -0,08
□ Д+кМСКП ■ Д+плацебо □ Н+кМСКП
Рис. 3. Толщина слоёв внутреннего сплетенеевидного и внешнего ядерного с сегментами фоторецепторов.
Рис.5. Толщина сетчатки.
Одной из причин незначительного уменьшения толщины сетчатки в группе Д+кМСКП возможно связана с атрофией внутреннего ядерного слоя (рис.4), что может быть вызвано недостатком трофики сетчатки. Также, при стрептозотоциновом диабете в ганглиозных нервных клетках, в клетках внутреннего (биполярные клетки и клетки Мюллера) и наружного ядерного (палочки и колбочки) слоев усиливается гетерохроматизация ядер, что свидетельствует о конденсации хроматина, что является предвестником и ранним проявленим апоптоза.
Таким образом, в группе Д+кМСКП развивается отек внутреннего сплетениевидного слоя, атрофия внутреннего ядерного слоя, что вызвано стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом. При введении кМСКП наблюдается утолщение внешнего (наружного) ядерного слоя с сегментами фоторецепторов возможно обусловлено стимулирующим пролиферацию воздействием стволовых клеток.
Для уточнения влияния трансплантации клеток на восстановление повреждений сетчатки, вызванных стрептозотоцин индуцированным диабетом, необходимо провести дополнительное гистологическое исследования на животных, которым не проводилось лечение (Д+плацебо).
В группе Д+ плацебо гистологическая оценка показывает явления отека во внутреннем сплетенеевидном слое (рис. 6), хотя его толщина меньше чем в первых двух группах (рис. 3), а также увеличение толщины внешнего ядерного слоя с сегментами фоторецепторов (рис. 3)(рис. 5). При этом толщина сетчатки данного образца значительно меньше (рис. 5). Также отмечена умеренная гетерохромность ядер ганглиозных нервных клеток, клеток внутреннего (биполярные клетки и клетки Мюллера) и наружного ядерного (палочек и колбочек) слоев. Кроме того, данные морфометрии свидетельствуют о меньшем количестве капилляров содержащих эритроциты в сравнении с группой Д+кМСКП.
Межклеточное пространство внутреннего и внешнего ядерних слоёв иногда незначительно расширено, наблюдается плазморагия и геморагия в капиллярах внутреннего ядерного и внутреннего сплетениевидного слоев (рис.6).
В группе крыс с сахарным диабетом наблюдается истончение сетчатки. После лечения СД 2 типа с помощью кМСКП наблюдается утолщение сетчатки.
В группе крыс, страдающих СД, наблюдается резкое снижение количества ганглиозных клеток, а после интравитреального введения кМСКП наблюдается увеличение количества гаглиозных клеток по сравнению с группой крыс больных СД, что свидетельствует о нейропротекторном действии на сетчатку.
1. Морфологическими признаками ранней нейродегенерации сетчатки при ДР являются: снижение количества и апоптозирование ганглиозных клеток, истончение внутреннего сетчатого слоя, апоптоз нейронов внутреннего ядерного слоя, истончение сетчатки в целом, усиление гетерохроматизации ядер, конденсация хроматина.
2. Внутривенное и интравитреальное введение кМСКП позволяет нормализовать морфологическую структуру сетчатой оболочки крыс со стрептозотоциновым СД 2 типа.
Перспективы дальнейших исследований. Экспериментальное обоснование применения кМСКП в лечении стрептозотоцинового диабета 2 типа открывает перспективное направление в клиническом использовании кМСКП
при ДР.
1. TpH^eHKO B. I. KmraHHa i TKaHHHHa Tepania: cynacHe i Manöyrae / B. I. rpu^eHKO // TpaHcnnaHTOnorifl.- 2000.-T. 1, №1.-C.15-17.
2. Aizu Y. Degeneration of retinal neuronal processes and pigment epithelium in the early stage of the streptozotocine-diabetic rats / Y. Aizu, K. Oyanagi, J. Hu [et al.] // Neuropathology.-2002.-Vol.22-P.161-170.
3. Barber A. J. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes / A. J. Barber, E. Leith, S. A. Khin [et al.] // J.Chin. Invest.-1998.-Vol.102, №4.-P.783-791.
4. Barber A. J. Ins 2 Akita mouse as a model of ewly retinal complicatins in diabetes / A. J. Barber, D. A. Antonetti, T. S. Kern [et al.] // Invest Ophthalmol. Vis. Sci..- 2005-Vol.46.- P.2210-2218.
5. Gogina I. Changes of Microcirculation and Energy Metabolism in Diabetic Angiopathy / I. Gogina, E. Pleshanov, V. Covalyshyn [et al.] // Acta Medica Austriaca. - 1992. - № 19. -90 p.
6. IDF Diabetes Atlas / International Diabetes Federation.-6th, ed.- Brussels, Belgium - 2013.- 160 p.
7. Park S. H. Apoptotic death of photoreceptors in the streptozotocin-indued diabetic rat retina / S. H. Park, J. W. Park, S. J. Park [et al.] // Diabetologia.-2003.- Vol.46.- P.1260-1268.
ПАТОМОРФОЛОГ1ЧН1 ЗМ1НИ С1ТК1ВКИ ЩУР1В ПРИ СТРЕПТОЗОТОЦИНОВОМУ Д1АБЕТ1 2 ТИПУ П1СЛЯ ВВЕДЕНИЯ КР1ОКОНСЕРВОВАНИХ МЕЗЕНХ1МАЛЬНИХ СТОВБУРОВИХ КЛ1ТИН ПЛАЦЕИТИ Дьомш Ю.А., Дьомша М. Ю.
В експеримент на моделi стрептозотоцин шдукований цукрового дiабету 2 типу вивчена морфолопя Ытювки тсля використання крюконсервованих мезешмальних стовбурових клтн плаценти. Доведена тереапевическая ефектившсть препарату крюконсервованих мезенхiмальних стовбурових кйтин плаценти, яка виражалася зниженням набряку i зменшенням деструктивних i апоптичних проявiв в Ытювщ.
Ключовi слова: стрептозотоцинового цукровий дiабет, сiткiвка, крюконсервоваш мезенхiмальнi стовбуровi клiтини.
Стаття надшшла 2.09.2015 р.
PATOMORFOLOGICAL CHANGES OF RAT'S RETINA IN TYPE 2 STREPTOZOTOCIN DIABETI AFTER INTRODUCTION OF CRYOPRESERVED MESENCYYMAL STEM CELLS OF PLACENTA Domin Yu. А., Domina M. Yu.
In the experiment on the model of streptozotocin-induced type 2 diabetes studied the morphology of the retina after the use of cryopreserved mesenchymal stem cells of the placenta. Tereapevticheskaya prove the efficacy of cryopreserved placental mesenchymal stem cells, which expressed decrease swelling and decrease of apoptotic and destructive manifestations in the retina.
Key words: streptozotocin diabetes, the retina, cryopreserved mesenchymal stem cells.
Рецензент Шеттько B.I.
УДК 611.42-018-018.1:615.218.1
Г1СТО- ТА ЦИТОАРХ1ТЕКТОИ1КА СЕЛЕЗ1НКИ ПРИ ЗАСТОСУВАНН1 АИТИГ1СТАМ1ИИИХ ПРЕПАРАТ1В
Метою роботи було вивчити у експеримент стан мкроструктури селезшки на тлi застосування антигiстамiнного препарату Лоратадину. Встановлено, що 10-ти та 30-ти денне його пероральне введення бшим щурам веде до порушення псто- та цитоархiтектонiки селезiнки. Спочатку отримаш змiни проявлялися декомплексацieю компонента червоно! пульпи у виглядi розширення та повнокрiв'я венозних синусiв, наростання вмюту еритроцитiв у ретикулярнiй стром^ На 30-й день дослiду поруч з попередшми з'являлися змiни у бшй пульпi. Вони супроводжувалися збшьшенням вмiсту локальних та дифузних скупчень лiмфоIдних елементiв, появою поодиноких фолiкулiв з добре помiтними гермiнативними центрами. Проте, ознак глибоко! деструкцiI помiчено не було. Отже, отриманi змши не дають пiдстав стверджувати про розвиток суттевих зрушень у структурно-функцюнальному станi селезiнки у вказанi термши.
Ключовi слова: селезiнка щура, бша пульпа, червона пульпа, Лоратадин.
Робота е фрагментом НДР "Лектино- та iмуногiстохiмiчний аналiз вуглеводних детермтант нормальних та патологiчно змiнених клтин i тканин", № 0113и000207.
На сьогодшшнш день вщомо, що ксенобютики, до яких вщносять { х1м1опрепарати володдать поруч 1з терапевтичним ефектом багатовекторним впливом на структурно-функц1ональннй стан багатьох оргашв та !х систем. При цьому цей вплив вщчувають { органи ¡мунного захисту, що проявляеться зм1нами 1мунолог1чно! реактивност1 оргашзму [5].
Сучасний фармацевтичний ринок нал1чуе понад 55 тис. сполук-л1к1в яю за певних умов можуть бути небезпечними для людини [8]. Останшми роками почаст1шали випадки медикаментозних отруень р1зними препаратами, серед яких ф1гурують { антиг1стам1нн1. Одн1ею 1з причин цого е "популяршсть" таких препарата при самолшуванш р1зного роду алергш, "застудних" захворювань [2]. Останн1м часом антипстамшш препарати у комплекс з центральними хол1ноблокаторами та етанолом використовують також соц1ально-дезадаптован1
